异基因造血干细胞移植治疗慢性髓细胞性白血病监测染色体核型及融合基因表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.017

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4691-4696.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.017

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异基因造血干细胞移植治疗慢性髓细胞性白血病监测染色体核型及融合基因表达

李正发，刘伟，杜云云，杨同华，赵婕，史克倩，唐新华，杨艳梅，章印红，赖洵，闻艳，陆志祥

云南省第一人民医院血液内科，云南省昆明市 650032

修回日期:2017-05-16 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 刘伟，硕士，云南省第一人民医院血液科，云南省昆明市 650032
作者简介:李正发，男，1967年生，云南省昆明市人，主任医师，教授，主要从事白血病药物治疗机制、干细胞移植、微小残留病检测方法研究。
基金资助:
云南省自然科学基金及云南省人民医院科研基金资助项目(2000C030Q，2003YK011)

Clinical monitoring of chromosome karyotype and fusion gene expression after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in chronic myelocytic leukemia

Li Zheng-fa, Liu Wei, Du Yun-yun, Yang Tong-hua, Zhao Jie, Shi Ke-qian, Tang Xin-hua, Yang Yan-mei,Zhang Yin-hong, Lai Xun, Wen Yan, Lu Zhi-xiang

Department of Hematology, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Revised:2017-05-16 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Liu Wei, Master, Department of Hematology, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Li Zheng-fa, Chief physician, Professor, Department of Hematology, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Yunnan Province & the Scientific Research Foundation of Yunnan Provincial People’s Hospital, No. 2000C030Q, 2003YK011

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
异基因造血干细胞移植：按造血干细胞的来源部位可分为骨髓移植、外周血干细胞移植和脐血干细胞移植。按造血干细胞来自患者自身与否可分为自体移植、同基因移植和异基因移植。其中同基因移植是指患者与移植供体为同卵孪生兄弟或姐妹。对急性白血病无供体者，在治疗完全缓解后，采取其自身造血干细胞用于移植，称为“自体造血干细胞移植”。因为缓解期骨髓或外周中恶性细胞极少，可视为“正常”细胞，但一般复发率较高，因而疗效比异体移植稍差。

摘要
背景：有报告显示，70%的慢性髓细胞性白血病患者异基因造血干细胞移植后1-5个月的细胞遗传学和基因标志检测阴性，但个别病例移植后1-3个月内反复变化，移植3-12个月的阴性率可达89.5%。
目的：监测异基因造血干细胞移植治疗慢性髓细胞性白血病后的细胞分子遗传学标志变化，探讨其预后意义。
方法：纳入异基因造血干细胞移植治疗慢性髓细胞性白血病患者17例，移植后30 d及2，3，4，6，12，24，36，48，60，72个月，采用骨髓细胞短期培养法和直接法G显带分析患者染色体，双色荧光原位杂交检测bcr/abl融合基因，RQ-PCR检测骨髓原代细胞的bcr/abl基因。
结果与结论：17例患者中，8例为男患/男供者异基因造血干细胞移植，7例为男患/女供者异基因造血干细胞移植(同胞姐妹)，移植后多次复查染色体核型为46XX(女性核型)，未见Y染色体及其他畸变染色体核型；1例为女患/女供者异基因造血干细胞移植(其姐妹)；1例为女患/无亲缘男供异基因造血干细胞移植，移植后1个月时染色体核型46XY，但bcr/abl阳性，4个月后持续表达46XY，bcr/abl阴性，观察超过96个月，为持续缓解，说明疗效良好；其中1男患/男供(全相合同胞弟)异基因造血干细胞移植后，1-12个月Ph染色体bcr/abl基因持续阳性表达，施行供者淋巴细胞输注，48个月后染色体bcr/abl转阴性表达，为持续缓解。结果表明，慢性髓细胞性白血病患者实施异基因造血干细胞移植后，染色体核型、bcr/abl融合基因监测对后续治疗选择、预后判断有重要参考价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7221-6332(刘伟)

