人脐带间充质干细胞对急性淋巴细胞白血病患儿异基因干细胞移植后免疫重建的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
异基因造血干细胞移植：是目前治疗白血病等恶性血液病的最佳手段之一，但移植后造血重建缓解、免疫重建延迟及移植物抗宿主病的发生仍是影响治疗效果的重要因素。异基因造血干细胞移植后预防移植物抗宿主病应用大量免疫抑制剂或对移植物进行T细胞体外剔除，可导致患者免疫重建延迟，增加感染风险、移植后疾病复发及继发性恶性肿瘤的发生。异基因造血干细胞移植后尽早重建患者造血功能及免疫功能，对提高移植效果具有重要的意义。
T细胞亚群：可分为CD4⁺辅助T细胞及CD8⁺抑制T细胞亚群，CD4⁺T细胞为辅助/诱导性T淋巴细胞亚群，是免疫应答中主要的反应细胞，能影响抑制性T淋巴细胞的成熟与活化，影响B细胞抗体的产生，其活化释放的大量细胞因子能促进CD8+T细胞及吞噬细胞的活性，增强抗肿瘤效应。CD8⁺T细胞可分泌一些抑制因子，同时产生肿瘤源性免疫抑制因子，后者直接或通过诱导CD8⁺T细胞进一步抑制宿主的免疫系统，使宿主免疫力降低。CD4⁺/CD8⁺比值可反映机体细胞免疫功能状态，它们既相互促进又相互制约。

摘要
背景：人脐带间充质干细胞可分泌多种支持造血的细胞因子和生长因子，可改变造血微环境，具有调节及改善机体免疫功能的作用。
目的：探讨人脐带间充质干细胞对儿童急性淋巴细胞白血病异基因造血干细胞移植后免疫重建的影响。
方法：选取64例接受异基因造血干细胞移植治疗的急性淋巴细胞白血病患儿，分为非血缘性供者异基因造血干细胞移植组(allo-HSCT组，n=32)及非血缘性供者异基因造血干细胞移植后输注人脐带间充质干细胞组(allo-HSCT+MSCs组，n=32)，观察两组治疗效果及并发症发生情况，比较两组患儿预处理前、移植后1，3，6个月时外周血免疫球蛋白及淋巴细胞亚群水平。

结果与结论：①allo-HSCT+MSCs组粒细胞植入时间短于allo-HSCT组(P < 0.05)，慢性移植物抗宿主病、巨细胞病毒感染生率低于allo-HSCT组(P < 0.05)；②两组移植后造血干细胞植入率、血小板重建、累计复发率、1年存活率比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③allo-HSCT+MSCs组移植后1，3，6个月血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、IgE水平及外周血T淋巴细胞(CD4⁺、CD3⁺CD4⁺、CD4⁺CD8⁺)、B细胞(CD19⁺)水平均高于allo-HSCT组(P < 0.05)；④结果表明，联合人脐带间充质干细胞输注能有效降低急性淋巴细胞白血病患儿异基因造血干细胞移植慢性抗宿主病发生率，有助于粒细胞造血重建及免疫功能重建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-8127-9573(向金峰)

关键词: 干细胞, 人脐带间充质干细胞, 儿童急性淋巴细胞白血病, 基因造血干细胞移植, 免疫重建

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) can secrete a variety of cytokines and growth factors to support hematopoiesis. They can change the hematopoietic microenvironment, and furthermore, regulate and improve the immune function of the organism.
OBJECTIVE: To investigate the effect of hUC-MSCs on immune reconstitution and prognosis in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT).
METHODS: Sixty-four ALL children who had undergo allo-HSCT were enrolled and randomized into non-blood donor allo-HSCT group (n=32) and non-blood donor allo-HSCT+hUC-MSCs group (n=32). The therapeutic effect and complication were observed in the two groups. The changes of immunoglobulins and lymphocyte subpopulations in the two groups were compared before and 1, 3 and 6 months after transplantation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the allo-HSCT group, the time of granulocyte implantation was shorter (P < 0.05), and the incidence of chronic graft versus host disease and cytomegalovirus was lower in the allo-HSCT+ hUC-MSCs group. There were no significant differences in hematopoietic stem cell implantation rate, platelet remodeling rate, cumulative recurrence rate and 1-year survival rate between the two groups (P > 0.05). The levels of serum immunoglobulins IgA, IgG, IgM, IgE and the levels of T lymphocytes (CD4⁺, CD3⁺CD4⁺, CD4⁺CD8⁺) and B cells in the peripheral blood of allo-HSCT+hUC-MSCs group were significantly higher than those in the allo-HSCT group at 1, 3 and 6 months after transplantation (P < 0.05). In conclusion, the combined use of hUC-MSCs infusion and allo-HSCT can effectively reduce the incidence of chronic graft-versus-host disease, and contribute to granulocyte hematopoietic reconstitution and immune function reconstruction.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hematopoietic Stem Cell Transplantation, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Leukemia, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

