甲基丙烯化明胶微球缓释Kartogenin修复髓核退变的体外评估

doi:10.12307/2024.247

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (5): 724-730.doi: 10.12307/2024.247

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甲基丙烯化明胶微球缓释Kartogenin修复髓核退变的体外评估

田鑫1，2，刘滔1，杨惠林1，2，何帆1，2

1苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006；2苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215007

收稿日期:2022-12-09 接受日期:2023-02-08 出版日期:2024-02-18 发布日期:2023-08-16
通讯作者: 何帆，博士，研究员，博士生导师，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215006；苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215007
作者简介:田鑫，男，1996年生，河南省商丘市人，汉族，在读硕士，主要从事干细胞、组织工程和再生医学研究。
基金资助:
江苏省自然科学基金(BK20220046)，项目负责人：何帆

In vitro evaluation of sustained release Kartogenin by gelatin methacryloyl microspheres for repairing nucleus pulposus degeneration

Tian Xin1, 2, Liu Tao1, Yang Huilin1, 2, He Fan1, 2

1Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; 2Institute of Orthopedics at Soochow University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China

Received:2022-12-09 Accepted:2023-02-08 Online:2024-02-18 Published:2023-08-16
Contact: He Fan, PhD, Researcher, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics at Soochow University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China
About author:Tian Xin, Master candidate, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; Institute of Orthopedics at Soochow University, Suzhou 215007, Jiangsu Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK20220046 (to HF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Kartogenin：2012年发现的脂溶性小分子药物，能有效促进间充质干细胞成软骨分化，分泌软骨样细胞外基质，主要通过调节核心结合因子β亚基-RUNX1等信号通路发挥其促软骨分化的作用。
甲基丙烯化明胶微球：甲基丙烯化明胶通过微流控技术制备而来的高度分散且大小均一的水凝胶微球，表面富有多种易于改性的活性基团和细胞黏附位点，可用于细胞3D培养和药物搭载。

背景：细胞外基质合成与降解的失衡是髓核退变的主要原因，小分子药物Kartogenin(KGN)可恢复基质合成和降解的平衡。利用合适的载药系统实现KGN的缓释对KGN发挥长期有效的治疗至关重要。

目的：用甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)包裹KGN，通过微流控技术制备成可注射的水凝胶微球，探究其生物相容性和对髓核细胞生物学功能的影响。
方法：将β-环糊精(β-cyclodextrins，β-CD)与KGN混合成包合物，与10%GelMA按1∶9的体积混合，利用微流控技术制备可注射水凝胶微球GelMA@β-CD@KGN，扫描电镜表征微球的微观形貌，检测水凝胶微球浸泡于PBS中1个月的药物释放情况。提取SD大鼠髓核细胞，将第1代细胞分3组培养：对照组单独培养髓核细胞，另外两组分别将GelMA@β-CD微球、GelMA@β-CD@KGN微球与髓核细胞共培养，利用CCK-8法检测细胞增殖，活死细胞染色检测细胞存活。分别用含有白细胞介素1β和不含白细胞介素1β的完全培养基将髓核细胞与两种微球共培养，采用RT-PCR法检测髓核细胞基质合成蛋白和分解蛋白的mRNA表达。

结果与结论：①扫描电镜下可见，冻干后的GelMA@β-CD@KGN微球为规则的球形，保持高度分散且大小均一，形状饱满；GelMA@β-CD@KGN微球体外可持续释放药物，至30 d时药物释放量达到总量的62%；②活死细胞染色显示，GelMA@β-CD@KGN可保持髓核细胞的活性；CCK-8检测显示，GelMA@β-CD@KGN可促进髓核细胞的增殖；③在含或不含白细胞介素1β的完全培养基中，GelMA@β-CD@KGN微球组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达均高于GelMA@β-CD微球组(P < 0.05，P < 0.01)，基质金属蛋白酶13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5的mRNA表达均低于GelMA@β-CD微球组(P < 0.01)；④结果表明，GelMA@β-CD@KGN微球具有良好的生物相容性和药物缓释能力，作为载药系统是一种具有广阔应用前景的生物材料。

https://orcid.org/0000-0003-0289-9737(田鑫)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 椎间盘, 髓核, 微球, 甲基丙烯化明胶, 微流控, Kartogenin, 载药系统

