大鼠腰椎终板软骨干细胞的分离及分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0485

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2093-2097.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0485

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

大鼠腰椎终板软骨干细胞的分离及分化

王效，徐宏光，肖良，刘晨，金中行

皖南医学院第一附属医院(弋矶山医院)脊柱外科，安徽省芜湖市 241001

修回日期:2017-12-06 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 徐宏光，教授，硕士生导师，博士生导师，主任医师，皖南医学院第一附属医院(弋矶山医院)脊柱外科，安徽省芜湖市 241001
作者简介:王效，男，1989年生，安徽省芜湖市人，汉族，在读硕士，主要从事脊柱骨科与老年骨病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81572185)；安徽省自然科学基金面上项目(1708085MH185)；安徽省科技厅对外科技合作项目(1704e1002229)；安徽省自然科学基金青年项目(1708085QH205)

Isolation and multi-differentiation potential of chondrogenic stem cells from rat lumbar endplates

Wang Xiao, Xu Hong-guang, Xiao Liang, Liu Chen, Jin Zhong-xing

Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital), Wuhu 241001, Anhui Province, China

Revised:2017-12-06 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Xu Hong-guang, Professor, Chief physician, Master’s supervisor, Doctoral supervisor, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital), Wuhu 241001, Anhui Province, China
About author:Wang Xiao, Master candidate, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College (Yijishan Hospital), Wuhu 241001, Anhui Province, China
Supported by:
the General Project of the National Natural Science Foundation of China, No. 81572185; the General Project of the Natural Science Foundation of Anhui Province, No. 1708085MH185; the External Cooperation Project of Anhui Provincial Science and Technology Department, No. 1704e1002229; the Natural Science Foundation for the Youth in Anhui Province, No. 1708085QH205

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
低熔点琼脂糖悬浮培养筛选系统：利用干细胞悬浮状态下培养形成细胞克隆团原理筛选干细胞，由3部分组成，先用2%的琼脂糖铺满培养瓶底部，再将细胞悬液与4%的琼脂糖按照1∶1的体积比充分混合后，再次均匀铺满瓶底，最后，加入适量培养基置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每3 d换液1次，干细胞能够生长并形成细胞克隆团。
克隆形成率：形成克隆的细胞为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

摘要
背景：细胞克隆筛选系统ClonePix能快速有效的挑选出经低熔点琼脂糖悬浮培养获得的细胞克隆团，能够解决生物治疗所需种子细胞数量不足的问题。
目的：分离和鉴定大鼠腰椎终板软骨干细胞。
方法：取4周龄SD大鼠10只，解剖显微镜下获得其腰椎终板软骨，采用胰酶与Ⅱ型胶原酶消化获得原代软骨细胞，将原代软骨细胞在低熔点琼脂糖培养基中悬浮培养，细胞克隆筛选系统ClonePix挑取细胞克隆团进行体外扩增，扩增后观察其细胞形态，然后进行成骨、成脂肪及成软骨方向诱导，并检测单克隆形成能力。
结果与结论：①利用低熔点琼脂糖悬浮培养法能够获得大鼠腰椎终板软骨细胞克隆团，细胞克隆团经体外扩增培养后形态呈梭形；②诱导后经茜素红、油红O及番红染色证明具有成骨、成脂肪及成软骨分化能力；③将细胞克隆团的单个细胞接种于10 cm培养皿，经过12 d的体外扩增培养，肉眼可观察到细胞集落。随着细胞接种密度的增大，细胞集落形成数目减少，以100个细胞密度接种时，集落形成能力最强，可以形成数目大于20个的细胞集落；④结果表明，经低熔点琼脂糖悬浮培养法获得的细胞克隆团具有多向分化能力和高增殖能力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0003-3604-0840(王效)

关键词: 干细胞, 软骨干细胞, 琼脂糖培养基, 腰椎终板软骨, 细胞克隆筛选系统, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: ClonePix, a cell cloning and screening system, can quickly and efficiently screen cell clones undergoing suspension culture with low melting point agarose, which can be used to provide a sufficient number of seed cells for biological therapies.
OBJECTIVE: To isolate and identify chondrogenic stem cells from the rat lumbar endplate.
METHODS: The lumbar endplates of 10 Sprague-Dawley rats with an age of 4 weeks were digested using trypsin and type II collagenase to isolate primary chondrogenic stem cells, followed by suspension culture with low melting point agarose. Then, the cell clones were selected by ClonePix and expanded in vitro for morphological observation. The multidirectional differential potential of cell clones was identified through osteogenesis, adipogenesis and chondrogensis tests, and the monoclonal formation ability was determined.
RESULTS AND CONCLUSION: The cell clones could be successfully separated by using the agarose culture system, which were spindle-shaped after in vitro expansion. The osteogenesis, adipogenesis and chondrogensis capacities of the cells were identified using alizarin red, oil red O and safranin staining, respectively. Single cells of the clone group were inoculated into 10 cm culture dishes, and after 12 days of in vitro expansion culture, colonies of cells were observed with the naked eye. With the increase of cell seeding density, the number of cell colonies decreased. When the cells were inoculated into 10 cm culture dishes at a density of 100 cells, the colony forming ability was strongest, and more than 20 cell colonies could be formed. These findings indicate that chondrogenic stem cells that are isolated by the agarose gel culture system have multidirectional differentiation potential and high proliferation ability.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Cartilage, Lumbar Vertebrae, Sepharose, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王效，徐宏光，肖良，刘晨，金中行. 大鼠腰椎终板软骨干细胞的分离及分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2093-2097.

