椎间盘退变相关焦亡基因的综合分析

doi:10.12307/2024.068

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (21): 3438-3444.doi: 10.12307/2024.068

• 植入物相关大数据分析 Implant related big data analysis • 上一篇

椎间盘退变相关焦亡基因的综合分析

谢越1，2，翟伟峰2，郭际2，贾永伟2

1上海中医药大学，上海市 200120；2 上海中医药大学附属光华医院，上海市 201203

收稿日期:2023-03-08 接受日期:2023-04-24 出版日期:2024-07-28 发布日期:2023-09-28
通讯作者: 贾永伟，博士，主任医师，博士生导师，上海中医药大学附属光华医院脊柱外科，上海市 201203
作者简介:谢越，1995年生，河北省人，上海中医药大学在读硕士，主要从事中西医结合防治椎间盘退变研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81972118)，项目负责人：贾永伟；上海市科学技术委员会医学创新研究项目(20Y11913000)，项目负责人：贾永伟；长宁区博士创新基地项目(RCJD2021B06)，项目负责人：贾永伟；上海市长宁区科委课题(CNKW2022Y20)，项目负责人：贾永伟；上海中医药大学预算内课题(2021LK012)，项目负责人：翟伟峰

Integrative analyses of pyroptosis-related genes associated with intervertebral disc degeneration

Xie Yue1, 2, Zhai Weifeng2, Guo Ji2, Jia Yongwei2

1Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200120, China; 2Guanghua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Received:2023-03-08 Accepted:2023-04-24 Online:2024-07-28 Published:2023-09-28
Contact: Jia Yongwei, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Guanghua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
About author:Xie Yue, Master candidate, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200120, China; Guanghua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81972118 (to JYW); Medical Innovation Research Project of Shanghai Science and Technology Commission, No. 20Y11913000 (to JYW); Changning District Doctor Innovation Base Project, No. RCJD2021B06 (to JYW); Project of Changning District Science and Technology Commission of Shanghai, No. CNKW2022Y20 (to JYW); Project within the Budget of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, No. 2021LK012 (to ZWF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

椎间盘退变：是一种退行性疾病，常伴有炎症，是导致椎间盘源性腰痛的重要原因之一。在年龄增长过程中，椎间盘内的髓核组织水分逐渐减少，椎间盘失去正常的弹性和张力，在外界因素(如损伤，劳累等)的作用下，纤维环结构破坏，髓核组织结构发生异常改变。
细胞焦亡：又称细胞炎性坏死，是一种细胞程序性死亡方式。依赖于炎性半胱天冬酶(主要是Caspase-1，4，5，11)，并伴有大量促炎症因子的释放，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。

背景：椎间盘退变早期诊断和治疗尤为重要，髓核细胞焦亡在早期椎间盘退变过程中发挥着重要作用，但髓核细胞焦亡相关分子在早期椎间盘退变中发挥的作用及相关分子标志物仍不明确。

目的：探讨焦亡相关差异表达基因在椎间盘退变过程中的诊断及治疗价值。
方法：整合GEO数据库椎间盘退变的公开数据集进行差异分析，与之前报道的33个焦亡基因取交集；使用基因本体论、京都基因和基因组百科全书对椎间盘退变焦亡相关基因进行通路富集分析，并使用基因集富集分析对椎间盘退变数据集进行富集分析；构建椎间盘退变样本中的免疫细胞谱，并将差异表达的细胞焦亡相关基因与免疫细胞进行相关性分析；构建蛋白质互作网络，筛选Hub基因以鉴定蛋白质相互作用网络中与椎间盘退变相关的关键基因；整合数据集绘制差异表达焦亡基因的受试者工作特征曲线，计算曲线下面积，探索目标基因的临床诊断价值；qRT-PCR验证正常人髓核细胞与椎间盘退变人髓核细胞之间焦亡相关基因的表达差异。