Abstract: BACKGROUND: The imbalance of matrix synthesis and degradation is the main cause of nucleus pulposus degeneration. Small molecule drug Kartogenin (KGN) can restore the balance of matrix synthesis and degradation. Sustained release of KGN using an appropriate drug delivery system is essential for the long-term and effective treatment of KGN.
OBJECTIVE: To prepare the injectable hydrogel microspheres by encapsulating KGN with gelatin methacryloyl (GelMA) by microfluidic technology and to investigate the biocompatibility and biological function of nucleus pulposus cells.
METHODS: β-Cyclodextrins (β-CD) and KGN were mixed firstly and then mixed with 10% GelMA at a volume of 1:9. Injectable hydrogel microspheres GelMA@β-CD@KGN were prepared by microfluidic technology. The micromorphology of the microspheres was characterized using a scanning electron microscope. The drug release of hydrogel microspheres immersed in PBS within one month was measured. Nucleus pulposus cells were isolated from SD rats and passage 1 cells were cultured in three groups. In the control group, nucleus pulposus cells were cultured separately. In the other two groups, GelMA@β-CD microspheres and GelMA@β-CD@KGN microspheres were co-cultured with nucleus pulposus cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 assay and cell survival was detected by live/dead cell staining. Cells were cultured by two complete media with and without interleukin-1β with two kinds of microspheres. mRNA expressions of matrix synthesis and decomposing proteins in nucleus pulposus cells were detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Under the scanning electron microscope, the GelMA@β-CD@KGN microspheres after lyophilization were regularly spherical, highly dispersed, uniform in size and full in shape. GelMA@β-CD@KGN microspheres sustained drug release in vitro, reaching 62% of the total drug release at 30 days. (2) Live/dead cell staining showed that GelMA@β-CD@KGN could maintain the activity of nucleus pulposus cells. CCK-8 assay showed that GelMA@β-CD@KGN could promote the proliferation of nucleus pulposus cells. (3) In the complete media with and without interleukin-1β, mRNA expression of aggrecan and type II collagen was higher in the GelMA@β-CD@KGN microsphere group than that in the GelMA@β-CD microsphere group (P < 0.05, P < 0.01); mRNA expression of matrix metalloproteinase 13 and platelet reactive protein disintegrin metallopeptidase 5 was lower than that in the GelMA@β-CD microsphere group (P < 0.01). (4) These findings indicate that GelMA@β-CD@KGN microspheres have good biocompatibility and sustained drug release ability. As a drug delivery system, it is a kind of biomaterial with broad application prospects.

Key words: intervertebral disc, nucleus pulposus, microsphere, gelatin methacryloyl, microfluidic, Kartogenin, drug delivery system

中图分类号:

田鑫, 刘滔, 杨惠林, 何帆. 甲基丙烯化明胶微球缓释Kartogenin修复髓核退变的体外评估[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 724-730.

Tian Xin, Liu Tao, Yang Huilin, He Fan. In vitro evaluation of sustained release Kartogenin by gelatin methacryloyl microspheres for repairing nucleus pulposus degeneration[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(5): 724-730.