关键词: 干细胞, 移植, 异基因造血干细胞移植, 染色体核型, bcr/abl融合基因, 慢性髓细胞白血病, 云南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: It has been reported that 70% of patients with chronic myeloid leukemia (CML) are negative for cytogenetic and genetic markers within 1-5 months after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), but there are still some patients who have repeatedly varied outcomes in cytogenetic and genetic marker detection. Overall, the negative rate is up to 89.5% at 3-12 months after allo-HSCT.
OBJECTIVE: To monitor the changes in cytogenetic and genetic marker expression and to explore the prognostic significance in CML patients undergoing allo-HSCT.
METHODS: Seventeen CML patients who had undergone allo-HSCT were enrolled. Chromosome G banding pattern of the bone marrow from these patients were analyzed using short-term culture method and direct method at 30 days, 2, 3, 4, 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 months after allo-HSCT. Dual-color fluorescence in situ hybridization was used to detect bcr-abl fusion gene; bcr-abl expressions in primary bone marrow cells from CML patients were detected using RQ-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: There were 8/17 cases of male patient/male donor and 7/17cases of male patient/female donor (compatriots). 46XX karyotype (women) was detected by multiple reexaminations after transplantation, and there was no Y chromosome or other aberration of chromosome karyotype in their karyotype. Among the 17 cases, 1 case of female patient/female donor (compatriots) and 1 case of female patient/male donor (unrelated) manifested 46 XY chromosome karyotype and bcr-abl positive at 1 month after transplantation; after 4 months, these two cases still maintained 46 XY chromosome karyotype but bcr-abl negative; after 4-96 months, the karyotype continued to remain as 46 XY, and bcr-abl (-). Among the 17 cases, 1 case of male patient/male donor of full-matched compatriot (brother) manifested that Ph chromosomal bcr-abl gene continuously expressed within 1-12 months after allo-HSCT; then the cases was given donor lymphocyte infusion, and the bcr-abl expression returned to be negative at 48 months after transplantation. To conclude, chromosomal karyotype analysis and bcr-abl fusion gene monitoring provide important reference value for subsequent treatment options and prognosis judgment for CML patients with allo-HSCT.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Hematopoietic Stem Cell Transplantation, Leukemia, Myelogenous, Chronic, BCR-ABL Positive, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李正发，刘伟，杜云云，杨同华，赵婕，史克倩，唐新华，杨艳梅，章印红，赖洵，闻艳，陆志祥. 异基因造血干细胞移植治疗慢性髓细胞性白血病监测染色体核型及融合基因表达[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4691-4696.

Li Zheng-fa, Liu Wei, Du Yun-yun, Yang Tong-hua, Zhao Jie, Shi Ke-qian, Tang Xin-hua, Yang Yan-mei,Zhang Yin-hong, Lai Xun, Wen Yan, Lu Zhi-xiang. Clinical monitoring of chromosome karyotype and fusion gene expression after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in chronic myelocytic leukemia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4691-4696.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计 回顾性病例分析。

1.2 时间及地点 试验于2001年1月至2008年12月在云南省第一人民医院血液内科完成。

1.3 对象 选择云南省第一人民医院血液内科2001年1月至2008年12月收治的CML患者，有HLA配型全相合供者，患者有强烈愿望选择allo-HSCT。allo-HSCT成功植活，骨髓细胞培养收获可供分析的细胞分裂相，临床资料可供研究的CML患者17例，观察到2014年12月，年龄24-46岁，中位年龄32岁。

纳入标准：全部病例凭血常规、骨髓细胞、免疫学、遗传学、融合基因检查确诊为CML，诊断标准见张志南主编《血液诊断标准》第3版；性别不限，年龄18-60岁；研究对象对本研究的相关内容知情同意，并签署知情同意书。

排除标准：非CML行allo-HSCT，接受自体造血干细胞移植的患者。

1.4 方法 所有病例采用外周血allo-HSCT；预处理方案采用BU/CY方案；应用环孢菌素A、霉酚酸酯和短程甲氨蝶呤预防移植物抗宿主病。

骨髓染色体制备：无菌条件下抽取患者骨髓0.5-0.8 mL，分2份加入含体积分数20%小牛血清的RPMI1640培养液中，于37 ℃静置培养。其中1瓶在培养2 h后按Williams直接制片法制片，另1瓶按Yunis短期培养同步化方法制片。染色体标本经37 ℃恒温干燥24 h后，用胰蛋白酶-Giemsa法显带。染色体分析和描述按国际染色体命名体制(ISCN)进行(图1)。移植后30 d及2，3，4，6，12，24，36，48，60，72个月为常规骨髓取材观察时间点。