结果与结论：①获得4 426个与椎间盘退变相关的差异表达基因，交集后获得14个差异表达的焦亡相关基因；②基因本体论、京都基因和基因组百科全书分析揭示了重要的富集途径，主要与炎症、细胞周期、感染和NOD样受体通路相关；基因集富集分析显示氨基酸代谢、P53转录调节等通路在椎间盘退变患者中显著富集；免疫浸润分析提示椎间盘退变的发生发展与免疫细胞密切相关；③共筛选出5个Hub基因，分别为IL-1β、Caspase-1、AIM2、Caspase-5、NLRC4；④椎间盘退变关键生物标志物的获取及鉴定：将GEO两个数据集与焦亡基因取交集后发现NLRP3具有显著表达差异，受试者工作特征曲线显示NLRP3具有临床诊断意义；⑤qRT-PCR显示IL-1β、Caspase-5和NLRC4等Hub基因在椎间盘退变的髓核细胞中表达显著增加(P < 0.05)，Caspase-1、AIM2以及NLRP3表达无差异(P > 0.05)；⑥提示细胞焦亡在椎间盘退变发生发展过程中发挥重要作用，其中焦亡相关基因NLRP3、IL1-β、Caspase-5、NLRC4具有早期诊断和治疗价值。

https://orcid.org/0000-0002-2746-082X (谢越)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 椎间盘, 细胞焦亡, 椎间盘退变, 免疫浸润, 诊断, 富集分析

Abstract: BACKGROUND: Early diagnosis and treatment of intervertebral disc degeneration is particularly important. Pyroptosis of nucleus pulposus cells plays an important role in the early process of intervertebral disc degeneration, but the role of pyroptosis-related molecules of nucleus pulposus cells in early intervertebral disc degeneration and related molecular markers are still unclear.
OBJECTIVE: To explore the diagnostic and therapeutic value of differentially expressed genes related to pyroptosis during intervertebral disc degeneration.
METHODS: Public datasets of the GEO database were integrated for differential analysis, and intersected with 33 pyroptosis-related genes previously reported. Using Gene Ontology analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, pathway enrichment analysis was performed in genes related to pyroptosis during intervertebral disc degeneration. Enrichment analysis of the intervertebral disc degeneration dataset was conducted using gene set enrichment analysis. To construct the immune cell spectrum in intervertebral disc degeneration samples, the correlation between the differentially expressed pyroptosis-related genes and immune cells was analyzed. Protein interaction networks were built. Screening of the Hub gene to identify key genes associated with intervertebral disc degeneration in protein interaction networks. The receiver operating characteristic curve of the differentially expressed pyroptosis-related genes was plotted, and the area under the curve was calculated. The clinical diagnostic value of target genes was explored. qRT-PCR was applied to verify the difference in the expression of pyroptosis-related genes between normal human nucleus pulposus cells and degenerated human nucleus pulposus cells with intervertebral discs.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 4 426 differentially expressed genes associated with intervertebral disc degeneration were obtained, and 14 differentially expressed pyroptosis-related genes were obtained after the intersection. (2) Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes revealed important enrichment pathways, mainly related to inflammation, cell cycle, infection and NOD-like receptor pathway. Gene set enrichment analysis showed that pathways such as amino acid metabolism and P53 transcription regulation were significantly enriched in patients with intervertebral disc degeneration. Immune infiltration analysis suggested that the occurrence and development of intervertebral disc degeneration were closely related to immune cells. (3) A total of five Hub genes were screened, namely IL1-β, Caspase-1, AIM2, Caspase-5, and NLRC4. (4) Acquisition and identification of key biomarkers for intervertebral disc degeneration: After intersecting the two datasets of GEO with the pyroptosis-related gene, it was found that NLRP3 had significant expression differences, and the receiver operating characteristic curve showed that NLRP3 had clinical diagnostic significance. (5) qRT-PCR showed that the expression of Hub genes such as IL1-β, Caspase-5 and NLRC4 was significantly increased in the nucleus pulposus cells of intervertebral disc degeneration (P < 0.05), and there was no difference in Caspase-1, AIM2 and NLRP3 expression (P > 0.05). (6) It is suggested that cell pyroptosis plays an important mechanism in the occurrence and development of intervertebral disc degeneration, among which pyroptosis-related molecules NLRP3, IL1-β, Caspase-5 and NLRC4 have early diagnosis and treatment value.

Key words: intervertebral disc, cell pyroptosis, intervertebral disc degeneration, immune infiltration, diagnosis, enrichment analysis

中图分类号:

谢越, 翟伟峰, 郭际, 贾永伟. 椎间盘退变相关焦亡基因的综合分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(21): 3438-3444.

Xie Yue, Zhai Weifeng, Guo Ji, Jia Yongwei. Integrative analyses of pyroptosis-related genes associated with intervertebral disc degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(21): 3438-3444.

