褪黑素抑制过氧化氢诱导人髓核细胞的损伤

doi:10.12307/2024.296

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2180-2185.doi: 10.12307/2024.296

• 组织构建细胞学实验 cytology experiments in tissue construction • 上一篇下一篇

褪黑素抑制过氧化氢诱导人髓核细胞的损伤

谢文冠，刘宇涛，崔文波，邝铭业

东莞市第八人民医院骨科，广东医科大学附属东莞儿童医院，广东省东莞市 523320

收稿日期:2023-04-04 接受日期:2023-05-08 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 邝铭业，副主任医师，东莞市第八人民医院骨科，广东医科大学附属东莞儿童医院，广东省东莞市 523320
作者简介:谢文冠，男，1989年生，广东省湛江市人，汉族，硕士，主要从事脊柱外科相关研究。
基金资助:
东莞市社会科技发展项目(202050715028791)，项目负责人：邝铭业

Melatonin inhibits hydrogen peroxide-induced injury of human nucleus pulposus cells

Xie Wenguan, Liu Yutao, Cui Wenbo, Kuang Mingye

Department of Orthopedics, Dongguan Eighth People’s Hospital, Dongguan Children’s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University, Dongguan 523320, Guangdong Province, China

Received:2023-04-04 Accepted:2023-05-08 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Kuang Mingye, Associate chief physician, Department of Orthopedics, Dongguan Eighth People’s Hospital, Dongguan Children’s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University, Dongguan 523320, Guangdong Province, China
About author:Xie Wenguan, Master, Department of Orthopedics, Dongguan Eighth People’s Hospital, Dongguan Children’s Hospital Affiliated to Guangdong Medical University, Dongguan 523320, Guangdong Province, China
Supported by:
Dongguan City Social Science and Technology Development Project, No. 202050715028791 (to KMY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

褪黑素：亦称褪黑激素、松果体素或美拉托宁，化学名为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种生命必需的小分子吲哚胺类物质，在动物、植物、真菌和细菌中皆有发现。近年来，国内外对褪黑激素的生物学功能，尤其是作为膳食补充剂的保健功能进行了大量研究，发现其具有促进睡眠、调节时差、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等多项生理功能，受到广泛关注。
髓核细胞：髓核是椎间类似凝胶样的物质，其主要由软骨样细胞、胶原纤维和蛋白多糖组成。髓核细胞体外培养为研究椎间盘退变的细胞学及分子生物学机制提供实验基础。

背景：椎间盘退变是造成腰痛最常见的潜在因素之一，近年来研究表明，褪黑素对缓解椎间盘退变有积极作用，然而褪黑素的潜在作用机制仍有待阐明。

目的：探究褪黑素抑制过氧化氢诱导人椎间盘髓核细胞损伤的生物学作用及其潜在的作用机制。
方法：体外培养人退行性椎间盘髓核细胞，通过CCK-8法检测细胞增殖情况确定褪黑素及过氧化氢的最佳干预浓度。将过氧化氢处理2 h的细胞作为模型组；经褪黑素干预24 h再用过氧化氢处理2 h的细胞作为褪黑素组；单纯培养基培养的细胞作为对照组。通过活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测细胞内活性氧水平，免疫荧光检测BAX和Caspase3表达水平，RT-qPCR检测BAX、BCL-2、Casepase3、PI3K和AKT的mRNA表达水平。

结果与结论：①CCK-8实验结果表明，过氧化氢最佳干预浓度为400 µmol/L，褪黑素最佳干预浓度为5 µmol/L；②与模型组比较，褪黑素组活性氧水平显著降低；③与模型组比较，褪黑素组BAX和Caspase3的平均荧光强度显著降低；④与模型组比较，褪黑素组BAX和Caspase3的mRNA表达降低，而Bcl-2 mRNA表达则升高，褪黑素组的PI3K和AKT的mRNA表达也升高；⑤结果表明，褪黑素可能通过PI3K/AKT信号通路保护退行性椎间盘髓核细胞免受过氧化氢诱导的氧化损伤。

https://orcid.org/0009-0009-5726-8124(谢文冠);https://orcid.org/0009-0002-5564-3399(邝铭业)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 椎间盘退行性病变, 褪黑素, 氧化应激, 凋亡, PI3K-Akt通路