1.1 设计 前瞻性随机对照研究。

1.2 时间及地点 试验于2013年6月至2015年6月在南阳市中心医院小儿血液科完成。

1.3 对象 选取2013年6月至2015年6月接受异基因造血干细胞移植治疗的急性淋巴细胞白血病患儿64例。根据随机数字表将患儿分为非血缘性供者异基因造血干细胞移植组(allo-HSCT组，n=32)及非血缘性供者异基因造血干细胞移植后输注人脐带间充质干细胞组(allo-HSCT+MSCs组，n=32)。

allo-HSCT组：男17例，女15例，年龄3-12岁，平均(5.2±1.2)岁；急性B淋巴细胞性白血病14例，T细胞免疫表型急性淋巴细胞白血病18例。

allo-HSCT+MSCs组：男18例，女14例，年龄3-13岁，平均(5.5±1.4)岁；急性B淋巴细胞性白血病17例，T细胞免疫表型急性淋巴细胞白血病15例。

两组患儿基础资料比较差异无显著性意义(P > 0.05)，具有可比性。

纳入标准：①符合2000年WHO血液疾病诊断标准；②非同胞全相合异基因外周血造血干细胞移植者；③移植前均获得完全缓解(CR)；④供者均为自愿捐献，并签署知情同意书；⑤所有捐献者均获得南阳市中心医院医学伦理委员会批准。

排除标准：①移植前全身性感染者；②多器官功能衰竭者；③合并严重免疫性疾病者；④凝血功能障碍者。

1.4 方法

1.4.1 预处理方案 allo-HSCT组采用改良马利兰/环磷酰胺(BU/CY)方案18例，全身照射+环磷酰胺(TBI+CY)方案14例；allo-HSCT+MSCs组采用改良马利兰/环磷酰胺方案17例，全身照射+环磷酰胺方案15例。

BU/CY方案具体如下：移植前9 d应用司莫司汀250 mg/m²，羟基脲40 mg/kg；移植前8 d应用阿糖胞苷 2 mg/(m²•d)，连用2 d，持续静脉滴注；移植前5 d至移植前3 d应用马利兰 4 mg/(kg•d)，4次/d，口服，移植前4 d至移植前3 d应用环磷酰胺1.8 g/m²。

TBI +CY方案具体如下：移植前7 d行全身放疗7.5 Gy，肺部为6.5 Gy，移植前三四天应用环磷酰胺1.8 g/m²。

1.4.2 外周血干细胞动员及采集 所有供者(中华骨髓库河南分库)移植前给予粒细胞集落刺激因子(成都蓉生药业有限责任公司，批准文号：国药准字S20013036) 5-10 µg/(kg•d)，连续4 d皮下注射。采用血细胞单采技术采集外周血干细胞，采集一两天，并对采集细胞进行有核细胞计数。allo-HSCT组输注有核细胞中位数为(8.10± 2.25)×10⁸/kg，allo-HSCT+MSCs组输注有核细胞中位数为(8.13±2.28)×10⁸/kg。

1.4.3 并发症预防 ①移植物抗宿主病预防：移植前4 d至移植前1 d每天静脉滴注环孢霉素3 mg/kg，移植后当天将剂量调整至每天1.5 mg/kg，6-8周逐渐减量，每周减少5%；移植前5 d口服霉酚酸酯30 mg/kg，分别于移植第1，3，8天静脉输注抗CD25单克隆抗体1 mg/kg，若移植后150-180 d未发生移植物抗宿主病则减停霉酚酸酯及环孢霉素；②细菌感染预防：移植前应用头孢呋辛(1.5 g/次，2次/d)预防细菌感染；③应用氟康唑(50 mg/次，2次/d)预防真菌感染；④应用膦甲酸钠或更昔洛韦抗病毒治疗。

1.4.4 脐带间充质干细胞培养及输注 收集健康新生儿脐带(南阳市中心医院提供)，去除动静脉血管及脐带外膜，将脐带剪成0.5 cm组织块，加入0.2%Ⅰ型胶原蛋白，37 ℃酶裂解，次日加入2倍体积的0.05%胰蛋白酶，37 ℃酶解1 h，离心10 min后收集悬浮物接种于培养基中，收集3-6代细胞，allo-HSCT+MSCs组在输注异基因外周血造血干细胞后4 h回输脐带间质干细胞1.0×10⁶/kg，脐带间质干细胞传代培养、鉴定参照文献[6]。