图/表（结果） 8

2.1 髓核细胞的培养经胶原酶消化后的髓核组织碎块，在培养皿中培养第3天，可以看到髓核细胞从髓核组织中迁移到板底增殖，低倍镜下以包含大量空泡的髓核组织为中心髓核细胞向四周增殖，高倍镜下髓核组织含有大量空泡，见图1。

2.2 KGN干预对髓核细胞的影响 CCK-8检测显示，培养第1天，4组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第3天，与0 μmol/L组比较，0.1 μmol/L和1 μmol/L组细胞增殖吸光度值升高(P < 0.05，P < 0.01)；培养第5天，与0 μmol/L组比较，0.1 μmol/L和1 μmol/L组细胞增殖吸光度值升高(P < 0.01)，见图2A。
qRT-PCR检测显示，与0 μmol/L组比较，0.01 μmol/L组聚集蛋白聚糖的mRNA表达上调17%(P < 0.05)，0.1 μmol/L组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达分别上调53%和57%(P < 0.01)，1 μmol/L组聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达分别上调62%和97%(P < 0.01)，见图2B。

2.3 水凝胶微球的粒径在明场下观察拍照，两种微球均为规则的球形，且保持高度分散且大小均一，形状饱满，两种微球具体表现见图3A；通过 Image J分别计算两种微球的直径并绘制成柱状图，见图3B，直径大小满足可注射条件。

2.4 水凝胶微球的形貌通过倒置显微镜在高倍镜下观察微球的形态，两种微球均为光滑透明的完整球形，粒径大小无明显差别，见图4A，通过扫描电镜对冷冻干燥后的两种微球进行观察，与光镜观察结果类似，微球表面光滑形状规整，见图 4B，说明两种微球在形貌上无明显差别，可排除大小、形态、表面物质对后续实验的干扰。

2.5 水凝胶微球的生物相容性通过CCK-8和活死染色实验比较两种微球的生物相容性。CCK-8检测显示，培养第1天，3组细胞增殖吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)；培养第3，5天，GelMA@β-CD@KGN微球组细胞增殖吸光度值高于对照组、GelMA@β-CD微球组(P < 0.01)，见图5A。
细胞活死染色显示，培养第1，3，5天，3组细胞增殖活性无明显差别，见图5B。

2.6 水凝胶微球的药物释放能力在研究微球与髓核细胞共培养时是否对髓核细胞产生影响之前，首先比较了不含环糊精的GelMA@KGN微球和包含环糊精的GelMA@β-CD@KGN的微球对KGN缓释能力的差别，见图6，结果显示GelMA@KGN微球释放药物较快，前5 d的释放量就达到68%，随后缓慢释放，最终释放量可达总量的70%左右；GelMA@β-CD@KGN微球的药物释放速率相对稳定，在第10天释放速率开始减慢，最终释放量可达到总量的62%。

2.7 水凝胶微球对髓核细胞基质合成的影响 qRT-PCR检测显示，与GelMA@β-CD组相比，GelMA@β-CD@KGN组聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的mRNA表达分别上调了15%，32%(P < 0.05，P < 0.01)，白细胞介素1β+GelMA@β-CD组聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的mRNA表达分别下调了51%，50%(P < 0.01)，白细胞介素1β+GelMA@β-CD@KGN组聚集蛋白聚糖与Ⅱ型胶原的mRNA表达分别下调了25%，11%(P < 0.01)，见图7A。
免疫荧光染色显示，与GelMA@β-CD组相比，GelMA@β-CD@KGN组Ⅱ型胶原荧光信号增强，白细胞介素1β+GelMA@β-CD组、白细胞介素1β+GelMA@β-CD@KGN组Ⅱ型胶原荧光信号减弱，白细胞介素1β+GelMA@β-CD@KGN组Ⅱ型胶原荧光信号强于白细胞介素1β+GelMA@β-CD微球组，见图7B、C。

2.8 水凝胶微球对髓核细胞基质降解酶表达的影响 qRT-PCR检测显示，与GelMA@β-CD组相比，GelMA@β-CD@KGN组基质金属蛋白酶13与ADAMTS5的mRNA表达分别下调了30%，12%(P < 0.01)，白细胞介素1β+GelMA@β-CD组基质金属蛋白酶13与ADAMTS5的mRNA表达分别上调了10%，32%(P < 0.05，P < 0.01)，白细胞介素1β+GelMA@β-CD@KGN组基质金属蛋白酶13与ADAMTS5的mRNA表达分别下调了16%，18%(P < 0.01)，见图8。