图/表（结果） 12

2.1 差异表达的焦亡基因鉴定关于GEO数据集的详细信息见表1。为了分析基因表达值对椎间盘退变相对于健康对照组的影响，使用limma包进行差异分析，得到两组数据的差异表达基因。在GSE124272数据集中得到了4 426个差异表达基因，其中包括1 836个上调基因和2 590个下调基因，利用差异表达基因和数据分组绘制了火山图(图1A)。将差异表达的基因与细胞焦亡基因取交集后，得到14个差异表达的细胞焦亡相关基因，这14个差异表达的细胞焦亡相关基因的相关信息详见表2，同时根据这14个基因的基因表达情况绘制环状热图(图1B)。

2.2 差异表达细胞焦亡基因的功能富集分析为了分析椎间盘退变相关的差异表达的细胞焦亡基因与生物学过程、分子功能、细胞组分、生物学通路以及疾病之间的关系，首先对椎间盘退变相关的差异表达基因进行了功能富集分析(图2A，表3)，椎间盘退变相关的差异表达的细胞焦亡基因主要富集在interleukin-1 production，inflammasome complex，cytosolic part，cysteine-type endopeptidase activity等。

同时，对差异表达的细胞焦亡基因进行通路富集分析，结果显示富集在NOD-like receptor signaling pathway，Shigellosis，Salmonella
infection，Yersinia infection，Legionellosis等生物学通路中(图2B，表4)。

2.3 基因集富集分析为了确定基因表达水平对椎间盘退变的影响，对GSE124272数据集进行了基因集富集分析。结果显示metabolism of amino acids and derivatives、transcriptional regulation by TP53、M phase、cell cycle mitotic were significantly等通路在椎间盘退变患者组显著富集(图3，表5)。

2.4 免疫细胞浸润评估基于基因表达数据，使用了CIBERSORTx算法探讨GSE124272数据集中免疫细胞的比例。除了丰度为零的免疫细胞亚型外，共构建了17种椎间盘退变样本中的免疫细胞谱，并利用小提琴图来比较椎间盘退变患者和健康对照组的免疫细胞亚群分布(图4A)。2个细胞之间相应的相关值由每个小色块的阴影表示，并利用皮尔逊系数来确定显著性(图4B)。同时，将差异表达的细胞焦亡相关基因与免疫细胞进行了相关性分析，这些结果提示椎间盘退变的发生发展与免疫细胞密切相关(图4C)。

2.5 Hub基因筛选构建椎间盘退变相关的差异表达的细胞焦亡基因相关的蛋白质-蛋白质互作网络(图5A)，并在cytoscape中进行可视化。在椎间盘退变相关的差异表达基因相关的蛋白质-蛋白质互作网络中共计13个椎间盘退变相关的差异表达的细胞焦亡基因，156个蛋白质-蛋白质互作对，其中通过CytoHubba插件分析了蛋白质-蛋白质互作网络中的Hub基因，它们分别是IL-1β、Caspase-1、AIM2、Caspase-5、NLRC4(图5B)。

2.6 椎间盘退变关键生物标志物的获取及鉴定利用GSE150408数据集对上述筛选到的椎间盘退变差异表达的细胞焦亡基因进行验证。使用limma包进行差异分析，共得到了1 584个差异表达的基因，其中包括927个上调基因和657个下调基因，利用差异表达基因和数据分组绘制了火山图热图(图6A，B)。将GSE150408和GSE124272两组数据集差异表达的基因与细胞焦亡基因取交集后(图6C)，得到1个差异表达的细胞焦亡相关基因——NLRP3，通过GSE150408验证结果发现，该基因在椎间盘退变患者中高表达(图6D)。同时，将筛选出来的关键细胞焦亡相关基因在2个数据集中进行了ROC分析并计算了曲线下面积。结果显示2个数据集中曲线下面积值均大于0.6，表明NLRP3基因能准确区分椎间盘退变患者和健康对照，具有潜在的诊断价值(图7)。

2.7 IL-1β、Caspase-5和NLRC4基因的表达 qRT-PCR验证了正常人髓核细胞与椎间盘退变人髓核细胞之间的Hub基因及NLRP3表达差异，结果采用独立样本t检验。结果显示，与正常组相比，IL-1β(P < 0.01)、Caspase-5(P < 0.05)和NLRC4(P < 0.001)在椎间盘退变患者中高表达，而NLPR3、Caspase-1、AIM2没有显著差异(P > 0.05)，见图8。

