骨髓间充质干细胞外泌体减轻海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1749

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (21): 3316-3322.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1749

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骨髓间充质干细胞外泌体减轻海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤

时将，高诗仑，刘金铎，谷天祥，师恩祎

中国医科大学附属第一医院心脏外科，辽宁省沈阳市 110000

修回日期:2019-02-11 出版日期:2019-07-28 发布日期:2019-07-28
通讯作者: 师恩祎，博士生导师，教授，主任医师，中国医科大学附属第一医院心脏外科，辽宁省沈阳市 110000
作者简介:时将，男，1992年生，安徽省枞阳县人，硕士，主要从事间充质干细胞外泌体对深低温体循环脑损伤作用的研究。
基金资助:
2016年国家自然科学基金项目(81471267)，项目负责人：师恩祎

Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes alleviate oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury in hippocampal neurons

Shi Jiang, Gao Shilun, Liu Jinduo, Gu Tianxiang, Shi Enyi

Department of Cardiac Surgery, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110000, Liaoning Province, China

Revised:2019-02-11 Online:2019-07-28 Published:2019-07-28
Contact: Shi Enyi, Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Department of Cardiac Surgery, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110000, Liaoning Province, China
About author:Shi Jiang, Master, Department of Cardiac Surgery, First Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110000, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81471267 (to SEY)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
骨髓间充质干细胞外泌体：由骨髓间充质干细胞分泌的内含蛋白质、细胞因子和RNA等遗传物质的囊泡，在细胞信息传递中起重要作用。骨髓间充质干细胞外泌体能够促进神经突起重塑、神经细胞再生及抑制炎症反应。
氧糖剥夺再灌注：是构建体外细胞实验缺氧再灌注损伤的基础模型，用于模拟各功能脏器中特定细胞在缺血再灌注过程的损伤情况。

摘要
背景：深低温停循环术后中枢神经系统并发症已经日益成为人们注意的焦点，其核心机制仍是全脑缺血再灌注损伤。
目的：探讨骨髓间充质干细胞外泌体对海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护性作用及其机制。
方法：将培养至第7天的海马神经细胞随机分为正常对照组、氧糖剥夺再灌注损伤组及骨髓间充质干细胞外泌体组，后2组进行2 h氧糖剥夺再灌注损伤。造模后，3组海马神经细胞均更换为神经细胞培养基，骨髓间充质干细胞外泌体组加入骨髓间充质干细胞外泌体，正常对照组和氧糖剥夺再灌注损伤组加入等量的PBS溶液。继续培养24 h收集细胞进行Western blot检测，培养48 h进行免疫荧光染色统计海马神经细胞存活率和突起生长情况。
结果与结论：①与正常对照组比较，氧糖剥夺再灌注损伤组海马神经细胞存活率明显降低，突起长度及分支数明显受损，促炎因子表达水平显著上升；②与氧糖剥夺再灌注损伤组比较，骨髓间充质干细胞外泌体组神经细胞存活率和突起长度及分支数显著增加，肝细胞生长因子和脑源性神经营养因子表达水平显著增加，促炎症因子表达水平显著下降；③结果提示，骨髓间充质干细胞外泌体能减轻海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤，其机制可能与抑制促炎因子分泌和促进肝细胞生长因子、脑源性神经营养因子表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8184-8326(时将)