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引言

全球有超过2/3的人口患有下腰痛[1]，已经成为当今致残致失能的首要原因[2]，造成下腰痛最主要的原因是椎间盘退变[3]。椎间盘是一种复合结构，由上下终板、中央髓核及包裹髓核的纤维环构成[4]，而髓核组织退变是椎间盘退变的主要原因。发生髓核退变时，髓核细胞外基质降解，尤其是蛋白多糖的丢失，造成水分丢失、力学性能紊乱，最终造成椎间盘结构和功能的丧失[5]。
Kartogenin(KGN)是2012年发现的小分子药物，可通过调节核心结合因子β亚基-RUNX1等信号通路促进间充质干细胞成软骨分化修复软骨缺损[6-7]。软骨与髓核结构相似，尤其是细胞外基质的成分，因此近年来KGN也被用于髓核退变的治疗。VAN DEN BULCKE等[8]制备的缓释KGN的壳聚糖-透明质酸水凝胶成功让脂肪干细胞向髓核样细胞分化。DONG等[9]在ZHU的基础上开发了缓释KGN的基于酯酶响应的罗布麻素(APO)两亲性聚合物胶束，与脂肪干细胞共混注入到退变的大鼠椎间盘，在体内实现椎间盘退变的治疗。利用合适的载药系统实现KGN的缓释对KGN发挥长期有效的治疗至关重要，然而目前可注射的胶束或水凝胶机械性能较差，无法满足椎间盘的力学要求，大块的水凝胶需要切开植入，会造成更大的创伤，因此，将水凝胶做成可注射的微凝胶，既能满足微创需求又能保持水凝胶本身的性质，具有良好的应用前景。
甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)是一种新颖的水凝胶材料，通过对明胶接枝甲基丙烯酸酐而合成，在光引发剂的作用下，GelMA可以共价交联成水凝胶[10]。GelMA水凝胶保留了胶原和明胶的一些特性，如RGD细胞黏附域、含水量和生物可降解性，使其具有类似天然髓核组织的特性。然而，GelMA水凝胶具有良好的机械性能，但不具备可注射性，无法通过微创手段植入相应部位。采用微流控技术制备的水凝胶微球因其较高的表面积体积比，能够广泛接触微环境，同时微小的尺寸可直接注射到损伤部位，这有利于微创递送细胞和生物制剂[11]。KGN是疏水性小分子药物，很难被高度亲水的水凝胶网络搭载[12]。利用β-环糊精(β-cyclodextrins，β-CD)外部亲水、内部疏水的碗装结构[13]，可以与疏水的客体分子在水溶液中形成络合物进行药物的包载。XU等[14]利用β-CD的“主客体”结构，一方面促使明胶动态成胶，另一方面多余的β-CD可用于包载KGN，促进水凝胶包裹的骨髓间充质干细胞软骨样分化，并在兔软骨缺损中起到修复效果。此次实验先将β-CD与KGN混合进行充分包载，再与GelMA溶液共混通过微流控机器制备GelMA@β-CD@KGN微球，并在体外与髓核细胞共培养探究KGN对髓核细胞基质合成能力的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于 2021年9月至2022年12月在苏州大学附属第一医院骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6周龄雌性SD大鼠10只，体质量(200.0±5.6) g，购自苏州大学动物中心，动物质量合格证号：SYXK(苏)2017-0043。饲养于特定的无病原体环境中，22-24 ℃恒温，50%-60% 湿度，12 h光照/12 h黑暗交替循环，自由获取所需饮食。所有动物手术和实验程序均在苏州大学伦理委员会批准下进行(批准号为SUDA20221229A01)，同时严格遵守实验室动物护理和使用的指导方针。
1.3.2 实验试剂和仪器戊巴比妥(麦克林，上海，中国)；明胶(Macleans，上海，中国)；甲基丙烯酸酐(Aladdin，上海，中国)；KGN (Sigma-Aldrich)；Ⅱ型胶原酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO， USA)；胰酶、胎牛血清、PBS、F12培养基 (Hyclone，美国)；DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)；反转录试剂、荧光定量 PCR 试剂盒 (Takara，日本)；Ⅱ型胶原抗体(abcom，美国)；Ⅱ型胶原酶(Sigma-Aldrich，美国)；40 g/L多聚甲醛、牛血清白蛋白(Beyotime，中国海门)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；精确微量注射泵-LSP01-1A(保定市兰格恒流泵有限公司，中国)；倒置荧光显微镜(Zeiss Axiovert，德国)；扫描电子显微镜(HitachiS-4800，日本)；磁力搅拌器(司乐仪器有限公司，中国)；离子溅射仪(北京中科科仪，中国)；全波长酶标仪(BioTek，美国)；CO2细胞培养箱、生物超净台(Thermo，美国)；高速离心机(Eppendorf，德国)；Nanodrop 2000光谱仪(Thermo Fisher Scientific)；4 ℃冰箱(无锡松下冷机有限公司，中国)；-80 ℃电冰箱(青岛海尔股份有限公司，中国)；培养皿、培养孔板 (Corning，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 大鼠髓核细胞的培养采用过量3%戊巴比妥钠腹腔注射处死SD大鼠10只，从大鼠尾盘分离髓核，用0.2%Ⅱ型胶原酶在37 ℃孵育1 h。孵育后，通过离心去除胶原酶，将残余的髓核组织块以及消化下来的髓核细胞培养于含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中。每3 d更换培养基，取第1代髓核细胞用于后续实验。