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引言

椎间盘退变是一种由遗传和环境因素相互作用引起的慢性退行性疾病，主要表现为下腰痛，随着世界人口老龄化，椎间盘退变正在成为一种常见疾病[1]。目前椎间盘退变的诊断主要依赖影像学，然而早期椎间盘退变通常是隐匿的，目前缺乏相关临床标志物能够可靠地反映早期疾病进展情况。因此，研究椎间盘退变发生机制，探索潜在的生物标志物和预后指标，对于椎间盘退变的早期诊断和治疗至关重要。
椎间盘主要由髓核、上下终板和外周纤维环组成，衰老和频繁的脊柱负重可引起髓核、终板和纤维环受损，其特征是慢性炎症和进行性细胞死亡[2-4]。细胞焦亡是由炎性小体和半胱天冬酶活化引发的一种调节性细胞死亡形式，可诱导质膜孔形成和细胞肿胀或裂解[5]。细胞焦亡主要有2条途径，一条是经典的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1)途径，一条是Caspase-5途径，最终均可使GSDMD-N末端暴露，并释放白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)或IL-18，诱导细胞死亡。细胞焦亡在各种疾病的发病机制中起关键作用[6-7]，先前的研究表明，在椎间盘退变的进展过程中，炎症小体持续激活引发髓核细胞焦亡，此过程可以发生在椎间盘退变早期[8-9]。
因此，细胞焦亡过程中的部分分子有可能成为早期诊断椎间盘退变的潜在标志物。为筛选具有潜在价值的分子标志物，采用GEO(Gene Expression Omnibus data base)分析椎间盘退变中差异基因，并与焦亡基因集取交集，分析椎间盘退变过程中与焦亡相关的基因。使用基因本体论和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)来分析它们的途径和生物学功能，并使用基因集富集分析补充椎间盘退变通路富集信息。构建基因的分子互作网络，分析网络中的Hub基因，绘制受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，并在正常人类髓核细胞与椎间盘退变人类髓核细胞中进行Hub基因等的qRT-PCR，探讨椎间盘退变相关焦亡基因的临床诊断价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计基于生物信息学分析椎间盘退变焦亡相关差异表达基因，筛选具有潜在诊断及治疗价值的基因，利用多个数据集进行验证，并采用细胞实验进行体外实验验证。统计分析根据数据类型不同采用不同方法，主要结果以正常髓核细胞和退变髓核细胞比较为主。
1.2 时间及地点实验于2022年7-8月在上海昆盟生物科技有限公司细胞实验室完成。
1.3 材料从Procell(中国湖北)购买健康人髓核细胞(CP-H097)和椎间盘退变人髓核细胞(CP-H170)，进行细胞培养。此次研究通过上海中医药大学伦理委员会审查，伦理编号：PZSHUTCM221010002。
1.4 方法

1.4.1 数据采集下载椎间盘退变的基因表达谱数据GSE124272[10]、GSE150408[11]，从GEO数据库[12]，使用GEOquery包[13]。GSE124272数据集来自智人，数据平台是GPL21185，总共包含16个样本，包括8个对照(control)和8个疾病样本(disease)，所有样本均纳入此次研究。GSE150408 数据集来自智人，数据平台是 GPL21185，它总共包含59个样本，包括17个对照和42个疾病样本，其中25个疾病样本已用药物治疗，17个疾病样本未用药物治疗。为了排除药物对研究的干扰，纳入了17个对照组和17个未经药物治疗疾病组。见表1。

