人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0751

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2098-2103.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0751

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人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化的影响

张凤兰¹，杨璐军^2，3，胡炜彦⁴，周姣月⁵，马生霞⁵，肖志成^1，6

¹昆明医科大学分子临床医学研究院，云南省干细胞和再生医学重点实验室，云南省昆明市 650500；²深圳市宝安区人民医院，广东省深圳市 518101；³南方医科大学珠江医院神经外科，广东省广州市 510282；⁴昆明医科大学药学院，云南省昆明市 650500；⁵昆明医科大学基础医学院，云南省昆明市 650500；⁶澳大利亚莫纳什大学免疫与干细胞研究中心，澳大利亚墨尔本 VIC3010

修回日期:2017-12-22 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 肖志成，博士，教授，昆明医科大学分子临床医学研究院，云南省干细胞和再生医学重点实验室，云南省昆明市 650500；澳大利亚莫纳什大学免疫与干细胞研究中心，澳大利亚墨尔本 VIC3010
作者简介:张凤兰，女，1986年生，山东省菏泽市人，汉族，昆明医科大学在读博士，主要从事神经干细胞和microRNA的研究。
基金资助:
云南省高端人才引进计划(20080A004)；云南省干细胞和再生医学重点实验室(2015DG027)

Effect of ginsenoside Rg3 on mouse neural stem cell differentiation in vitro

Zhang Feng-lan¹, Yang Lu-jun^{2, 3}, Hu Wei-yan⁴, Zhou Jiao-yue⁵, Ma Sheng-xia⁵, Xiao Zhi-cheng^{1, 6}

¹Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Institute of Molecular and Clinical Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; ²Baoan People's Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518101, Guangdong Province, China; ³Neurosurgery Institute, Zhujiang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510282, Guangdong Province, China; ⁴Pharmacy College, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; ⁵Basic Medical College, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; ⁶Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Clayton, Victoria 3010, Australia

Revised:2017-12-22 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Xiao Zhi-cheng, M.D., Professor, Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Institute of Molecular and Clinical Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, Clayton, Victoria 3800, Australia
About author:Zhang Feng-lan, Doctoral candidate, Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Institute of Molecular and Clinical Medicine, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Supported by:
Talent Introduction Program of Yunnan Province, No. 20080A004; Key Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine of Yunnan Province, No. 2015DG027

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
人参皂苷Rg3：是二醇类人参皂苷，属于稀有皂苷，因具有显著的抗肿瘤作用而广受关注，其在神经系统中的研究相对较少。据报道人参皂苷Rg3对H2O2导致的海马神经元损伤具有保护作用，但是Rg3是否影响神经干细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等功能现在还不清楚。
神经干细胞培养条件的优化：在神经干细胞培养过程中，使用神经干细胞特异性生长培养基能较好的去除杂细胞，优化其纯度。需要注意的是，神经干细胞悬浮培养时必须在合适的时间内传代，否则当神经球直径过大时其内部细胞往往会因为吸收不到充足的养分和氧气而死亡。另外，直径过大的神经球在机械分离传代时也较难吹散，为后期传代培养带来不利影响。目前，Nestin和Sox2是最常使用的神经干细胞特异性鉴定抗体，同时用Nestin和Sox2标记单层贴壁培养的神经干细胞，能提高实验结果的准确性和可靠性，而纯度较高的神经干细胞能为后期实验提供更高保障。

摘要
背景：神经干细胞来源非常有限，而且在自然分化过程中绝大多数分化为神经胶质细胞，分化为神经元的比例相对较少，因此采取有效措施诱导其向合适的子细胞方向分化是非常重要的科研课题。以往研究证明人参皂苷类成分，如Rb1和Rg1，对神经干细胞的定向分化有一定影响，但Rg3是否对神经干细胞的分化起作用鲜有报道。
目的：研究人参皂苷Rg3对小鼠神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的影响。
方法：分离孕14 d的C57BL/6小鼠的胎鼠大脑皮质神经干细胞并传代培养，用神经干细胞特异性免疫抗体Nestin和Sox2检测神经干细胞纯度。用分化培养基联合人参皂苷Rg3(空白对照、50 nmol/L和250 nmol/L)诱导神经干细胞分化3 d，然后用神经元特异性免疫抗体Tuj1和星形胶质细胞特异性免疫抗体GFAP检测神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的情况，计算Tuj1⁺/DAPI和GFAP⁺/DAPI的比例；通过实时荧光定量PCR技术检测各组细胞Tuj1和GFAP mRNA的表达水平。