1.4.2 KGN对髓核细胞的影响将胰酶消化得到的髓核细胞按3 000个/孔的密度种植在96孔板内，分4组干预，分别加入0，0.01，0.1，1 μmol/L的KGN，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中。培养 1，3，5 d后，吸取上清，用 PBS 清洗后加入10%CCK-8工作液110 μL，避光于培养箱中孵育1 h，每孔吸取90 μL至新的96 孔板中用来检测，使用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。培养3 d后，采用qRT-PCR检测聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原的mRNA表达，检测见1.4.6中的内容。
1.4.3 GelMA水凝胶的制备将30 g明胶溶于300 mL PBS中，并在60 ℃搅拌直至溶解。然后将16 mL甲基丙烯酸酐避光缓慢加入到明胶溶液中，反应持续2 h后，加入800 mL的PBS终止反应。将所得溶液在12 kD的透析袋中透析7 d，去除盐分和未参与反应的甲基丙烯酸酐。透析后的溶液冻干48 h，得到白色多孔泡沫，并在-80 ℃储存。
1.4.4 水凝胶微球的制备
GelMA@β-CD微球：称取50 mg的β-CD溶解于350 μL的DMSO中，取出100 μL与900 μL的10%GelMA溶液混合作为用于分散成微球的水相，以10 mL的司班80与40 mL的肉豆蔻异丙酯混合溶液作为油相，调节水相与油相的相对速度，油相的速度为水相的50倍。在油相的高速切割下，水相在液滴出口处形成连续均匀的水凝胶微球，并在402 nm的紫外光照下固化成稳定均一的球体。经体积分数75%乙醇和去离子水将微球表面的油清洗后冷冻干燥。
GelMA@KGN微球：称取15 mg的KGN溶于100 μL的DMSO中，与900 μL的10% GelMA溶液混合作为用于分散成微球的水相，将10 mL的司班80与40 mL的肉豆蔻异丙酯混合溶液作为油相，后续的流速、清洗方法和冷冻保存与GelMA@β-CD微球相同。
GelMA@β-CD@KGN微球：称取15 mg的KGN溶于50 μL的DMSO中，将50 mg的β-CD溶解于350 μL的DMSO中，将50 μL含KGN的DMSO溶液与350 μL含β-CD的DMSO溶液混合均匀并取出100 μL，与900 μL的10%GelMA溶液混合作为用于分散成微球的水相。油相为10 mL的司班80与40 mL的肉豆蔻异丙酯混合溶液，后续的流速、清洗方法和冷冻保存与GelMA@β-CD微球相同。
1.4.5 微球的表征
微球粒径分布：用倒置显微镜下观察拍照，记录GelMA@β-CD、GelMA@β-CD@KGN微球的形态大小，并通过软件Image J测量照片中微球粒径大小，并作出统计。
微球的表面形态：将GelMA@β-CD、GelMA@β-CD@KGN微球冷冻干燥，采用离子溅射仪对其表面喷金，然后使用扫描电镜在 15 kV电压下进行观察并拍照。
药物释放：将100 μL的GelMA@KGN和GelMA@β-CD@KGN微球分别加入6孔板内，每孔加入1 mL去离子水4 ℃保存，在特定的时间收集上清并更换新的去离子水，使用Nanodrop 2000光谱仪在波长280 nm下测定KGN从微球中释放的情况。
1.4.6 微球与髓核细胞共培养实验
CCK-8法检测细胞增殖：将胰酶消化得到的髓核细胞按3 000个/孔的密度种植在96孔板内，分3组干预，以单纯的细胞培养为对照组，另两组分别加入GelMA@β-CD、GelMA@β-CD@KGN微球，250 μg/孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中。培养 1，3，5 d后，吸取上清，用PBS清洗后加入10%CCK-8工作液 110 μL，避光于培养箱中孵育1 h，每孔吸取90 μL至新的96 孔板中用来检测，使用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。
活死细胞染色：观察髓核细胞生长融合到70%-80%时，用胰酶消化下来，以10 000个/孔的密度种植在24 孔板内，分成3组处理：以单纯的细胞培养为对照组，另两组分别加入GelMA@β-CD、GelMA@β-CD@KGN微球，1 mg/孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中。培养1，3，5 d后，吸弃培养基，用PBS清洗3遍，用活死染色工作液避光室温孵育髓核细胞30 min，吸弃工作液并用 PBS 清洗3遍，在倒置显微镜下观察细胞生存情况。