关键词: 骨髓间充质干细胞, 外泌体, 海马神经细胞, 氧糖剥夺再灌注损伤, 深低温停循环, 肝细胞生长因子, 脑源性神经营养因子, 环氧化酶2, 诱导型一氧化氮合酶, 肿瘤坏死因子α, 促炎症因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Increasing attentions have been focused on postoperative neurological complications after deep hypothermic circulatory arrest. The core mechanism of neurological complications is global ischemia-reperfusion injury.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect and mechanism of bone mesenchymal stem cell exosomes on oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury in hippocampal neurons.
METHODS: Primary cultured fetal rat hippocampal neurons (7 days) were divided into control group, oxygen-glucose deprivation/reperfusion group (OGD/R group) and oxygen-glucose deprivation/reperfusion with adding mesenchymal stem cell exosomes (exosomes group). After 2 hours of oxygen-glucose deprivation/reperfusion, the hippocampal neurons in the latter two groups were cultured under normal conditions. After modeling, hippocampal neurons in all the three groups were cultured in nerve cell culture medium, followed by addition of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes in the exosomes group, and addition of PBS in the other two groups. After 24 hours of continuous culture, western blot assay was used; after 48 hours of culture, the survival rate and the growth of neurites in hippocampal neurons were counted and observed by immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the survival rate of hippocampal neurons in the OGD/R group was significantly reduced, the length of neurites and the number of branches were significantly impaired, and the expression level of pro-inflammatory factors was significantly increased. Compared with the OGD/R group, the survival rate of hippocampal neurons, the length of neuritis, and the number of branches in the exosomes group were significantly increased in the exosomes group, the expression levels of hepatocyte growth factor and brain-derived neurotrophic factor significantly increased, and the expression of pro-inflammatory factors obviously decreased. The results suggest that exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells can alleviate oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury in hippocampal neurons. The mechanism may be related to inhibiting secretion of pro-inflammatory factors secretion and promoting expression of hepatocyte growth factor and brain-derived neurotrophic factor.

Key words: bone marrow mesenchymal stem cells, exosomes, hippocampal neurons, oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury, deep hypothermic circulatory arrest, hepatocyte growth factor, brain-derived neurotrophic factor, cyclooxygenase 2, inducible nitric oxide synthase, tumor necrosis factor alpha, pro-inflammatory factor, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

时将，高诗仑，刘金铎，谷天祥，师恩祎. 骨髓间充质干细胞外泌体减轻海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3316-3322.

Shi Jiang, Gao Shilun, Liu Jinduo, Gu Tianxiang, Shi Enyi. Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes alleviate oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury in hippocampal neurons[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(21): 3316-3322.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞外泌体形态及特点 倒置显微镜下可见SD大鼠骨髓间充质干细胞贴壁生长，长梭形，见图2A。通过超高速离心法从骨髓间充质干细胞条件培养基中提取外泌体。在透射电镜下观察，其外泌体为圆形或茶托样膜性囊泡，直径为30-100 nm，见图2B。Western blot显示骨髓间充质干细胞外泌体蛋白标志物Alix、TSG101和CD63表达阳性，见图2C。ZateView检测外泌体的粒径峰值为75 nm，粒子浓度为6.7×10¹²L^-1，见图2D。

2.2 骨髓间充质干细胞外泌体增加氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经细胞的存活率，促进海马神经细胞突起再生 免疫荧光染色用于观察海马神经细胞突起生长情况，与正常对照组海马神经细胞突起长度(275.27±19.87) μm和分支数(17.89±2.67)比较，氧糖剥夺再灌注损伤组明显降低海马神经细胞突起长度(65.14±18.14) μm和分支数(5.00±1.87) (P < 0.001)；与氧糖剥夺再灌注损伤组比较，骨髓间充质干细胞外泌体组增加突起长度(162.22±13.43) μm及分支数(15.22±1.39)(P < 0.001)，见图3。海马神经细胞存活率通过神经细胞计数评估，氧糖剥夺再灌注损伤组显著降低神经细胞存活率(46.07±3.78)%(相对于正常对照组，P < 0.001)，见图3。与氧糖剥夺再灌注损伤组比较，骨髓间充质干细胞外泌体组显著提高神经细胞生存率(74.14±4.20)%(P < 0.001)。

2.3 骨髓间充质干细胞外泌体增加氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经细胞内的神经营养因子表达水平 为了进一步探究骨髓间充质干细胞外泌体对海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤后的保护作用机制，通过Western blot检测脑源性神经营养因子、肝细胞生长因子表达水平，见图4A。与正常对照组比较，氧糖剥夺再灌注损伤组轻微提升脑源性神经营养因子表达量及下调肝细胞生长因子的表达量，但差异无显著性意义(P > 0.05)。与氧糖剥夺再灌注损伤组比较，骨髓间充质干细胞外泌体组显著增加海马神经细胞内的脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子表达水平(P < 0.01)，见图4B，C。