结果与结论：①经细胞免疫荧光实验检测传代培养的小鼠胎鼠细胞几乎全为Nestin和Sox2双阳性细胞，表明成功分离培养出纯度较高的神经干细胞，可以用于后期实验；②诱导分化3 d后，与空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组相比，50 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为神经元具有明显促进作用(P < 0.01)，而空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P > 0.05)；③诱导分化3 d后，与空白对照组相比，50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为星形胶质细胞具有促进作用(P < 0.05)，而50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异不明显(P > 0.05)；④real time PCR结果总体与细胞免疫荧光结果相似；⑤结果表明，人参皂苷Rg3在50 nmol/L浓度时能明显促进神经干细胞向神经元和星形胶质细胞方向分化；但在250 nmol/L浓度时主要促进其向星形胶质细胞方向分化，对神经元分化没有显著影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-0096-9212(张凤兰)

关键词: 人参皂苷Rg3, 神经干细胞, 分化, 神经元, 星形胶质细胞, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Application of neural stem cells (NSCs) is of great current interest in neuroscience, but NSCs origin is very limited. And they always differentiate into a large percentage of glial cells and small percentage of neurons in natural differentiation process, so researchers should take effective measures to promote NSCs differentiation into certain offsprings. Previous studies have shown that ginseng saponin ingredients, such as Rb1 and Rg1, have certain influence on NSCs differentiation, but it is unclear whether Rg3 plays a role on NSCs differentiation.
OBJECTIVE: To preliminarily investigate the effect of ginsenoside Rg3 on mouse NSCs differentiation into neurons and astrocytes in vitro.
METHODS: The fetal cortices of embryonic 14 days (E14) C57BL/6 mice were isolated for culturing primary NSCs. Then passaged NSCs were identified by their purity with NSCs specific antibodies, Nestin and Sox2, by immunofluorescence staining. NSCs were induced for 3 days in the differentiation medium containing ginsenoside Rg3 of different concentrations (blank control, 50 and 250 nmol/L). After that, immunofluorescence staining was used to identify differentiated neurons with neuronal specific antibody, Tuj1, and differentiated astrocytes with astrocyte specific antibody, GFAP. Then, we calculated and statistically analyzed Tuj1⁺/DAPI and GFAP⁺/DAPI percentages in the three different groups. Besides, real-time PCR assay was used to test Tuj1 and GFAP mRNA expression in the three groups after 3 days of differentiation.
RESULTS AND CONCLUSION: Primary and passaged NSCs were successfully cultured and almost of cells were positive for both Nestin and Sox2, so these high-purity NSCs could be used in the following experiments. Immunofluorescence staining and statistical analysis results showed that compared with the blank control and 250 nmol/L groups, 50 nmol/L group had an obviously increased neuronal percentage after 3 days differentiation (P < 0.01), while the blank control and 250 nmol/L groups had no significant difference (P > 0.05); compared with the blank control group, 50 and 250 nmol/L groups had significantly increased astrocyte percentages (P < 0.05), whereas there was no obvious difference between 50 and 250 nmol/L groups (P > 0.05). The results of real-time PCR assay were similar with the above immunofluorescence results. In conclusion, 50 nmol/L ginsenoside Rg3 can enhance mouse NSCs differentiation into neurons and astrocytes, while 250 nmol/L ginsenoside Rg3 can only promote mouse NSCs differentiation into astrocytes.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Cell Differentiation, Neurons, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张凤兰，杨璐军，胡炜彦，周姣月，马生霞，肖志成. 人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2098-2103.

Zhang Feng-lan, Yang Lu-jun, Hu Wei-yan, Zhou Jiao-yue, Ma Sheng-xia, Xiao Zhi-cheng. Effect of ginsenoside Rg3 on mouse neural stem cell differentiation in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2098-2103.