1.4.2 差异表达基因分析为了分析基因表达值对疾病组相对于健康对照组的影响，根据分组信息采用R包limma进行差异分析[14]。将P值< 0.05的基因设置为差异表达基因，差异分析的结果显示在热点图和火山图中。其中热图使用R的ggplot2包绘制。
1.4.3 焦亡相关基因差异表达基因的分析先前的文献报道的33个焦亡基因[15]，将GSE124272数据集的差异表达基因与焦亡基因集取交集，得到差异表达的焦亡相关基因。使用在线工具维恩图进行可视化。
1.4.4 焦亡相关基因功能及通路富集分析基因本体论分析是对基因进行大规模功能富集研究的常用方法[16]，包括其中包括生物学过程、分子功能和细胞组分。KEGG是一个广泛使用的数据库[17]，用于存储有关基因组、生物途径、疾病和药物的信息。采用R软件包clusterProfiler对椎间盘退变相关差异表达基因进行基因本体论功能注释分析和KEGG通路富集分析[18]。在这项研究中，P值< 0.05被认为有统计学意义。
1.4.5 基因集富集分析由于常规富集分析(基因本体论、KEGG)侧重于比较两组间的基因表达差异，集中关注少数显著上调或下调的基因，可能导致忽视一些关键信息，因此需要其他的富集方法进行补充。基因集富集分析可检测出不显著但是一致的差异表达趋势的基因集，同时为了研究不同分组之间生物过程的差异，使用基于椎间盘退变患者基因表达谱数据集进行了基因集富集分析[15]。基因集富集分析是一种计算方法，用于分析特定基因集在2种生物学状态之间是否具有统计学差异，通常用于估计表达数据集样本中途径和生物过程活性的变化。从MSigDB数据库下载了“c2.cp.kegg.v6.2.-symbols”基因集用于基因集富集分析[19]，false discovery rate (FDR) < 0.25被认为显著富集。
1.4.6 免疫浸润分析 CIBERSORT是基于线性支持向量回归的原理对转录组表达矩阵进行反卷积[20]，从而在混合的细胞中估算出免疫细胞的组成和丰度。将基因表达矩阵数据上传到CIBERSORTx(https://cibersortx.stanford.edu/)，结合LM22 特征基因矩阵，过滤输出P < 0.05的样本，得出免疫细胞浸润丰度值。使用R语言“ggplot2”包绘制柱状图展示22种免疫细胞浸润在每个样本中的分布。然后将差异表达的细胞焦亡相关基因与免疫细胞进行相关性分析。
1.4.7 构建蛋白质-蛋白质相互作用网络 STRING数据库是一个用于搜索已知和预测蛋白质相互作用的数据库[21]，其中包括2 031个物种，960万个蛋白质和138万个蛋白质-蛋白质相互作用。使用STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络，并将参数设置为：系数0.4。蛋白质-蛋白质相互作用结果从STRING数据库导出并由Cytoscape可视化[21]。此外，采用CytoHubba插件来分析基因集富集分析网络中的Hub基因[22]。
1.4.8 椎间盘退变生物标记物的鉴定分析与椎间盘变性相关的差异表达焦亡基因，并使用GSE150408数据集验证了差异表达焦亡基因的表达。使用R包pROC绘制差异表达焦亡基因的ROC曲线[23]，并计算曲线下
面积。
1.4.9 细胞培养为了验证生物信息学分析所得椎间盘退变焦亡相关Hub基因及NLRP3在椎间盘退变中是否存在表达差异，进行基础实验。由于椎间盘最主要的结构为髓核组织，故从Procell(中国湖北)购买健康人髓核细胞(CP-H097)和椎间盘退变人髓核细胞(CP-H170)，并在DMEM中培养，每三四天换液，培养基包括体积分数10% 胎牛血清和1%青霉素及链霉素。细胞在37 ℃和体积分数5%CO2中培养，原代细胞贴壁后7-
14 d长满皿底，随后进行传代，实验选取传代3代以内的细胞。
1.4.10 RNA分离和实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR) Trizol(TaKaRa，东京，日本)提取总RNA，使用SuperScriptTM Ⅱ反转录酶试剂盒(TaKaRa，东京，日本)反转录为cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq进行qRT-PCR检测(TaKaRa Bio，Inc，日本大津)。变性、退火和延伸的条件如下：95 ℃，30 s，95 ℃，5 s 45次循环，60 ℃，20 s。通过2 ΔΔCt法分析相对基因水平，并通过GAPDH进行归一化。引物如下：
IL-1β为5′-CCA GGG ACA GGA TAG AGC-3ʹ(正向引物)和5′-TTC AAC AGG AGG AGG TAC AG-3ʹ(反向引物)；
NLRP3为5′-GAT CTT CGC TGC GAT CAC A-3ʹ(正向引物)和5ʹ-GGG ATT CGA AAC ACG TGC ATT A-3ʹ(反向引物)；
Caspase-1为5ʹ-GCC TGT TCC TGT GAT GGA G-3ʹ(正向引物)和5ʹ-TGC CCA CAG ACA TTC ATA CAG TTT C-3ʹ(反向引物)；
AIM2为5ʹ-TGT GGA GGT CAC CAG TTC CT-3 ʹ(正向引物)和5ʹ-ACC TCC ATG GCC TCT T-3 ʹ(反向引物)；
Caspase-5为5′-TAG ACT CTG CGA AAG AAT CGC GTG GCT CAT CAT-3′(正向引物)和5′-CAC CTC TGC AGG CCT GGA CAA TGA TGA C-3′(反向引物)；
NLRC4为5′-TTG AAG GCG AGT GGC AAA G-3′(正向引物)和5′-GGC GCT TCT CAG GTG GAT G-3′(反向引物)；
内部参考对照的是人GAPDH，5’-CCT GCA CCA CCA CCA ACT GCT TA-3’(正向引物)，5ʹ-GGC CAT CCA CAG TCT TCT GAG-3’(反向引物)。
1.5 主要观察指标 qRT-PCR检测各组髓核细胞焦亡相关基因(IL1-β、Caspase-1、AIM2、Caspase-5、NLRC4、NLRP3)的表达差异。
1.6 统计学分析所有数据计算和统计分析均使用 R 编程(https://www.r-projec t.org/，版本 4.0.2)执行。对于两组连续变量的比较，采用独立Student t检验估计正态分布变量的统计显著性，采用Mann-Whitney U检验(即Wilcoxon秩和检验)分析非正态分布变量之间的差异。使用R的pROC包绘制ROC曲线，并计算曲线下面积。所有统计P值均为双侧，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经上海中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