2.4 骨髓间充质干细胞外泌体抑制氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经细胞的促炎因子表达 炎症反应在海马神经细胞损伤中发挥着重要作用。实验通过Western blot检测促炎因子环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α表达水平，见图5A。与正常对照组比较，氧糖剥夺再灌注损伤组显著提高环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α的表达水平(P < 0.001)。与氧糖剥夺再灌注损伤组比较，骨髓间充质干细胞外泌体组显著抑制环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α的表达(P < 0.001)，见图5B-D。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外研究。

1.2 时间及地点 实验于2017年9月至2018年10月在辽宁省介入与影像研究实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物及细胞 动物实验方案通过中国医科大学动物伦理委员会许可。孕18 d的雌性SD大鼠购于辽宁长生生物技术股份有限公司。SD大鼠骨髓间充质干细胞购于赛业生物技术公司，为第2代细胞。

1.3.2 实验主要试剂 L-多聚赖氨酸、阿糖胞苷、青霉素-链霉素双抗溶液及L-谷氨酰胺(Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶、DMEM/F12、D-Hank’s液、Neuralbasal 培养基、无糖Neuralbasal培养基及B27(Gibco公司)；MAP-2抗体、βⅢ-Tubulin抗体、Alexa488-conjugated山羊抗兔、Alix抗体、TSG 101抗体、CD63抗体、脑源性神经营养因子抗体、肝细胞生长因子抗体、Tubulin抗体、环氧合酶2抗体、诱导型一氧化氮合酶抗体及肿瘤坏死因子α抗体(美国Abcam公司)；Western blot二抗HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech公司)；DAPI(美国Abcam公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 SD大鼠海马神经细胞原代培养 孕18 d的雌性SD大鼠用于海马神经细胞原代培养，操作主要根据以往发表文献的方法^[9]。在解剖显微镜下剥离出胎鼠海马组织，放入盛有D-Hank’s液的培养皿中，剔除海马组织上残留的脑膜和血管(操作台置于冰床上)，见图1；海马组织被剪碎移至15 mL离心管中，加入0.25%胰蛋白酶吹打消化，37 ℃水浴箱中静止15 min，取上清加入等体积接种液(87% DMEM/F12、体积分数为10%胎牛血清、2%B27和1%青霉素-链霉素液)中和后，1 000 r/min离心4 min，收集沉淀加入适当的接种液重悬细胞，细胞计数板进行细胞计数。以1×10⁹ L^-1的细胞浓度将细胞接种在0.01 g/L L-多聚赖氨酸包被过的培养皿中，第2天全量更换为神经细胞培养基(97%Neuralbasal培养基、2%B27、1%青霉素-链霉素液和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺)，加入10 μmol/L阿糖胞苷作用24 h后全部换液，以后每隔2 d半量换液1次。海马神经细胞培养至第7天，采用MAP-2细胞免疫荧光染色法进行海马神经细胞鉴定，MAP-2染色主要集中在神经元的树突和胞体，见图1。

1.4.2 骨髓间充质干细胞培养 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养在完全培养基中，主要包括88%的SD大鼠骨髓间充质干细胞基础培养基、10%的SD大鼠骨髓间充质干细胞专用胎牛血清、1%的青霉素-链霉素液和1%的谷氨酰胺。将完全培养基在4 ℃以100 000×g离心过夜，取上清经过0.22 μm滤器过滤，制备成去外泌体培养基。当培养瓶中细胞密度达70%-80%时，更换为去外泌体培养基继续培养48 h，收集培养上清用于提取外泌体。

1.4.3 骨髓间充质干细胞外泌体提取及鉴定 骨髓间充质干细胞外泌体通过超高速离心方式提取，具体步骤参照文献[10]。透射电镜观察外泌体形态，Western blot检测间充质干细胞外泌体蛋白标记物Alix、TSG101和CD63表达，ZateView检测外泌体的浓度及粒径分布。