图/表（结果） 1

2.1 小鼠神经干细胞的体外培养和鉴定 从胎鼠大脑皮质组织机械分离的单个神经干细胞，培养两三天后可以形成贴壁生长的小细胞团，继而长成由数十或数百个细胞组成的圆形细胞球，即神经球(图1A)。经过机械分离传代的单个神经干细胞，培养5-7 d后可长成悬浮的圆形神经球，其边缘清晰，折光性较强(图1B)。

使用神经干细胞特异性免疫抗体Nestin和Sox2对第3代单层贴壁培养的神经干细胞进行免疫荧光染色，结果显示：整体染色背景较干净，细胞分布较均匀，未见细胞碎片或团块；Sox2阳性细胞的胞核为圆形或椭圆形，边缘清晰，细胞质不着色(图2A)；Nestin阳性细胞的细胞质为红色荧光，边缘清晰，具有一个或少数细长分支，且胞核不着色(图2B)；DAPI阳性细胞核呈蓝色(图2C)；经合并图像发现，细胞几乎全部为Nestin和Sox2双阳性细胞(图2D)，说明培养的细胞几乎全部为神经干细胞，纯度较高，可用于后期实验。

2.2 人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化为神经元的影响 神经干细胞经诱导分化后，Tuj1免疫荧光染色结果显示：Tuj1阳性神经元呈红色，为细胞质着色，细胞边缘清晰，符合神经元形态；DAPI阳性细胞核呈蓝色，整体染色背景较干净。因分化时间较短，大部分神经元只有少数较短神经突起，见图3A。另外，经观察比较，空白对照组和人参皂苷Rg3组诱导分化出的神经元在形态学方面没有明显差别。

统计分析空白对照组和人参皂苷Rg3组小鼠神经干细胞分化为Tuj1阳性神经元的比例，发现：与空白对照组(12.47±0.43)%和250 nmol/L人参皂苷Rg3组(12.27± 1.26)%相比，50 nmol/L人参皂苷 Rg3组(18.64±0.60)% Tuj1阳性神经元比例最高，且与二者差异有显著性意义(P < 0.01)，但空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3B。

通过real-time PCR实验，统计分析空白对照组和人参皂苷Rg3组小鼠神经干细胞分化3 d后的Tuj1 mRNA表达水平，发现：与空白对照组(设为1)和250 nmol/L人参皂苷Rg3组(1.12±0.03)相比，50 nmol/L人参皂苷Rg3组(1.49±0.07)Tuj1 mRNA的表达水平最高，且与二者差异有显著性意义(P < 0.001)，但空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3C。

上述实验结果表明：与空白对照组相比，50 nmol/L浓度的人参皂苷Rg3能明显促进神经干细胞向神经元方向分化，但250 nmol/L浓度的人参皂苷Rg3则没有明显影响。

2.3 人参皂苷Rg3对小鼠神经干细胞分化为星形胶质细胞的影响 小鼠神经干细胞诱导分化后，GFAP免疫荧光染色结果显示：GFAP阳性星形胶质细胞呈绿色，细胞质着色，细胞边缘清晰，该类细胞具有多个细长、较复杂的树枝状分支，属典型星形胶质细胞形态；DAPI阳性细胞核呈蓝色，见图4A。另外，经观察比较，空白对照组和人参皂苷Rg3组分化出的星形胶质细胞在形态学方面也没有明显差别。

统计分析空白对照组和人参皂苷Rg3组小鼠神经干细胞分化为GFAP阳性星形胶质细胞的比例，发现：与空白对照组(37.64±1.06)%相比，50 nmol/L人参皂苷Rg3组(45.51±1.43)%和250 nmol/L人参皂苷Rg3组(43.69± 0.50)%GFAP阳性星形胶质细胞比例较高，且与空白对照组差异有显著性意义(P < 0.05)，但50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4B。通过real-time PCR实验，统计分析空白对照组和人参皂苷Rg3组小鼠神经干细胞分化3 d后GFAP mRNA的表达水平，发现：与空白对照组(设为1)相比，50 nmol/L人参皂苷Rg3组(1.51±0.06，P < 0.05)和250 nmol/L人参皂苷Rg3组(1.69±0.15，P < 0.01)GFAP mRNA的表达水平较高，且与空白对照组差异有显著性意义，但50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4C。

上述实验结果表明：与空白对照组相比，50 nmol/L和250 nmol/L浓度的人参皂苷Rg3均能明显促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化。

