1.1 设计 随机对照动物实验+细胞学实验观察。多组间样本均数相比采用单因素方差分析,细胞增殖采用多因素方差分析,组间样本均数两两相比采用Student’s t检验。
1.2 时间及地点 实验于2019年7月至2021年3月在河南省中医药大学SPF级实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 30只SPF级雌性SD大鼠,鼠龄12周左右,体质量230-270 g,购自河南省中医院,动物生产许可证号:SYXK(豫)2019-0009。所有动物均在河南中医药大学实验动物中心室内饲养。环境温度控制在(22±3) ℃,湿度45%-60%,采用昼夜节律12 h 间隔照明,大鼠分笼饲养,实验期间保证自由进食。
动物实验经河南省中医院河南中医药大学动物实验伦理委员会批准(批准号为HNZYY-2019007)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术,并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 主要试剂与仪器 红茴香提取物(Illicium henryi,IH)注射液,规格:每支2 mL/0.1 g,批号:20150827,批准文号:国药准字Z33020931,购自浙江泰康药业集团有限公司;血管内皮生长因子、碱性成纤细胞生长因子和血小板衍生生长因子酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒购自上海联硕生物科技有限公司;大鼠一氧化氮ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司;Matrigel基底胶和Transwell小室购自上海Corning公司;苏木精和伊红染色液购自美国Sigma公司;兔多克隆NRF1抗体购自英国Biorbyt公司;兔单克隆PI3K和磷酸化PI3K(p-PI3K)购自美国CST公司;兔多克隆AKT、磷酸化AKT(p-AKT)和β-肌动蛋白(β-actin)抗体和HRP标记的兔抗鼠酶标二抗购自英国Abcam公司;慢病毒空载体Vector和慢病毒过表达NRF1载体(LV-NRF1)购自生工生物工程(上海)股份有限公司;PI3K抑制剂LY294002购自美国MedChemexpress公司;噻唑蓝[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]染色液购自北京BioTeke公司;ECL发光液购自美国Thermo公司。血管生成载玻片购自德国IBIDI公司;酶标仪购自美国ELX800公司;凝胶成像分析仪购自广州瑞丰实验设备有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 动物实验
(1)动物模型制备及给药:根据之前的报道通过去势法和闭合性骨折法构建骨质疏松性骨折大鼠模型[18-19]。具体如下:将36只大鼠随机选取20只进行双侧卵巢切除术,其余16只随机选取10进行假手术仅暴露卵巢不摘除,作为假手术组,剩余6只作为空白对照组。观察4周后,通过双能X射线骨密度仪检测各组大鼠骨密度,确认骨质疏松模型构建是否成功。将建模成功的大鼠随机分为模型组和红茴香提取物处理组(红茴香提取物组),每组10只。对模型组和红茴香提取物组大鼠用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,从大鼠右侧股骨中段处纵形切开皮肤,切口约2 cm,暴露并固定股骨,在股骨干中段约1/3处锯断成横行骨折,再用直径为1.5 mm的克氏针逆行刺入骨折近端后从后侧的股骨大转子处穿出, 使用生理盐水冲洗并缝合伤口,观察2周。红茴香提取物组大鼠建模2周后腹腔注射红茴香提取物0.05 mL/kg,1次/d,持续12周;假手术组和模型组大鼠手术2周后皮下注射同体积的生理盐水,持续12周。
(2)检测大鼠股骨骨痂骨密度:给药结束后大鼠注射过量麻醉剂安乐死,取股骨骨折端的骨痂组织长为1 cm左右,使用双能X射线吸收扫描仪测骨密度,划定中心区域,运用小物体扫描模式 (分辨率为1.0 mm×1.2 mm,扫描速度50 mm/s,扫描宽度 2.0 cm)进行扫描记录。
(3)检测大鼠股骨生物力学:骨密度值测定结束后,取各组骨质疏松大鼠右侧股骨,放于三点弯曲试验生物力学测试机,找股骨中点为施压点,在骨折处加压,加压速度为2 mm/min,使用计算机记录和计算股骨最大载荷。
(4)组织学观察:采取苏木精-伊红染色法,大鼠处死后取股骨骨折处骨痂组织,用40 g/L多聚甲醛固定48 h,使用乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡浸润包埋,使用切片机将其切成5 μm左右薄片,将切片放入45 ℃ 恒温箱烘干,二甲苯脱蜡,乙醇脱水,使用苏木精溶液染色切片5 min,用流水冲洗10 s,滴加1% 盐酸乙醇和1% 氨水乙醇在切片上各停留15 s,使用蒸馏水冲洗后加入1% 伊红染液染色3 min,经梯度乙醇脱水后,使用二甲苯使切片透明后,使用中性树胶封固。光镜下选取各组骨折处结缔组织 8个高倍视野拍照,观察大鼠骨骼病理组织学变化,并观察新生血管情况,计数各组8个高倍视野中新生血管数[20]。