椎间盘退变是一种慢性退行性疾病，发病隐匿，早期仅表现为下腰痛[24-25]。椎间盘退变的病因是多因素的，主要包括遗传原因、不健康的生活方式以及衰老等[26-27]，因此随着年龄的增长，椎间盘退变的发病率急剧增加。这种疾病预后不良，可导致一系列脊柱疾病如椎间盘突出症、椎管狭窄和脊柱侧弯[28]，晚期椎间盘退变除了手术之外，缺乏可靠的治疗方法。椎间盘退变主要的病理特征包括髓核细胞的衰老或死亡、炎症、细胞外基质的丢失等[29-31]，这些变化进一步导致椎间盘功能及结构的破坏。细胞焦亡作为一种炎症性细胞程序性死亡，存在于包括椎间盘退变在内很多疾病的不同阶段，其特征是细胞膜破裂、促炎因子释放，近年来不断有研究发现通过影响髓核细胞焦亡能够延缓椎间盘退变发生发展[32]。至2022年，GE等[33]认为焦亡在椎间盘退变中的综合作用尚未完全确定，他们对焦亡的特点进行总结，并归纳细胞焦亡对椎间盘退变病理进展的影响，讨论可通过靶向干预焦亡来治疗椎间盘退变的措施。这一研究为细胞焦亡在椎间盘退变发病机制中的关键作用提供了新的见解，但是缺乏更加可靠的科学证据，并且缺乏具体的应用。此次研究在此基础上综合分析椎间盘退变与焦亡相关基因，筛选出能够具体应用于临床诊断及治疗的靶基因，并通过数据集和基础实验进行验证，获得较为可靠的科学证据。
结果表明椎间盘退变相关焦亡基因主要是NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白家族、Caspases家族、IL-1β、GSDMA等，其中Caspases、IL-1β与椎间盘退变的发生发展有密切联系。研究表明白细胞介素1β表达上调可促进椎间盘退变病理过程，包括炎症、基质破坏、细胞衰老及焦亡等[4]。而Caspases家族广泛参与细胞死亡过程，其中Caspase-1、Caspase-3、Caspase-7在椎间盘退变细胞死亡和炎症进展中发挥重要作用[34]。研究表明降低IL-1β、Caspase-3、P53、Bax等的表达能够抑制椎间盘退变的进展[35]。
基因本体论分析得知椎间盘退变焦亡相关基因参与的生物过程有IL的生成、分泌、炎症小体复合物形成、胞质内半胱氨酸酶活性调节等。KEGG分析得到椎间盘退变焦亡相关基因主要富集在NOD样受体信号通路以及一些菌种的感染。同时为了补充常规富集分析可能忽略的一些关键信息，采用基因集富集分析检测差异表达趋势不显著但是一致的集合，得到椎间盘退变焦亡相关基因可能主要富集在氨基酸代谢、P53转录调节、细胞周期调节、DNA修复等。NOD样受体信号通路参与炎症反应、血管生成、肿瘤发生、细胞衰老，在细胞生长、存活以及炎症介导中发挥重要作用，已有证据表明调节NOD样受体信号通路也是治疗椎间盘退变的重要途径。一项研究显示，木兰花碱通过灭活核因子κB通路和NLRP88炎症小体来缓解M3极化巨噬细胞介导的髓核细胞损伤[36]，表明抑制NOD样受体能够缓解椎间盘退变进展。另有一项体内实验发现羟基酪醇能够抑制核因子κB和NLRP3炎症小体，改善椎间盘退变及其神经性疼痛。此外，经典的细胞焦亡途径是炎症小体激活，pro-caspase1活化为Caspase-1并切割GSDMD，使其释放N端结构域，形成细胞膜孔诱导细胞焦亡；同时Caspase-1还能激活并释放IL-1、IL-18，引发炎症反应[37]。此外也存在Caspase-5等非经典焦亡途径。