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引言

神经干细胞是一类能够自我更新、增殖并分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的细胞^[1-3]。神经干细胞的发现为深入研究中枢神经系统的发育和治疗多种神经系统疾病或损伤提供了新思路^[4-5]。据文献报道，成体动物脑中神经干细胞数量较少且大部分处于静息状态^[6]。而移植的外源神经干细胞在宿主体内绝大多数自然分化为神经胶质细胞，分化成神经元的比例极少(仅占1%左右)^[7-8]。治疗不同的神经系统疾病或损伤需要将神经干细胞定向诱导分化为纯度较高的相应子代细胞，这对于提高治疗效果和降低不良反应非常重要^[9]。因此，采取有效措施诱导神经干细胞定向分化是亟待解决的科研问题。

人参(Ginseng)是中国传统名贵中草药材，在临床上应用极为广泛^[10]。人参皂苷是人参的主要活性物质，大量临床研究表明，人参皂苷对多种神经系统疾病或损伤具有神经保护作用^[11]。人参皂苷Rg3(Ginsenoside Rg3)是二醇类人参皂苷，属于稀有皂苷^[12]。目前，关于人参皂苷Rg3的实验研究主要集中在抗肿瘤方面^[13-14]，对其在神经系统中的研究较少。以往研究证明人参皂苷类成分，如Rb1和Rg1，对神经干细胞的增殖和分化有一定影响^[10^，^15-16]，但Rg3是否对神经干细胞的分化起作用鲜有报道。

实验以体外分离培养的小鼠神经干细胞为对象，研究人参皂苷Rg3对神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的影响，进一步为Rg3的药物开发以及神经干细胞的临床应用提供实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 神经干细胞分离培养，神经元和星形胶质细胞免疫荧光实验与实时荧光定量PCR实验(real time PCR)。

1.2 时间及地点 2015年3月至2016年8月在昆明医科大学分子临床医学研究院完成。

1.3 材料

实验动物：C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2011-0011，在昆明医科大学清洁级实验动物房繁殖。将体质量20-26 g的健康成年雌鼠与雄鼠在晚上8：00左右合笼，次日早上8：00左右观察雌鼠有无阴道栓，若有阴道栓，则表示交配成功，将雌鼠记为孕期0.5 d(E0.5)。

药物：人参皂苷Rg3粉末由昆明医科大学药学院胡炜彦副教授提供。先用二甲基亚砜将其溶解成20 mmol/L的储存液，于-80 ℃冰箱储存，然后用DMEM/F12细胞培养液稀释成20 μmol/L用于后期实验。

实验用主要试剂：DMEM/F12培养基、B27、0.05% EDTA-胰蛋白酶、胎牛血清、青链霉素(P/S)(Gibco公司)；Nestin抗体(Millipore公司)；Sox2抗体(Santa cruz 公司)；Tuj1抗体(Convance公司)；GFAP抗体、荧光二抗(Abcam公司)；碱性成纤维生长因子、表皮生长因子(Peprotech公司)；多聚甲醛、BSA、PBS(索莱宝公司)；DAPI，Faststart Universal SYBR Green Master (ROX)(Roche公司)；Trizol、2，2，2-三溴乙醇、多聚鸟氨酸、层粘连蛋白、二甲基亚砜(Sigma公司)；DnaseI、PrimerScript RT reagent Kit(Takara公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 原代神经干细胞的分离和培养 取孕14 d的C57BL/6小鼠，腹腔注射2，2，2-三溴乙醇将其麻醉，在无菌条件下分离出胎鼠大脑皮质组织。加入0.05%胰蛋白酶在37 ℃水浴中消化8 min，然后在超净台中用Axygen黄色枪头将其反复多次轻柔吹散成单个细胞，800 r/min离心10 min，弃上清，加入含2% B27、1% P/S、20 μg/L碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM/F12生长培养基重悬，调整细胞浓度为5×10⁸ L^-1接种到细胞培养皿，置于含体积分数为5% CO₂的37 ℃细胞培养箱中培养，每2 d补充少量新鲜生长培养基。

1.4.2 神经干细胞传代培养和固定 收集原代培养5-7 d形成的神经球(Neurosphere)，800 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜生长培养基重悬，用Axygen黄色枪头轻柔、反复吹打成单细胞悬液。然后再次800 r/min离心5 min，弃上清，加入新鲜生长培养基重悬，若此时将单细胞悬液直接接种到细胞培养皿或培养瓶中培养则为悬浮培养；若此时将单细胞悬液接种到包被多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的细胞培养皿或直径12 mm的圆玻片上培养则为贴壁培养。此次传代的神经干细胞记为第1代，以此类推。神经干细胞每5-7 d传代1次，其中每2 d补充少量新鲜生长培养基。