qRT-PCR检测：利用qRT-PCR检测髓核细胞合成蛋白聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原及分解蛋白基质金属蛋白酶13、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5(recombinant a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，ADAMTS5)的mRNA表达。将胰酶消化得到的髓核细胞以30 000个/孔的密度种植在6孔板内，待细胞贴壁50%-60%时，分4组干预，分别加入GelMA@β-CD微球、GelMA@β-CD@KGN微球、白细胞介素1β+GelMA@β-CD微球、白细胞介素1β+GelMA@β-CD@KGN微球，试剂均同时加入，微球的加入量为4 mg，白细胞介素1β的质量浓度为10 ng/mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中。培养3 d后，使用Trizol试剂提取髓核细胞内总RNA，按反转录试剂盒说明制备同等浓度的RNA体系，再借助反转录仪经反转录得到cDNA，根据 iTaq Universal SYBR Green Supermix 试剂操作指导，开展扩增测定。RT-PCR反应条件为：95 ℃10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃60 s，40个循环。RT-PCR反应通过CFX96 RT-PCR系统进行。引物设计见表1。

免疫荧光染色：免疫荧光染色观察髓核细胞Ⅱ型胶原的表达。分组及处理同qRT-PCR检测。培养3 d后，取出细胞，置于40 g/L多聚甲醛中室温固定30 min，用0.3%Triton-X 100渗透，经5%牛血清白蛋白封闭液孵育细胞30 min，加入Ⅱ型胶原(1∶500)抗体4 ℃孵育过夜；第2天PBS洗涤，室温下与荧光二抗孵育1 h，并倒置荧光显微镜下观察拍照。
1.5 主要观察指标 GelMA@β-CD@KGN微球与髓核细胞的生物相容性和药物缓释能力，以及在正常和炎症情况下微球对髓核细胞的影响。
1.6 统计学分析采用 SPSS 13.0软件进行统计分析，各项数据以均值±标准误表示。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。 P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