融合基因探针：美国VYSIS公司提供，bcr基因探针长度约为300 kb，覆盖22号染色体长臂远侧端(3’端)自13外显子至近着丝粒端(5’端)，包括m-bcr的区域，用fluorescein isothiocyanate(FITC)直接标记，abl基因探针长度约为 200 kb，覆盖9号染色体长臂远侧端abl基因第5外显子至近着丝粒端的区域，用rhodamine直接标记^[4]，双色荧光原位杂交(D-FISH)操作步骤：按文献[9]的方法步骤进行(图2)。

RQ-PCR(实时荧光定量反转录聚合酶链反应)检测方法：按文献[6]方法，GUS上游引物：GAA AAT ATG TGG TTG GAG AGC TCA TT；GUS探针：FAM-CCA GCA CTC TCG TCG GTG ACT GTT CA-TAMR，101 bp；GUS下游引物：CCG AGT GAA GAT CCC CTT TTT A；bcr/abl上游引物：TCC GCT GAC CAT CAA TAA GGA，148/73 bp；bcr/abl探针：FAM-CCC TTC AGC GGC CAG TAG CAT CTG A-TAMRA(b3a2/b2a2)；bcr/abl下游引物：CAC TCA GAC CCT GAG GCT CAA。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 主要观察指标 患者骨髓细胞学、骨髓染色体核型百分比级bcr/abl融合基因表达分析结果。

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讨论

造血干细胞移植的最终目的是使供者正常的造血干细胞在受者体内植活，替代患者病态造血、免疫功能，建立正常的造血免疫功能。所以，检测植入的造血干细胞是否植活，应测定患者移植前后血细胞及免疫学的一系列标志，如红细胞抗原、HLA抗原、细胞遗传学标志等。这些标志中红细胞抗原的改变可直观地看到移植后供-患血型的转化。遗传基因的转变往往是判断造血干细胞移植植活的有效方法之一，DNA指纹图谱在异基因造血干细胞移植中，作为植活证据的常规检测手段被广泛应用。从生物学意义上讲，遗传学的直接证据更为重要。有学者用短串重复序列(STR-PCR)检测，可明确患者处于完全供者嵌合状态或供受混合(部分)嵌合状态。

就现有实验条件和本研究开展的检测技术：D-FISH、RQ-PCR及G-显带染色体分析，试验选择染色体核型和/或融合基因表达变化作为观察的指标，来观察CML在allo-HSCT后的病情转化及预后初评，也是可行的方法之一。

本组观察病例中，7例男性白血病患者allo-HSCT供者为女性(其姐妹)，7例移植后多次复查染色体核型为 46XX(女性核型)；未见Y染色体及其他畸变染色体核型，说明移植后供体造血干细胞取代患者恶性克隆造血干细胞造血，移植成功，近期疗效满意。其中1例CML患者核型为46XX/XY，反复出现第12个月时bcr/abl由(-)转为(+)，白细胞增高，说明病情变化，移植物抗白血病效应不能清除，残余白血病恶性克隆造血，建议患者施行二次移植或者甲磺酸伊马替尼治疗，患者选择药物治疗，6个月后骨髓核型46XX，bcr/abl(-)，第22个月时核型为46XX/XY，Ph+，bcr/abl由(-)转为(+)，提示患者预后不良，复发的危险性很大，强烈建议患者选择二次allo-HSCT。

其中1例为CML女性患者，施行无关供者allo-HSCT后，1个月时染色体核型46XY，但bcr/abl阳性，4个月后持续表达46XY(供者男性核型)， bcr/abl转为阴性，观察超过24个月，为持续分子学缓解，说明疗效良好。

