2.1  实验动物数量分析  参加实验80只小鼠均进入结果分析，中途无脱落。

2.2  解毒化瘀中药对白血病耐药细胞生存率影响  第1周时，与模型组比较，解毒化瘀中药低、高浓度组白血病耐药细胞有一定程度的减少但是差异不显著(P > 0.05)；第2周时，耐药细胞数目继续下降，与模型组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；从第3周开始，耐药细胞数目进一步减少，差异有非常显著性意义(P < 0.01)，见图1。

2.3  解毒化瘀中药对NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα表达的影响  与正常对照组相比，模型组小鼠骨髓样本中NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα表达量显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)。与模型组相比，解毒化瘀中药低、高浓度组小鼠骨髓样本中NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα表达均显著下降，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。

2.4  解毒化瘀中药对Bcl-2及p-Akt蛋白表达影响  与正常对照组相比，模型组小鼠骨髓样本中Bcl-2及p-Akt蛋白呈现高表达，差异有显著性意义(P < 0.05)；与模型组相比，解毒化瘀中药低、高浓度组小鼠骨髓样本中Bcl-2及p-Akt蛋白表达均显著下降，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3。

2.5  解毒化瘀中药对PTEN和Akt蛋白表达影响  与正常对照组相比，模型组小鼠骨髓样本中PTEN蛋白表达显著降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，Akt蛋白表达显著升高，差异有显著性意义(P < 0.01)；与模型组相比，解毒化瘀中药低、高浓度组小鼠骨髓样本中PTEN蛋白表达显著升高，Akt蛋白表达显著降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图4。

2.6  解毒化瘀中药对小鼠血象影响  由表1可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠白细胞、淋巴细胞、L1210细胞显著增多，差异有显著性意义(P < 0.05)，中性粒细胞显著减少，差异有显著性意义(P < 0.05)。与模型组相比，解毒化瘀中药低、高浓度组白细胞、淋巴细胞、L1210细胞显著减少，且差异有显著性意义(P < 0.01)，中性粒细胞显著增多，差异有显著性意义(P < 0.01)。

白血病是一种常见的血液系统恶性肿瘤，被列为中国十大高发性肿瘤之一^[1]。急性淋巴细胞白血病治疗后易复发，预后较差^[2]。研究表明，核因子κB与肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及耐药关系十分密切，是多药耐药信号转导途径中的主要信号因子。药物化疗是急性白血病治疗中重要的一环，但是药物化疗产生的严重毒副作用较大，并且肿瘤细胞会对化疗药物产生多药耐药，导致化疗失败。中药可以有效调节机体免疫功能、增强自身抗氧化能力^[3]，也可以抑制肿瘤细胞增殖^[4]、逆转肿瘤细胞耐药^[5]、诱导肿瘤细胞死亡^[6]、降低放化疗毒副作用等。研究表明，PI3K/Akt信号传导通路参与调控细胞分化、细胞周期、细胞凋亡等^[7]。PTEN为具有磷酸酶活性的抑癌基因，在细胞生长信号通路中起重要作用，在急性淋巴细胞白血病中，沉默PTEN表达可降低对PI3K/Akt信号传导通路的抑制作用，使通路发生异常激活，导致其下游的Akt活化^[8]，而持续活化的Akt可以使得下游的靶点蛋白磷酸化，进而促进细胞生长或抑制细胞凋亡，使得白血病细胞大量增殖^[9]。研究表明，白血病患者需要及早行化疗延缓病情进展，中草药对该病治疗效果甚微^[10]，还有研究持相反意见，认为中草药联合化疗可以一定程度提高患者的治愈率^[11]。由于中草药成分复杂，治疗的机制尚不明确。该实验旨在观察解毒化瘀中药对急性淋巴细胞白血病改善的作用机制，从而为急性淋巴细胞白血病的治疗提供一定的理论依据。

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年1至7月在中山医学院实验室完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  SPF级6周龄雌性NOD-SCD小鼠80只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号为SCXK(京)2017-0022，分笼饲养，每笼5只，饲养于中山医学院动物中心实验室。

1.3.2  药物与试剂  解毒化瘀中药配方：由青黛、山慈姑、蚤休、虎杖、莪术、川芎、丹参、补骨脂等组成，由中山医学院提供。体积分数为10%小牛血清(武汉华联科技术服务有限公司)；Bcl-2、p-Akt试剂盒(武汉华联科技术服务有限公司)；NF-κB/P65、NF-κB/P50抗体(Cayman Chemical公司)；Bcl-2抗体(Scientific公司)；小鼠Akt、p-Akt抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司)；PTEN抗体(Sino Biological公司)。L1210细胞株、K562/A02耐药细胞(上海中国科学院细胞库)；白血病耐药细胞K562/A02是一种对化疗药物不敏感或具有抵抗性的细胞，使用该种细胞是为了检测中药灌胃处理后小鼠对白血病耐药细胞的杀伤能力，若使用中药处理后小鼠血清内白血病耐药细胞数目显著减少则说明中药可以有效辅助化疗治疗白血病。

1.3.3  实验仪器  离心机(上海精密仪器仪表有限公司)；Bio-Rad智能型生物信号显示处理系统(泰盟电子制造有限公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  L1210细胞的培养  将L1210细胞接种于培养瓶中，加入含体积分数为10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下无菌培养，取对数生长期细胞，两三天传代1次，传3代。

1.4.2  白血病模型建立  将80只小鼠随机分为正常组、模型组、解毒化瘀中药低浓度组、解毒化瘀中药高浓度组，每组20只，除正常组外，其余3组造模。参考宋艳秋等^[12]