1.4.4 氧糖剥夺再灌注损伤模型的建立及实验分组 将培养至第7天的海马神经细胞随机分为正常对照组、氧糖剥夺再灌注损伤组及骨髓间充质干细胞外泌体组。正常对照组的海马神经细胞不进行氧糖剥夺再灌注过程，给予神经细胞培养基，在正常条件下(37 ℃、体积分数为5%CO₂)孵育2 h。氧糖剥夺再灌注损伤组和骨髓间充质干细胞外泌体组更换为无糖神经细胞培养基(97%无糖Neuralbasal 培养基、2%B27、1%青霉素-链霉素液和0.5 mmol/L L-谷氨酰胺)，放在无氧培养箱(95% N₂，体积分数为5% CO₂)中孵育2 h。造模后，3组海马神经细胞均更换为神经细胞培养基，并给予不同的干预，正常条件下(37 ℃、体积分数为5%CO₂)继续培养。骨髓间充质干细胞外泌体组，每1 mL培养基加入100 μg骨髓间充质干细胞外泌体，正常对照组和氧糖剥夺再灌注损伤组加入等量的PBS溶液。继续培养24 h收集细胞进行Western blot检测，培养48 h进行免疫荧光染色统计海马神经细胞存活率和突起生长情况。以上实验重复6次。

1.4.5 免疫荧光及细胞计数 海马神经细胞用40 g/L多聚甲醛固定，具体操作方法同参考文献[11]。海马神经细胞突起荧光染色，一抗anti-βⅢ-Tubulin(1∶2 000)，二抗Alexa488-conjugated山羊抗兔(1∶500)，细胞核通过DAPI进行染色。在荧光显微镜下随机选取3个200倍视野进行神经细胞计数，存活的海马神经细胞表现为胞体饱满和突起明显，并与正常对照组进行标准化处理。使用软件Neuron J测量海马神经细胞突起长度及分支数。

1.4.6 Western blot实验 收集海马神经细胞，加入细胞裂解液，提取总蛋白并测定浓度，提取的蛋白与5×SDS上样缓冲液按1∶5稀释比例混匀后，于95 ℃变性5 min。SDS-PAGE凝胶电泳后转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，然后在4 ℃下加入脑源性神经营养因子、肝细胞生长因子、Tubulin、环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶及肿瘤坏死因子α一抗孵育过夜，二抗37 ℃孵育 2 h，洗膜后加ECL显色在凝胶成像仪下进行观察。以Tubulin作为内参计算脑源性神经营养因子、肝细胞生长因子、环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶及肿瘤坏死因子α蛋白的相对表达值。

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞外泌体的形态及鉴定结果；②骨髓间充质干细胞外泌体对海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用；③各组海马神经细胞促炎因子和神经营养因子表达差异。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0统计学软件进行数据处理，所有计量资料结果均以x(_)±s表示。多样本均数间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。神经元计数采用Kruskal-Wallis分析，组间比较采用Mann-Whitney U分析并进行Bonferroni纠正，P < 0.017为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

尽管深低温停循环技术在很大程度降低了手术过程神经细胞的氧耗，但仍会引起全脑缺血再灌注损伤，导致患者术后可能出现意识障碍、谵妄、癫痫和学习认知功能异常等神经并发症^[11]。以间充质干细胞为基础治疗缺血性神经损伤越来越引起广泛研究者兴趣，间充质干细胞及其分泌的外泌体可以通过多种不同的途径发挥保护性作用。该研究利用海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤模型模拟深低温停循环时海马神经细胞的缺血再灌注损伤，发现海马神经细胞经过氧糖剥夺再灌注损伤后，其存活率明显降低，并且幸存的海马神经细胞突起受损明显。给予骨髓间充质干细胞外泌体处理后，能够有效减轻海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤。

SD大鼠骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，具有分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经细胞的潜能^[12-14]。骨髓间充质干细胞能促进脑梗死后神经细胞突起再生及神经功能恢复^[15-16]。然而，近年越来越多研究者证明间充质干细胞主要通过旁分泌途径发挥作用^[17-18]。细胞外囊泡是间充质干细胞发挥旁分泌作用的主要媒介，其中外泌体是细胞外囊泡的重要组成成分。外泌体直径为30-100 nm，一般电镜下观察其形态为圆形或茶托样膜性囊泡，其内容物主要包含蛋白质、脂类和microRNA等遗传物质^[19]。相对于其他细胞来说，骨髓间充质干细胞是产生外泌体最多细胞之一。间充质干细胞外泌体减少缺血性神经损伤作用途径主要包括促进神经重塑再生、促进血管生成和抑制炎症反应^[20-21]。突起重塑是减少脑梗死或创伤性脑病后神经功能缺陷的关键修复过程，然而在成人脑损伤中自发性突起再生能力有限。近来越来越多研究数据证明间充质干细胞外泌体能够通过促进突起重塑，进而促进脑梗死和创伤性脑病后的神经功能恢复^[22]。在大鼠脑梗死模型中，静脉注射骨髓间充质干细胞外泌体能够增加突起密度和促进突起生成，进而促进运动功能恢复。在细胞实验中，已有研究证明骨髓间充质干细胞外泌体具有促进神经突起生长的作用^[23]。然而骨髓间充质干细胞外泌体是否在海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤模型中同样发挥作用及其机制尚不明确，鲜有研究报道。该实验通过原代培养方式提取SD大鼠海马神经细胞进行体外培养并进行氧糖剥夺再灌注损伤处理，给予骨髓间充质干细胞外泌体进行干预，发现骨髓间充质干细胞外泌体能够提高氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经细胞存活率，并促进神经细胞突起重塑(主要包括突起分支增多和突起长度增加)，与既往研究结论相符。该研究发现，骨髓间充质干细胞外泌体能够显著增加氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经细胞内脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子的表达水平，有效抑制促炎因子环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α的表达水平。