Abstract: BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration is one of the most common underlying factors causing low back pain. Recent studies have shown that melatonin has a positive effect on alleviating intervertebral disc degeneration. However, the underlying mechanism of melatonin remains to be elucidated.
OBJECTIVE: To explore the biological effect and potential mechanism of melatonin in inhibiting hydrogen peroxide (H2O2)-induced injury of human nucleus pulposus cells.
METHODS: Human nucleus pulposus cells insolated from degenerative intervertebral disc were cultured in vitro. Cell proliferation and the optimal intervention concentration of melatonin and H2O2 were detected by cell counting kit-8. The Human nucleus pulposus cells treated with H2O2 were used as a model group; the cells treated with H2O2 and intervened with melatonin were used as a melatonin group; the cells cultured in simple medium were used as a control group. The reactive oxygen species levels were detected by 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA), the expression levels of BAX and Caspase3 were detected by immunofluorescence, and the mRNA expression levels of BAX, BCL-2, Casepase3, PI3K and AKT were detected using the real-time fluorescent quantitative reverse transcription PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of cell counting kit-8 experiment showed that the optimal intervention concentration of H2O2 was 400 µmol/L and the optimal intervention concentration of melatonin was 5 µmol/L. The reactive oxygen species level in the melatonin group was significantly lower than that in the model group. The average fluorescence intensity of BAX and Caspase3 in the melatonin group was significantly lower than that in the model group. The mRNA expressions of BAX and Caspase3 in the melatonin group were lower than those in the model group, while the mRNA expression of Bcl-2 was increased. In addition, the mRNA expressions of PI3K and AKT were also higher in the melatonin group compared with the model group. To conclude, melatonin may protect human nucleus pulposus cells from H2O2-induced oxidative damage through the PI3K/AKT signaling pathway.

Key words: intervertebral disc degeneration, melatonin, oxidative stress, apoptosis, PI3K-Akt pathway

中图分类号:

谢文冠, 刘宇涛, 崔文波, 邝铭业. 褪黑素抑制过氧化氢诱导人髓核细胞的损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2180-2185.

Xie Wenguan, Liu Yutao, Cui Wenbo, Kuang Mingye. Melatonin inhibits hydrogen peroxide-induced injury of human nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2180-2185.

图/表（结果） 8

2.1 人髓核细胞培养结果图1可以看出人椎间盘退变髓核细胞密集排列并融合成片，单一细胞呈梭形状，胞浆形态饱满，细胞核清晰可见，并有伪足伸展，是用于后续相关实验的良好种子细胞。

2.2 CCK-8法检测人髓核细胞增殖情况图2为CCK-8法检测人髓核细胞在不同浓度褪黑素干预下的增殖情况，结果表明，在干预24 h时，各组细胞的增殖情况未见显著差异。在干预48 h时，与对照组相比，5，1，0.5 μmol/L组人髓核细胞均出现增殖(P < 0.05)。在干预72 h时，与对照组相比，5，1，0.5 μmol/L组同样出现人髓核细胞增殖(P < 0.05)。

2.3 过氧化氢诱导氧化应激对人髓核细胞增殖的影响图3为CCK-8法检测人髓核细胞在不同浓度过氧化氢干预下的增殖情况。在干预2 h后，当过氧化氢浓度大于400 μmol/L时，人髓核细胞存活率低于对照组；过氧化氢浓度为400 μmol/L时，人髓核细胞存活率为(71.19±2.66)%，而当过氧化氢浓度为800 μmol/L时，人髓核细胞存活率则为(39.02±1.76)%。由此可见，过氧化氢干预浓度为400 μmol/L时，人髓核细胞既能保留一定的细胞活性，又能模拟凋亡状态，因此选用该浓度用于后续实验。

2.4 不同浓度褪黑素对过氧化氢处理人髓核细胞增殖的影响图4为经过氧化氢处理的人髓核细胞在不同浓度褪黑素干预下的增殖情况，结果表明，在褪黑素干预24 h后，人髓核细胞的抗氧化作用表现出不同程度提升，且呈浓度依赖性。当过氧化氢干预浓度为400 μmol/L时，单纯模型组的人髓核细胞存活率为(71.00±3.37)%，而当褪黑素干预浓度为1 μmol/L时，人髓核细胞存活率则为(78.84±2.59)%，差异有显著性意义(P=0.020 < 0.05)。当褪黑素干预浓度为5 μmol/L时，人髓核细胞存活率则为(86.93±2.48)%，差异有非常显著性意义(P=0.000 < 0.01)，说明褪黑素能减轻过氧化氢对人髓核细胞的氧化作用，增强对人髓核细胞的保护作用，最佳抗氧化浓度为5 μmol/L。