Wang Xiao, Xu Hong-guang, Xiao Liang, Liu Chen, Jin Zhong-xing. Isolation and multi-differentiation potential of chondrogenic stem cells from rat lumbar endplates[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2093-2097.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年3至6月在皖南医学院弋矶山医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 4周龄SD大鼠10只，清洁级，体质量200-300 g，雌雄不限，由江苏省南京市青龙山动物研究中心提供。

1.3.2 主要试剂和仪器 低熔点琼脂糖(Sigma A9045)；0.05%透明质酸酶、0.25%EDTA-胰酶(Gibco)；0.2%Ⅱ型胶原酶(Sigma)；DMEM/F12(Gibco)；干细胞培养用血清(上海双洳生物科技有限公司)；干细胞成骨分化诱导培养基(A1007201，Gibco)；干细胞成软骨分化诱导培养基(A1007101，Gibco)；甲苯胺蓝染色剂(G3663，索莱宝)；茜素红染色液(南京森贝伽生物科技有限公司)；油红O染色剂(O0625，Sigma)；番红染色液(南京森贝伽生物科技有限公司)；结晶紫染色剂(C8407，索莱宝)。细胞克隆筛选系统ClonePix(英国Genetix公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠腰椎终板软骨原代细胞的获取 取4周龄SD大鼠10只，给予颈椎脱臼法处死后，浸泡于体积分数为75%乙醇中10 min，无菌条件下分离L₁-L₅腰椎，解剖显微镜下分离终板软骨，然后浸泡于含有双抗的PBS中10 min，取出后用PBS冲洗3次，剪碎至1 mm³大小。加入0.05%透明质酸酶，室温下作用20 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.25%EDTA-胰酶，置于37℃温水浴箱中40 min，再次离心并弃上清，最后加入0.2%Ⅱ型胶原酶，置于37 ℃水浴箱中消化5 h左右，每半个小时振荡1次以加速消化。待组织完全消化后用200目滤网过滤，1 500 r/min离心5 min，弃上清，重新加入含有体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基吹打混匀，备用。

1.4.2 低熔点琼脂糖悬浮培养筛选腰椎终板软骨干细胞 将1 g琼脂糖分别溶于50 mL和25 mL的PBS中，制成质量浓度为20 g/L和40 g/L的琼脂糖，高温高压灭菌，待温度降到90 ℃时，巴氏吸管吸取1.5 mL 20 g/L琼脂糖于60 mm培养皿中，迅速铺平，形成一薄层，然后置于4 ℃环境下凝固1 h左右。将0.75 mL含有第1代软骨细胞(4×10⁶)的细胞悬液与上述方法制备的40 g/L琼脂糖等体积混合后，加入事先已经铺被琼脂糖的60 mm培养皿中，使得最终胎牛血清体积分数为10%，置于4 ℃环境下冷凝15 min，然后加入适量培养基置于37 ℃、体积分数为5% CO₂环境下培养，每2 d或3 d换液1次。培养6周后获得细胞克隆团，经细胞克隆筛选系统ClonePix挑选出细胞克隆团，转移到12孔板中，进行体外扩增培养，将获得的细胞用于下一步实验。

1.4.3 成骨方向诱导分化 将用单克隆法得到的细胞，用0.25%EDTA-胰酶消化后，按照2×10⁴个/孔的密度接种于24孔板中，待24 h细胞贴壁后，将一般培养基更换为诱导成骨分化的培养基，每3 d换1次液，连续诱导3周后进行茜素红染色。

1.4.4 成软骨方向诱导分化 按照Micromass法进行成软骨方向分化^[10]，将用单克隆法得到的细胞，用0.25%EDTA-胰酶消化后，按照2×10⁴个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞融合达80%时，加入诱导软骨分化培养基，每3 d换1次液，持续诱导3周后进行番红染色。