肝细胞生长因子是一种多功能生长因子，最初在肝细胞原代培养中被发现，能够促进肝细胞分化为成熟实质肝细胞，其在神经系统中同样表达，对神经组织再生起到重要作用。据报道，肝细胞生长因子能结合由人类原癌基因编码的酪氨酸激酶受体c-Met，并且肝细胞生长因子和c-Met在成人和胎儿中枢神经系统中均有表达^[24]。激活酪氨酸激酶受体后，能够诱导下游信号通道(PI3K/Akt，MAP激酶和信号转录和转录激活因子3途径)激活，引起神经保护和抗凋亡等效应^[25-26]。另外有研究报道在帕金森病模型中，脐带间充质干细胞通过腺病毒过表达肝细胞生长因子，能够增强其促进受损神经细胞的修复能力^[27]。

脑源性神经营养因子(是作用仅次于神经生长因子的第二大神经营养因子)与肝细胞生长因子作用相似，在成人和儿童的大脑中均表达。在神经细胞增殖、再生和分化过程中起到关键作用^[28-29]。脑源性神经营养因子主要与原肌球蛋白相关激酶家族的受体酪氨酸激酶结合，进而激活JAK-STAT3、PI3K/Akt和MAPK/ERK途径。脑源性神经营养因子还能与神经营养因子受体p75结合，激活NF-κB进而诱导神经细胞内促存活和促分化的基因激活^[30-31]。有相关研究报道脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子均能促进突起再生^[32-33]。结合该研究发现骨髓间充质干细胞外泌体能够增加氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经细胞中脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子的表达量，同时增加海马神经细胞存活率及神经突起长度和分支数。以上研究结果与作者的研究结论相符，有理由推测骨髓间充质干细胞外泌体通过上调海马神经细胞内脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子的表达量，进而改善氧糖剥夺再灌注损伤后海马神经细胞存活率和促进神经细胞突起再生。

海马神经细胞经过2 h氧糖剥夺，恢复至正常培养条件继续培养24 h后，其促炎因子环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α的表达水平显著上升。在脑缺血微环境中上升的促炎因子将会损伤脑功能^[34]。该实验主要表现为恢复至正常培养条件继续培养48 h后，海马神经细胞存活率降低及突起受损。间充质干细胞的治疗机制包括通过调控炎性反应基因^[35]，调控神经炎症信号通道，提高脑梗死患者预后^[36]。在脑创伤模型中，静脉注射间充质干细胞外泌体能抑制炎症反应，促进大鼠空间学习能力恢复^[37]。

该实验发现海马神经细胞经过2 h氧糖剥夺后，在培养基中加入100 mg/L骨髓间充质干细胞外泌体，能够有效抑制促炎因子环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α表达。

综上所述，骨髓间充质干细胞外泌体能减少海马神经元氧糖剥夺再灌注损伤，增加神经细胞存活率及促进突起再生，其机制可能与抑制促炎因子环氧化酶2、诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子α表达及上调脑源性神经营养因子和肝细胞生长因子等神经营养因子表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞外泌体减轻海马神经细胞氧糖剥夺再灌注损伤

Bone marrow mesenchymal stem cell exosomes alleviate oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury in hippocampal neurons

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