1.5 主要观察指标 ①记录两组移植后粒细胞植入时间、慢性移植物抗宿主病、巨细胞病毒感染、造血干细胞植入率、血小板重建情况；②随访1年，记录两组累计复发率、1年存活率；③应用贝克曼-库尔特公司IMMAGE800全自动化生化分析仪于预处理前、移植后1，3，6个月检测血免疫球蛋白水平；④血清淋巴细胞亚群测定：分别于预处理前、移植后1，3，6个月应用CantoⅡ流式细胞仪测定两组外周血CD4⁺、CD3⁺CD4⁺、CD4⁺CD8⁺、CD19⁺细胞水平。具体操作如下：无菌采集患者外周静脉血2 mL，应用乙二胺四乙酸抗凝，试管中分别加入CD4⁺、CD3⁺CD4⁺、CD4⁺CD8⁺、CD19⁺单克隆抗体各5 µL，加入30 µL抗凝血，避光孵育15-20 min，加入溶血素200 µL，常温下避光孵育10-15 min后加入200 µL缓冲液振荡摇匀，上机操作，计算抗体阳性百分数。

1.6 统计学分析 应用SPSS 19.0进行统计学分析，两组计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，多组比较采用重复测量方差分析，计数资料比较采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

脐带间充质干细胞是源于中胚层且具有多向分化能力的成体干细胞，可分泌多种造血细胞因子，并能在特定条件下分化为造血基质细胞，可参与造血微环境构成，对促进造血干细胞归巢、增殖及分化起到重要的调节作用^[7-13]。动物研究指出，造血干细胞与异基因间充质干细胞共同输注可促进造血干细胞重建^[14-16]，并可通过免疫调节抑制移植物抗宿主病的发生。Park等^[17]研究指出，脐带间充质干细胞不仅与骨髓间充质干细胞具有相似的免疫调节功能及造血支持功能，而且因其增殖分化能力强、取材方便及潜伏病原体携带率低等方面优于骨髓间充质干细胞，因此逐渐替代骨髓间充质干细胞。本研究中allo-HSCT+MSCs组粒细胞植入时间短于allo-HSCT组(P < 0.05)，提示allo-HSCT与脐带间充质干细胞共同输注能有效促进干细胞在受者体内归巢、分化及增殖。慢性移植物抗宿主病的发生是由于供者与受者间遗传学差别导致allo-HSCT移植后受者组织(皮肤、肝、肠道)成为外来抗原而激活受者体内不同组织相容性抗原增生及分化并产生大量细胞因子，从而对机体组织或器官进行免疫损害，是导致异基因造血干细胞失败的重要因素^[18-21]。巨细胞病毒是特异性DNA病毒，但免疫功能低下时会激活潜伏的巨细胞病毒，导致巨细胞病毒血症^[22-25]。本研究中allo-HSCT+MSCs组慢性移植物抗宿主病、巨细胞病毒感染发生率低于allo-HSCT组 (P < 0.05)，提示异基因造血干细胞与脐带间充质干细胞共同输注能有效降低慢性移植物抗宿主病、巨细胞病毒感染发生，提高异基因造血干细胞移植成功率。

研究表明，恶性血液疾病患者普遍存在外周血T细胞亚群免疫功能异常^[26-27]。T细胞亚群可分为CD4⁺辅助T细胞及CD8⁺抑制T细胞亚群，CD4⁺T细胞为辅助/诱导性T淋巴细胞亚群，是免疫应答中主要的反应细胞，能影响抑制性T淋巴细胞的成熟与活化，影响B细胞抗体的产生，其活化释放的大量细胞因子能促进CD8⁺T细胞及吞噬细胞的活性，增强抗肿瘤效应。CD8⁺T细胞可分泌一些抑制因子，同时产生肿瘤源性免疫抑制因子，后者直接或通过诱导CD8⁺T细胞进一步抑制宿主的免疫系统，使宿主免疫力降低。CD4⁺/CD8⁺比值可反映机体细胞免疫功能状态，它们既相互促进又相互制约^[28-31]。

异基因造血干细胞移植是目前治疗恶性血液疾病的重要手段之一，移植后免疫重建是影响移植效果的重要因素之一^[32-34]。免疫重建包括体液及细胞免疫重建，即包括免疫系统有效抗原表达及T细胞数量及功能恢复。T细胞是体液免疫及细胞免疫的重要调节者，在异基因造血干细胞移植后免疫重建中起到重要的作用^[18-20]。因此，改善恶性血液疾病患者异基因造血干细胞移植后T细胞亚群水平对提高移植成功率具有重要的意义。allo-HSCT+MSCs组移植后1，3，6个月血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM、IgE水平及外周血T淋巴细胞水平均高于allo-HSCT组(P < 0.05)，提示脐带间充质干细胞可有助于异基因造血干细胞移植后免疫重建。考虑可能原因为脐带间充质干细胞可促使移植物中T细胞在外周免疫器官内增殖，并刺激淋巴样细胞迁移至胸腺并在胸腺内发育成为初始淋巴细胞，从而形成稳定持久的免疫重建，改善机体免疫功能^[35-37]。

综上所述，联合脐带间充质干细胞输注能有效降低急性淋巴细胞白血病患儿异基因造血干细胞移植后慢性移植物宿主病发生率，有助于粒细胞造血重建及免疫功能重建，但应注意预防巨细胞病毒感染的发生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程