1.4.5 成脂肪方向诱导分化 将用单克隆法得到的细胞，用0.25%EDTA-胰酶消化后，按照2×10⁴个/孔的密度接种于24孔板中，待细胞融合达80%-90%时，加入诱导脂肪分化培养基，持续诱导3周后进行油红O染色。在此过程中注意的是将原代细胞融合80%-90%时更利于脂肪诱导分化。

1.4.6 单克隆形成能力 根据Sekiya等^[11]报道，细胞在极低密度下(< 50个/cm²)，只有干细胞才能存活下来，而其他细胞因为细胞密度过小而不能存活。因此，利用低密度单克隆分析来验证所获取的细胞克隆团是否具有干细胞性质。将ClonePix挑选出的细胞克隆团经胰酶消化后，按照100，200，300个细胞密度接种于10 cm培养皿中，每个密度3份，加入含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养10-12 d，进行0.1%结晶紫染色，计数肉眼能观察到的细胞集簇。

1.5 主要观察指标 腰椎终板软骨干细胞的形态，成骨、成脂肪、成软骨分化能力以及单克隆形成能力。

1.6 统计学分析 以上数据通过采用SPSS软件18.0版本进行统计学分析，计量资料(细胞集落形成率)以x(_)±s表示，组间资料使用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

干细胞是指生命有机体从发生形成到发育成完整机体的过程中，始终保留的部分未分化的原始细胞^[12]，除了具有很强的增殖能力，还具有悬浮培养成球形和成骨、成脂肪、成软骨等多向分化能力。1992年Buschmann等^[13-14]用含有琼脂糖的培养基成功筛选得到软骨干细胞，后来，Thornemo等^[15]对该琼脂糖培养系统进行了改良，将铺于培养瓶底的琼脂糖凝胶提高到原浓度的2倍，这样保证了低熔点琼脂糖筛选系统中各层次之间渗透压的一致性。根据以往的研究，只有肿瘤细胞和软骨细胞才能在琼脂糖培养基中存活，其他类型的细胞在此培养系统中均不能存活^[16]。随着研究的不断深入，该观点目前已不成立。Wang等^[17]通过低熔点琼脂糖悬浮培养法，成功获取人腰椎终板软骨干细胞、纤维环干细胞和髓核干细胞。在以往发表的文章中，均是用巴氏吸管吸出的方法分离出细胞克隆团，后来作者验证并不可取，一方面显微镜下不易操作，而且还很容易造成污染。而通过细胞克隆筛选系统ClonePix仪器，可以很好的解决这一难题。

单克隆形成能力是干细胞最直接、最直观的证据，将通过低熔点琼脂糖悬浮培养法获得的细胞团进行体外培养后，其具有单克隆形成能力，而软骨细胞则无这种能力，从这方面讲，也能说明通过该法获得的细胞具有干细胞特性。

干细胞表面标记物是判断是否具有干细胞特性的最直接指标。早期对于人间充质干细胞的研究中，虽然其未有特异性的细胞表面标记物，但是间充质干细胞具有间质细胞、上皮细胞及内皮细胞及肌肉组织的一些标记，不表达造血细胞的一些标志。故目前多用CD29、CD44、CD73(SH4)、CD90、CD105(SH2)、CD106(VCAM-1)、CD133(AC133)、CD124、HLA-DR阳性进行分离间充质干细胞^[18-20]。后来学者利用间充质干细胞表面标记物来获取软骨干细胞，并证明二者细胞表面标记物的表达具有高度的同一性。

该实验在标本获取步骤中，通过甲苯胺蓝染色初步验证细胞来源是大鼠腰椎终板软骨^[21]，作者改进了筛选细胞克隆团的方法，使更多的细胞克隆团能够挑选出来进行体外扩增。后期的培养发现，挑选出的细胞克隆团中的细胞能贴壁生长，除此之外，还具有成骨、成脂肪及成软骨等多向分化能力，这些符合干细胞鉴定标准^[22]，最后通过结晶紫染色，可以证明在极低密度下单个细胞克隆团细胞具有形成细胞集落的能力。另外，鉴于对干细胞认识的局限性，很多细胞表面特征性标记物都是未知的^[23-26]，因此，对于这些没有明确细胞表面标记物的干细胞，不宜采用流式细胞术或免疫磁珠分选法来获得目的干细胞。但是，可以利用干细胞的某些特性，逆向获取干细胞，这一思路能够使学者们继续探索更多的途径来获取干细胞。

虽然在检测细胞克隆团的多向分化能力时未进行PCR和Western Blot检测，但是实验使用了比较公认的茜素红、油红O及番红染色，也能证明其具有多向分化能力。通过以上步骤，最终可以确定获取的细胞具有腰椎终板软骨干细胞特性，解决了椎间盘组织工程治疗和细胞治疗的种子来源问题，同时，也为下一步的研究奠定了基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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