髓核细胞过度焦亡，其合成细胞外基质的能力受损，最终导致整个椎间盘结构退变、功能丧失。同时，椎间盘虽然是无血管组织，但是椎间盘退变过程中物理屏障的损伤、髓核神经支配改变和血管化都会使椎间盘暴露于免疫系统，引起由免疫细胞及其介质诱导的免疫反应，炎症因子大量释放、免疫细胞浸润是椎间盘持续退变以及疼痛持续加重的重要原因之一。研究证实通过抑制肿瘤坏死因子α诱导的炎症反应和减少炎症细胞因子(包括IL-6)的表达，可以延缓椎间盘退变的进展。同时椎间盘退变变性的特征是细胞分泌的促炎细胞因子肿瘤坏死因子、IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-17水平升高；这些细胞因子促进细胞外基质降解和趋化因子的产生，释放的趋化因子促进免疫细胞浸润和活化，进一步放大炎症级联反应[38]，这与作者对椎间盘退变数据集的免疫浸润评估结果一致。这些分析结果为下一步研究提供了参考，作者利用基因集富集分析网络进一步筛选发挥核心作用的Hub基因，并验证这些Hub基因在人类正常椎间盘和退变椎间盘中是否具有表达差异。结果表明IL-1β、Caspase-5、NLRC4在退变椎间盘中显著上调，进一步说明了椎间盘退变过程与焦亡密切相关，并且伴随着炎症反应、免疫细胞浸润以及NOD样受体信号通路的激活。
为了筛选出能够用于临床诊断或治疗的分子标志物，将2个椎间盘退变数据集与焦亡数据集取交集，筛选出一个交集基因NLRP3，ROC曲线提示此基因具有诊断价值。但是qRT-PCR结果显示此基因在退变椎间盘中无显著变化，其原因可能是NLRP3在椎间盘退变不同时期的表达不同。椎间盘退变不同时期，细胞焦亡、炎症及NOD样受体激活的作用可能各不相同。椎间盘退变形成阶段椎间盘受应力作用或衰老影响其终板血运减少，椎间盘营养供应不足，此期可表现为细胞凋亡及细胞外基质减少，仅伴随轻微炎症或少量炎症小体形成。椎间盘退变发展阶段时退变加重，纤维环破裂，炎症反应加剧，微血管及神经长入椎间盘，此期可有免疫细胞浸润，NOD样受体激活，大量细胞发生焦亡，表现为疼痛加剧。随着成纤维细胞等的修复，瘢痕形成，椎间盘可能又趋于稳定，表现为细胞焦亡及炎症减轻。因此不同时期椎间盘退变样本细胞焦亡及炎症反应程度可能有所不同，未来将进行进一步研究以确认细胞焦亡在椎间盘退变不同时期的应用价值。
此次研究尚有一定局限：首先，因技术原因，现有数据集未能涵盖所有椎间盘退变差异基因，这对筛选结果可能造成一定偏倚；其次，筛选出的椎间盘退变焦亡相关基因需要进一步临床样本的深入研究。未来将从临床预测模型研究、靶向干预焦亡相关基因治疗椎间盘退变等方面进行下一步探索。
综上所述，此次研究通过生物信息学分析和细胞实验阐明了IL-1β、NLRP3、Caspase-5和NLRC4等分子具有椎间盘退变潜在的诊断及靶向治疗价值，为制定新的椎间盘退变诊断和治疗策略提供了参考依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

椎间盘退变相关焦亡基因的综合分析

Integrative analyses of pyroptosis-related genes associated with intervertebral disc degeneration

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