本组17例CML患者均采用外周血allo-HSCT，在移植成功后半年的观察期内细胞遗传学和分子遗传学检查提示得到缓解。在后期观察中，其中1例allo-HSCT后5次检测Ph染色体阳性，bcr/abl融合基因阳性，予供者淋巴细胞输注、干扰素等治疗措施，已存活超过72个月；3例异基因造血干细胞移植后Ph染色体阴性但bcr/abl融合基因阳性，其中1例出院后自行停止环孢素A治疗，56 d并急性移植物抗宿主病，多器官功能衰竭死亡。余2例在随后的监测中，bcr/abl转为阴性。存活已超过24个月。1例男性CML患者移植前Ph染色体阴性，bcr/abl融合基因阴性，allo-HSCT后复查Ph染色体、bcr/abl融合基因持续阴性，染色体核型为46XX，持续表达为供者核型；慢性移植物抗宿主病，免疫抑制剂治疗，存活已超过24个月。3例男性CML患者移植前Ph染色体阴性，bcr/abl融合基因阳性，allo-HSCT后，2例Ph染色体持续阴性，bcr/abl融合基因持续阳性达24个月后转为阴性，生存已超过48个月；1例allo-HSCT后复查Ph染色体、bcr/abl融合基因持续阴性，常规治疗生存已超过48个月。其余病例均在移植成功后细胞遗传学和分子遗传学检查提示得到缓解。

在CML中，有学者认为，经allo-HSCT袭击后，幸存的T细胞可存活1.0-1.5年，并继续表达融合基因产物，所以Ph染色体阳性，bcr/abl融合基因阳性并不能完全代表CML干细胞克隆存在；还有文献报告持续Ph染色体阳性，bcr/abl融合基因阳性的CML可存活5年以上^[19]。较为一致的看法是allo-HSCT后，CML患者bcr/abl融合基因持续阳性或者由阴性转阳性者，复发的危险性大^[20-24]。因此，对allo-HSCT后半年以上，即使染色体阴性，bcr/abl融合基因阳性或者由阴性转阳性者，复发的危险性大，指导后续治疗选择需要加强追踪观察密度。

试验结果显示，allo-HSCT后应用目前先进、可靠、有效的骨髓细胞短期培养法和直接法G显带分析染色体、双色荧光原位杂交技术、RQ-PCR检测bcr/abl融合基因，动态观察白血病患者在allo-HSCT后染色体核型和/或融合基因的表达，发现细胞遗传学和分子遗传学标志会发生改变，提示病情进展，需及早采取不同的治疗、干预措施，可为患者争取最好的预后。染色体核型和基因标志可为后续治疗和预后判断提供准确、有力的、科学的依据，在CML患者中尤为重要^[24-27]。