的造模方法，将购买的L1210细胞株用含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养基培养传3代，当细胞数达所需数量后，使用离心机以1 000 r/min离心5 min，去除上清液，调整细胞浓度为1.7×10⁹ L^-1，将K562/A02耐药细胞和L1210细胞株从尾静脉注射入小鼠体内，注射量约为每只小鼠5×10⁵个L1210细胞和5×10⁵个白血病耐药细胞K562/ A02，建立白血病模型。

1.4.3  药物干预  将解毒化瘀中药配成1 g/L。造模成功后第2天解毒化瘀中药按照10，50 mg/kg的剂量每天灌胃1次，连续7 d。

1.5  主要观察指标

1.5.1  MTT检测白血病耐药细胞生存率^[13]  每周的周一早晨7点按时取小鼠尾静脉血液2 μL，分离血清，离心，弃上清，用PBS调整细胞浓度为1×10¹¹ L^-1，连续5周。按照MTT检测说明培养细胞并在570 nm的波长下测吸光度。细胞生存率(%)=实验孔吸光度/对照孔吸光度×100%。

1.5.2  Western blot 法检测小鼠骨髓样本中NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα、PTEN、Akt、Bcl-2及p-Akt的表达  末次检测小鼠耐药细胞生存率之后2 h，无菌条件下处死小鼠，取骨髓，采用机械裂解法提取骨髓中总蛋白，BCA蛋白试剂盒测量蛋白浓度，将蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离后的蛋白条带转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭，加入NF-κB/P65、NF-κB/P50、IκBα、PTEN、Akt、Bcl-2及p-Akt一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗37 ℃孵育40 min，蛋白条带用增强型化学发光显色系统进行显色，以β-actin为内参，应用Imagaquent 5.1软件对NF-κB/P65、NF-κB/ P50、IκBα、PTEN、Akt、Bcl-2及p-Akt蛋白质条带灰度进行相对定量分析。实验重复3次，取平均值为最终结果。

1.5.3  血细胞分类及血象比较  给药第5周，处死小鼠前24 h，从小鼠尾静脉取血约 0.03 mL，采用人工计数法检测白细胞计数及分类，包括L1210细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、白细胞总数。

1.6  统计学分析  采用SPSS 20.0软件和GraphPda Prism5软件对数据进行处理和分析作图，首先采用单因素方差分析，当组间差异有显著性意义时，进一步采用SNK方法进行比较，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

白血病细胞多药耐药的发生和演变过程中，其发病的中医病因病机为“毒蕴血瘀”^[14]。在白血病早期，白血病患者主要为“瘀血状态”，服用解毒化瘀药可以有效降低血液黏度，使患者易于康复。研究表明，解毒化瘀药可以有效够抑制白血病K562细胞的增殖^[15]，降低白血病细胞的耐药性^[16]。该实验中，解毒化瘀中药组小鼠体内Bcl-2及p-Akt蛋白表达显著受到抑制，细胞耐药性显著下降，说明解毒化瘀中药确实有效降低了白血病耐药细胞的存活率，可以有效辅助其他药物的治疗。

PI3K/Akt信号传导通路是一种经典信号通路，在机体生理功能中起到十分重要的作用^[17-18]。这种信号通路不仅可以介导正常细胞的生长和存活，同时也可以促进淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病等细胞凋亡^[19]。PI3K/Akt信号通路激活后可以使下游Akt磷酸化，而磷酸化的Akt通过诱导磷酸化凋亡调节蛋白和抗凋亡蛋白表达，间接产生抗细胞凋亡作用^[20-22]。因此，寻找抑制PI3K/Akt信号通路的中药有一定的研究意义^[23]。实验结果显示，解毒化瘀中药能够使Akt蛋白表达降低，PTEN表达升高，有效抑制了PI3K/Akt信号通路，达到促进白血病细胞凋亡的作用，其作用机制可能是PI3K通过激活Akt来调节细胞生长周期及细胞迁移、代谢，而PTEN基因低表达能激活PI3K/Akt信号传导通路，使得细胞凋亡。Bcl-2家族也是一种常见的凋亡控制基因，Bcl-2家族中主要由Bcl-2和Bax这两种蛋白表达量决定细胞是否凋亡，当Bcl-2表达下降时会促进细胞凋亡^[24-26]。实验结果显示，使用解毒化瘀中药后小鼠细胞内Bcl-2表达显著降低，说明解毒化瘀中药可以促进白血病细胞凋亡，并有效抑制白血病的发展。

综上所述，解毒化瘀中药通过阻断PI3K/Akt及NF-κB信号通路实现抑制L1210细胞增殖效应，从而缓解和治疗急性淋巴细胞白血病。中药成分较为复杂，在后续的实验中可以进一步探究中药中具体成分在白血病中的具体作用机制及药理。

此研究中的解毒化瘀中药包括青黛、山慈姑、蚤休、虎杖、莪术、川芎、丹参、补骨脂，其中青黛具有清热解毒、凉血消斑、泻火定惊的功效，主治胸痛咳血、口疮、痄腮；山慈姑具有清热解毒、消肿散结的功效，主治痈疽恶疮，瘰疬结核；虎杖具有利湿退黄、清热解毒的功效，主治湿热黄疸、淋浊；莪术具有行气解郁、破瘀的功效，主治破血行气、行气止痛、消食化积；川芎具有镇静，抗菌的功效，主治胁痛腹疼、寒痹筋挛；丹参具有通经止痛、清心除烦的功效，主治月经不调、痛经经闭、疮疡肿痛；补骨脂具有补肾壮阳、固精缩尿、肾虚腰痛的功效，主治肾虚阳痿、泄泻等。该研究证明了中药治疗急性淋巴细胞白血病可能与PI3K/Akt和NF-κB信号通路相关，但中药作用机制较为复杂，还需进一步探讨。