将第3代贴壁培养24 h左右的神经干细胞用40 g/L多聚甲醛固定30 min，用于后期检测神经干细胞特异性的免疫荧光实验。

1.4.3 神经干细胞诱导分化和样品收集 将第2代神经球吹散成单细胞，以每孔5×10⁷ L^-¹细胞浓度接种于包被多聚鸟氨酸和层粘连蛋白的24孔或12孔细胞培养板中培养过夜。次日更换成含2% B27和体积分数为1%胎牛血清的DMEM/F12分化培养基并按照以下分组方式给药：空白对照组、50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组，置于细胞培养箱中诱导分化3 d。实验重复3次。

然后，用40 g/L多聚甲醛将24孔细胞培养板中的细胞固定30 min，用于后期检测神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞比例的免疫荧光实验；向12孔细胞培养板中加入500 μL Trizol裂解细胞，收集各组细胞样品并将其迅速置于-80 ℃冰箱中保存，避免反复冻融，用于后期RNA抽提和实时荧光定量PCR实验。

1.4.4 细胞免疫荧光实验 向40 g/L多聚甲醛固定的细胞样品中加入0.1 % Triton X-100打孔10 min，10% BSA室温封闭1 h，然后向鉴定神经干细胞特异性样品中加入其特异性抗体Nestin(小鼠单抗，1∶50)和Sox2(山羊多抗，1∶200)；向诱导分化3 d的神经干细胞样品中加入神经元特异性抗体Tuj1(小鼠单抗，1∶500)和星形胶质细胞特异性抗体GFAP(兔多抗，1∶1 000)，于4 ℃冰箱中孵育过夜。次日向鉴定神经干细胞特异性的样品中加入Alexa546结合的驴抗小鼠IgG(1∶1 000)和Alexa488结合的驴抗山羊IgG(1∶1 000)，向诱导分化3 d的神经干细胞样品中加入Alexa546结合的驴抗小鼠IgG(1∶1 000)和Alexa488结合的驴抗兔IgG(1∶1 000)，室温孵育1 h(注意避光操作)，加入DAPI进行细胞核染色，最后根据样品类型选择是否封固。注意各步骤之间需用0.01 mol/L PBS清洗2次或3次，每次10 min。

1.4.5 图像处理和数据分析 将鉴定神经干细胞特异性的样品置于蔡司共聚焦显微镜下观察，并选择细胞分布均匀、细胞形态清晰处拍照。将诱导分化后的细胞样品置于莱卡普通荧光显微镜下观察，每组样品随机采集至少3张细胞分布较均匀的视野拍照(×200)，计数视野中Tuj1⁺和GFAP⁺细胞以及DAPI⁺细胞，并计算比值(阳性细胞比例= Tuj1⁺或GFAP⁺细胞数/DAPI⁺细胞总数×100%)。

1.4.6 RNA抽提和real time PCR 按照Trizol说明书操作步骤抽提总RNA，并加入DNaseI去除基因组DNA。然后按照PrimerScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)操作说明书反转录获取相应cDNA。应用ABI7300型荧光定量PCR仪，使用Faststart Universal SYBR Green Master (ROX)进行扩增。Tuj1上游引物序列：5’- CCA TCT AGC TAC TGA CAC TG-3’，下游引物序列：5’-AAG TGG ACT CAC ATG GAG TG-3’；GFAP上游引物序列：5’-TGC CAC GTT TCT CCT TGT CTC GAA-3’，下游引物序列：5’-TCG ATC TAG CTA GCA AAG CGG TCA-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TGA CGT GCC GCC TGG AGA AA-3’，下游引物序列：5’-AGT GTA GCC CAA GAT GCC CTT CAG-3’。实验结果采用2^-ΔΔCT法进行相对定量分析。

1.5 主要观察指标 ①分离、培养小鼠神经干细胞并鉴定其特异性；②通过细胞免疫荧光实验统计分析空白对照组和人参皂苷Rg3组中神经干细胞分化3 d的Tuj1⁺神经元和GFAP⁺星形胶质细胞占全部细胞的比例及差异；③通过real time PCR检测空白对照组和人参皂苷Rg3组中神经干细胞分化3 d的Tuj1和GFAP mRNA表达水平，并比较各组间差异。