此次实验用β-CD与脂溶性小分子药物KGN混合通过主客体包合形成络合物，再与10% GelMA混合合，利用微流控技术，通过对油相和水相之间速度差的调节，从而调节GelMA@KGN微球的直径，并在体外验证了GelMA@β-CD@KGN微球良好的生物相容性和药物缓释能力，与髓核细胞共培养，在正常环境与白细胞介素1β干预的炎症环境下，可保护髓核的基质合成能力、抑制基质降解。
此次实验将肉豆蔻酸异丙酯与司班80按照4∶1混合为油相、GelMA@β-CD@KGN为水相，在油相为水相50倍的速度差下，油相将水相切割成直径在120 μm左右水凝胶微球，在紫外光的作用下GelMA@β-CD@KGN共价交联形成稳定结构。生物材料的应用与推广很大程度上首先取决于他的生物相容性。GelMA水凝胶类似于细胞外基质[15]，是通过明胶与甲基丙烯酸酐发生取代反应的产物，明胶主要来源于Ⅰ型胶原，与胶原相比，明胶的抗原性显著降低，并且富含精氨酸 (Arg，R)-甘氨酸 (Gly，G)-天冬氨酸 (ASP，D)序列(即 RGD序列)以及基质金属蛋白酶响应序列，有利于细胞的黏附和降解[16-18]。GelMA微球保留了GelMA水凝胶良好的生物相容性和可降解性，KGN是一种无毒且治疗效果随剂量依赖的小分子药物，将GelMA@β-CD@KGN微球与髓核细胞共培养，活死染色和CCK-8检测结果与GelMA@β-CD微球组细胞活力无明显差别，其缓释的KGN对髓核细胞的增殖有一定促进作用。
搭载靶向退行性疾病局部异常微环境来调节细胞外基质代谢平衡的药物，是利用GelMA微球辅助治疗的常见手段。GelMA因其表面易于改性的活性基团(氨基、羧基)可通过物理包裹或化学键的方式负载药物及生物活性因子，如今被广泛应用于药物的负载与缓释。合适直径大小的GelMA水凝胶微球，可通过注射手段在病灶部位实现微创递送、缓控药物的目的，有效解决手术中大面积创伤的困扰[19-20]。BIAN等[21]在GelMA微球表面修饰活性肽APETx2下调髓核细胞酸敏感通道ASIC-3，抑制炎症通路的激活，改善退变的炎症环境达到治疗髓核退变的结果。YANG等[22]利用微流控技术将富勒醇纳米晶体整合到水凝胶微球中，构建了富勒-水凝胶微流控球，改善颅骨缺损氧化还原失衡的微环境，促进干细胞修复颅骨缺损。椎间盘退变的最早发生在髓核中[22]。髓核位于椎间盘中央，富含水分呈凝胶状，在椎骨之间起到减震抗压的作用，围绕髓核的纤维环可限制髓核的位置以及抵抗椎骨间牵拉，2个软骨终板位于椎间盘两侧，将椎体与椎间盘链接，同时为髓核和纤维环提供营养物质和代谢废物扩散[23]。
髓核组织包括髓核细胞和细胞外基质两大部分。髓核细胞主要由脊索细胞和软骨样细胞构成，脊索细胞体积较大，含大量空泡，随着椎间盘的成熟和老化，脊索细胞会逐渐变成体积较小的软骨样细胞[24]。髓核细胞外基质富含带阴离子的蛋白多糖和Ⅱ型胶原[25]，带负电的蛋白多糖吸水形成静水压构建髓核组织的力学性能，在椎骨之间执行抗压负载的功能[26]。衰老、创伤、异常应力会导致髓核组织发生退变。在髓核退变过程中，炎症因子白细胞介素1β及肿瘤坏死因子α可激活基质降解酶基质金属蛋白酶13、基质金属蛋白酶3、ADAMTS5的产生，导致髓核细胞外基质中的胶原蛋白和蛋白多糖降解[27]。蛋白多糖的降解直接导致髓核组织静水压下降，破坏髓核组织的力学环境，进而整个椎间盘发生结构和功能上的紊乱。有多个研究报道KGN可改善软骨退变环境下基质合成与降解的失衡[28-30]。HUANG等[31]已证明，利用白细胞介素1β或肿瘤坏死因子α可在体外模拟髓核退变环境，而KGN可在炎症环境下促进人和小鼠髓核细胞的细胞外基质合成。HOU等[32]也发现KGN未能进一步促进成体软骨细胞的基质分泌，而在白细胞介素1β诱导的炎症环境下可恢复被损害的基质合成能力。通过微流控技术成功制备GelMA@β-CD@KGN微球，在正常情况和白细胞介素1β体外诱导髓核退变的微环境下与髓核细胞共培养，利用PCR在核酸水平上证明，在正常情况和炎症情况下KGN都可以保护髓核细胞的基质合成能力、抑制基质基质降解酶的表达。