目前以伊马替尼为代表的酪氨酸激酶抑制剂已取代造血干细胞移植成为CML患者首选一线方案。在CML的治疗中应该详细评估患者的全面情况后，向其推荐优势治疗方案，参考患者的意愿，进行下一步治疗。第一代酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼作为一线治疗药物使CML患者的10年生存率达85%-90%，尼洛替尼、达沙替尼等第二代酪氨酸激酶抑制剂一线治疗CML能够获得更快、更深的分子学反应，逐步成为CML患者的一线治疗方案之一。allo-HSCT曾经是CML的一线治疗方案，但受有无供者、患者年龄、移植相关风险等多种因素限制，临床不能广泛应用。各种原因无法使用TKI治疗的患者可考虑以下治疗方案：①干扰素为基础的方案：在CML的酪氨酸激酶抑制剂治疗时代，曾经是allo-HSCT以外的最佳治疗选择，干扰素为基础的治疗方案逐步成为二三线选择。结合中国的实际情况，以下患者可考虑干扰素为基础的方案：酪氨酸激酶抑制剂耐药、不耐受且不适合allo-HSCT的CML慢性期患者；各种原因暂时无法应用酪氨酸激酶抑制剂治疗的或无法坚持长期使用酪氨酸激酶抑制剂的慢性期患者；②allo-HSCT：在酪氨酸激酶抑制剂治疗时代，allo-HSCT作为二线酪氨酸激酶抑制剂治疗失败后三线的治疗选择，应当严格掌握适应证，加速期治疗参照患者既往治疗史、基础疾病及bcr/abl激酶区突变情况选择适合的酪氨酸激酶抑制剂，病情回复至慢性期者，可继续酪氨酸激酶抑制剂治疗，如果患者有合适的造血干细胞供者来源，可考虑行allo-HSCT。存在T315I突变或第二代酪氨酸激酶抑制剂不敏感突变的患者应及早行allo-HSCT。有条件进行新药临床试验的单位可行新药试验。关于急变期治疗参照患者既往治疗史、基础疾病及突变情况选择酪氨酸激酶抑制剂单药或联合化疗提高诱导缓解率，缓解后应尽快行allo-HSCT。综合近几年来专家共识，allo-HSCT依然是CML治疗的重要手段，尤其是酪氨酸激酶抑制剂耐药及进展期患者。在酪氨酸激酶抑制剂治疗时代，移植不再是CML慢性期患者的一线治疗选择，原则上对至少1种第二代酪氨酸激酶抑制剂不耐受或耐药的患者考虑allo-HSCT。目标人群包括：对于标准的伊马替尼治疗失败的慢性期患者，可根据患者的年龄和意愿考虑行造血干细胞移植。治疗任何时候出现abl基因T315I突变的患者，首选造血干细胞移植。对第二代酪氨酸激酶抑制剂治疗反应欠佳、失败或不耐受的所有患者。更换第二代酪氨酸激酶抑制剂 6个月后仍未获得主要细胞遗传学反应者，其12个月获得次要细胞遗传学反应及长生存的可能性明显降低，应尽早考虑造血干细胞移植。第二代酪氨酸激酶抑制剂对大多数伊马替尼耐药的bcr/abl激酶突变有效，但对于T315I突变均无效。第三代酪氨酸激酶抑制剂如AP24534、VX-680、PHA-739358、PPY-A、XL-228、SGX-70393、FTY720和TGl01113、DCC2036等对T315I突变型均有效。

慢性髓细胞白血病是精准治疗的典范，酪氨酸激酶抑制剂(包括一代的伊马替尼，二代的达沙替尼和尼罗替尼等)的临床应用，开创了肿瘤靶向治疗的新纪元，明显延长了慢性粒细胞白血病的生存期和生活质量，那么在酪氨酸激酶抑制剂时代造血干细胞移植是否还有地位成为大家争论的焦点，经过多年的临床试验观察证实，在慢性粒细胞白血病酪氨酸激酶抑制剂治疗时代，造血干细胞移植仍然是非常重要的治疗措施。尤其是CML加速期\急变期的患者。对于慢性粒细胞白血病加速期, 建议立即给予酪氨酸激酶抑制剂治疗，同时进行同胞兄妹的HLA配型，如果治疗3个月时bcr/abl融合基因水平≥10%(IS)，非亲缘移植亦应考虑。对于慢性粒细胞白血病急变期, 异基因造血干细胞移植(亲缘或者非亲缘)是慢性粒细胞白血病急变期患者长生存的惟一治疗措施，所以应立即寻找合适的供者进行移植。1项回顾性研究显示，对于预后不良/中度危险者，提示造血干细胞移植对于预后高危及预后中危的CML加速期患者优于酪氨酸激酶抑制剂治疗，但对于低危CML加速期患者酪氨酸激酶抑制剂仍应作为首选。治疗过程中严格进行微小残留病监测，若病程中出现酪氨酸激酶抑制剂耐药情况时考虑行造血干细胞移植。移植前建议给予酪氨酸激酶抑制剂治疗至少达到完全血液学反应，且在移植前酪氨酸激酶抑制剂停药至少2周，移植前酪氨酸激酶抑制剂的使用不会影响移植的疗效，不会增加非复发死亡率，只有移植前患者处于的缓解状态会影响非复发死亡率，不能接受酪氨酸激酶抑制剂者亦需应用其他方法达到完全血液学反应后再接受移植。

试验强调移植后有染色体畸变的患者需要加强追踪观察密度，对于CML患者allo-HSCT后bcr/abl融合基因持续阳性或者由阴性转阳性者，复发的危险性大，应及早采取治疗干预措施。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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