1.6 统计学分析 实验结果用x(_)±s_{x(_)}表示，利用GraphPad prism 5.0软件采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较3组数据两两之间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

1992年神经干细胞的发现为治疗神经系统疾病和损伤提供了新方向^[17-18]。目前，神经干细胞的临床应用亟需解决的问题之一是如何诱导其定向分化成合适的细胞类型，提高对神经系统疾病或损伤的修复作用，减少不良反应，使其具有更广阔的应用前景^[1^，^19]。

在神经干细胞培养过程中，使用神经干细胞特异性生长培养基能较好的去除杂细胞，优化其纯度。需要注意的是，神经干细胞悬浮培养时必须在合适的时间内传代，否则当神经球直径过大时其内部细胞往往会因为吸收不到充足的养分和氧气而死亡^[20-21]。另外，直径过大的神经球在

机械分离传代时也较难吹散，为后期传代培养带来不利影响。目前，Nestin和Sox2是最常使用的神经干细胞特异性鉴定抗体^[22-24]，同时用Nestin和Sox2标记单层贴壁培养的神经干细胞，能提高实验结果的准确性和可靠性，而纯度较高的神经干细胞能为后期实验提供更高保障。

人参在中国有悠久的药用历史，是五加科植物人参的根茎，临床上常用于多种神经疾病的治疗，但现在还不十分清楚其具体作用机制^[10]。人参皂苷是人参的主要有效成分，对很多神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨海默病、脑卒中等都具有神经保护和修复作用^[11]。人参皂苷Rg3因具有显著的抗肿瘤作用而广受关注，至于其在神经系统中的研究相对较少，据胡炜彦等^[25]报道人参皂苷Rg3对H₂O₂导致的海马神经元损伤具有保护作用。已有研究证明，特定浓度的人参皂苷Rg1和Rb1能明显促进体内或体外培养的神经干细胞向神经元或神经胶质细胞方向分化^[25-28]。因此实验决定调查研究人参皂苷Rg3是否在诱导神经干细胞定向分化方面也具有类似Rg1或Rb1的作用。由于Rg3属于稀有皂苷，在人参中的含量明显比Rg1和Rb1低，故初步选择从纳摩尔级(50 nmol/L和250 nmol/L)开始探讨其对神经干细胞定向分化的影响。另外，由于体外培养的神经干细胞在胎牛血清中诱导分化时主要分化为神经元和星形胶质细胞，而分化为少突胶质细胞的比例较低，故本次实验未对其分化比例进行研究。

实验结果表明，与空白对照组相比，人参皂苷Rg3在50 nmol/L浓度时能明显促进神经干细胞向神经元和星形胶质细胞方向分化；在250 nmol/L浓度时主要促进其向星形胶质细胞方向分化，而对类神经元分化没有显著影响。这说明人参皂苷Rg3在极低浓度时即能对神经干细胞的分化具有明显影响，但具体作用机制还不清楚，仍需进一步深入研究。另外，人参皂苷Rg3在50 nmol/L和250 nmol/L浓度下，神经元的分化比例呈先上升后下降的趋势，提示在后期研究中可进一步细化Rg3浓度梯度，找到能促进神经干细胞向神经元方向分化的最佳浓度；人参皂苷Rg3在50 nmol/L和250 nmol/L浓度下，星形胶质细胞的分化比例呈现持续上升趋势，提示在后期研究中可进一步加大浓度梯度，寻找能促进神经干细胞向星形胶质细胞方向分化的最优浓度以及抑制向其分化的浓度。因为适量的星形胶质细胞可以分泌多种细胞因子和神经营养因子，这对神经干细胞和神经元的生存十分有利，但是如果其过度增生则会释放出肿瘤坏死因子和一氧化氮等神经毒性物质，反而对神经干细胞和神经元的生存极其不利^[29-31]。

总之，实验为后期选择更优浓度的人参皂苷Rg3高效诱导神经干细胞定向分化为神经元或星形胶质细胞提供初步实验数据，同时也可在此基础上进一步探讨其分化机制，并为神经干细胞临床应用奠定理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化的影响

Effect of ginsenoside Rg3 on mouse neural stem cell differentiation in vitro

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