KGN为脂溶性小分子药物，亲水性的水凝胶网络难以对其包封，更无法实现KGN的缓控释放[33]。β-CD及其衍生物具有内疏水、外亲水的特殊结构，疏水内腔使其能够选择性地结合各种疏水性客体分子而形成主客体识别的包合物。ZHANG等[34]利用β-CD包裹KGN并与巯基化的明胶混合，通过巯基金离子的金属配位形成能缓释KGN的可注射自愈合水凝胶，并且在兔的软骨缺损中实现体内修复。然而，应用在椎间盘的生物材料需要与椎间盘具有相似的力学性能，同时具有低磨损性和可注射性[35]。目前可注射水凝胶面临着机械性能不足的缺点，无法满足髓核组织的生理功能，体积较大具有良好机械性能的水凝胶只能通过切开植入的方式运送到椎间盘，加剧了组织损伤[36]。水凝胶微球是通过将水凝胶分散成体积较小的微凝胶，达到可注射方式将凝胶运送至病变组织。水凝胶微球保持了水凝胶本身的机械性能、生物相容性等优点，具备可注射性，同时扩大的表面积体积比可广泛接触病变的微环境，具有水凝胶无法比拟的优势。GelMA水凝胶具备良好的机械性能，并且研究表明GelMA可促进髓核细胞的基质合成[37]，已被广泛应用于软骨组织工程[38]。此次实验通过微流控技术构建GelMA@β-CD的微球复合体系，结合水凝胶与β-CD各自的优势，不仅实现对KGN的包封，β-CD与KGN之间的主客体包合还能使KGN缓慢释放长达1个月。
当然，实验还有很多不足之处：①对于KGN发挥基质合成作用内部的分子机制尚未探索，ZHANG等[34]和HOU等[32]分别采用KGN治疗兔软骨缺损和大鼠关节炎，在证明KGN促进基质合成的同时，发现KGN可增强软骨细胞的线粒体功能及抗氧化能力，并且转录因子NRF2发挥着重要作用。然而KGN在髓核细胞发挥治疗效果的分子机制尚未探究，后续实验将进行内部分子机制的探索，进一步研究KGN对髓核细胞的抗氧化功能以及线粒体功能的响。②GelMA@β-CD@KGN微球在体外发挥了稳定的治疗效果，治疗效果需要进一步在体内验证，将会在后续实验中进一步补充说明。
结论：KGN作为小分子药物可促进髓核细胞基质的合成。利用GelMA@β-CD的复合体系可将脂溶性的小分子KGN包裹在水凝胶中，并实现长达1个月的药物缓释。将GelMA@β-CD@KGN微球在正常培养和白细胞介素1β诱导的炎症环境下与髓核细胞共培养，均可促进髓核细胞的基质合成蛋白的表达、抑制基质降解酶的表达。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

甲基丙烯化明胶微球缓释Kartogenin修复髓核退变的体外评估

In vitro evaluation of sustained release Kartogenin by gelatin methacryloyl microspheres for repairing nucleus pulposus degeneration

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