1.4.2 细胞实验
(1)细胞培养及处理:参考之前的报道选取人微血管内皮细胞进行血管生成的体外研究[21]。人微血管内皮细胞购自美国ATCC细胞库。细胞使用胰酶消化后按1∶3进行传代,使用含体积分数10% FBS的DMEM培养液将细胞培养在37 ℃体积分数5% CO2的恒温培养箱中。将传代至第3代的人微血管内皮细胞接种于96孔板中(5×103细胞/孔,100 μL/孔),对照组细胞加入等体积生理盐水;红茴香提取物组分别以50,100和200 mg/L质量浓度的红茴香提取物孵育细胞72 h后进行各项检测。Vector+ 二甲基亚砜组细胞在培养液中加入等体积空载体和0.1% 二甲基亚砜培养48 h;
LV-NRF1组细胞于5 μg LV-NRF1转染48 h;LY294002(PI3K抑制剂)组细胞培养液中加入10 μmol/L LY294002培养24 h;LV-NRF1+ LY294002组细胞转染5 μg LV-NRF1(100 μL/孔)后加入10 μmol/L LY294002(100 μL/孔)培养24 h,细胞处理结束进行下一步检测。
(2) MTT法检测人微血管内皮细胞增殖:在细胞培养的第0,24,48和72 小时分别加入20 μL MTT,于37 ℃孵育4 h,吸出培养液并加入150 μL二甲基亚砜,待结晶全部溶解后,使用酶标仪检测A值, 检测波长为490 nm。
(3)Transwell实验:用1∶8稀释后的Matrigel基底胶包被Transwell小室的上室面,置于37 ℃培养箱中30 min使其形成凝胶。将细胞以 2×104细胞/孔的浓度接种到Transwell小室。在下室中加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM液500 μL。放入37 ℃培养箱中培养24 h,用磷酸盐缓冲液冲洗3次,用棉签擦拭上室内多余细胞,用95%甲醇固定15 min,使用0.1%结晶紫染色20 min。将Transwell小室移至显微镜下拍照,记录随机6个视野内细胞比例。
(4)人微血管内皮细胞血管生成实验:将融化后的Matrigel基质胶铺于ibidi血管生成载玻片的下孔中,凝胶之后将105人微血管内皮细胞接种到血管生成载玻片的上孔中,孵育24 h后拍照并进行分析。使用AngioSys 2.0图像分析软件(Cellworks, Buckingham,UK)对总小管长度、连接和小管数量进行定量分析。
(5)ELISA法检测大鼠血清和人微血管内皮细胞中血管形成相关因子水平:在药物干预的最后一天采集大鼠血清并收集细胞培养液上清。使用ELISA法按血管内皮生长因子、碱性成纤细胞生长因子、血小板衍生生长因子和一氧化氮试剂盒说明书检测血清和细胞培养液上清中上述指标的水平。
1.4.3 Western blot法检测细胞中NRF1/PI3K/AKT通路蛋白表达 使用RIPA裂解液裂解组织和细胞并提取总蛋白,使用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度。电泳结束后用蛋白转膜仪将蛋白转印至PVDF膜上,用5 %脱脂牛奶将膜封闭1 h,TBST洗膜完成后,用一抗NRF1(1∶1 000稀释)、PI3K (1∶500稀释)、p-PI3K(1∶500稀释)AKT (1∶1000稀释) 、p-AKT (1∶1 000稀释) 和β-actin (1∶1 000稀释) 4 ℃孵育过夜,TBST洗膜,加入HRP标记的兔抗鼠酶标二抗 (1∶2 000稀释) 室温孵育2 h,洗膜完成后在ECL中显色。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin条带灰度值。
1.5 主要观察指标 ①大鼠骨骼组织形态学观察;②股骨骨密度和生物力学指标;③血管生成相关指标;④人微血管内皮细胞增殖和相关细胞因子水平;⑤人微血管内皮细胞中NRF1、磷酸化PI3K和AKT蛋白表达水平;⑥NRF1/PI3K/AKT通路对人微血管内皮细胞中相关细胞因子水平的影响。
1.6 统计学分析 所有研究数据均使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,结果数据均以x±s表示,数据呈正态分布。多组间样本均数相比采用单因素方差分析,细胞增殖采用多因素方差分析,组间样本均数两两相比采用Student’s t检验,以P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经河南省中医药大学生物统计学专家审核。