2.5 褪黑素减轻过氧化氢诱导的人髓核细胞氧化应激 DCFH-DA荧光探针会和细胞内的活性氧发生反应而呈现绿色荧光，荧光强度越大说明活性氧含量越高。如图 5所示，对照组的人髓核细胞内活性氧含量较少，只显示微弱荧光。与对照组相比，模型组和褪黑素组人髓核细胞的荧光强度均明显增大(P=0.000，0.001 < 0.001)。与模型组相比，褪黑素组的活性氧含量则显著降低(P=0.000 < 0.001)。

2.6 褪黑素抑制过氧化氢诱导的人髓核细胞凋亡图6为BAX和Caspase3等凋亡标志物的免疫荧光染色结果，如图所示，模型组和褪黑素组的BAX和Caspase3免疫荧光均高于对照组。通过对免疫荧光进行定量分析，褪黑素组的BAX平均荧光强度为72.88±4.49，低于模型组的平均荧光强度(89.08±5.14)，差异有非常显著性意义(P=0.005 < 0.01)。此外，褪黑素组的Caspase3平均荧光强度为62.67±0.56，也显著低于模型组的平均荧光强度(71.90±3.36)，差异有非常显著性意义(P=0.002 < 0.01)。

2.7 褪黑素抑制Bax、caspase3基因的表达，促进Bcl-2基因的表达 Bax、caspase3基因的高表达可以促进细胞凋亡。如图7所示，模型组人髓核细胞中Bax和Caspase3的mRNA表达水平均显著高于对照组(P=0.000，0.000 < 0.01)，Bcl-2的mRNA表达水平显著低于对照组(P=0.000 < 0.01)。与模型组相比，褪黑素组Bax和Caspase3的mRNA表达水平显著降低(P=0.006，0.003 < 0.01)。此外，与模型组相比，褪黑素组Bcl-2的mRNA表达水平升高(P=0.015 < 0.05)。因此，褪黑素可以抑制过氧化氢诱导的人髓核细胞凋亡。

2.8 褪黑素激活过氧化氢诱导的人髓核细胞中的PI3K/AKT信号通路 PI3K/AKT信号通路在细胞凋亡过程中起重要作用，激活该通路可抑制细胞凋亡这一过程。在这项研究中，使用RT-qPCR定量分析了褪黑素对人髓核细胞中PI3K和AKT的mRNA表达水平的影响。如图 8所示，与对照组相比，模型组人髓核细胞内PI3K和AKT的mRNA表达水平显著降低(P=0.001，0.001 < 0.01)。当使用褪黑素处理后，可以提高经过氧化氢处理的人髓核细胞中PI3K和AKT的mRNA表达水平(P=0.020，0.012 < 0.05)。

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引言

据统计，大约80%的成年人在其一生中会经历某种形式的腰痛，其中5%-10%的患者会进展成为慢性残疾，腰痛也成为全世界致残的主要原因之一[1]。研究表明，椎间盘退行性病变(intervertebral disc degeneration，IDD)被认为是腰痛的主要原因[2-4]。IDD是由多种因素造成的，包括遗传易感性、生物力学过载、髓核细胞增殖异常增加、蛋白聚糖增多和胶原蛋白降解等[5]。目前，IDD的发生机制仍不明确。因此，阐明IDD的发病机制以及发现IDD的新治疗靶点具有非常重要的意义。
褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)是一种具有多功能的生命必需的小分子吲哚胺类物质[6]。褪黑素在松果体中合成并释放到脑脊液和循环中，并在夜间达到峰值水平[7]。褪黑素还可由其他几种组织和器官产生，包括胎盘、卵巢、睾丸、皮肤、淋巴细胞和骨髓等[8]。研究表明，褪黑素具有强大的抗氧化活性，保护身体众多器官和组织免于氧化应激造成的损伤[9]。此外，褪黑素还在调节细胞生物学功能方面发挥重要作用，包括细胞增殖、干细胞分化、血管生成、细胞凋亡、衰老、自噬和免疫反应[10-15]。
椎间盘的髓核细胞是软骨细胞样细胞，在生物学功能方面与软骨细胞类似。早在2006年，TURGUT等[16]对鸡进行了松果体切除术，结果加速了IDD进程。此后的研究进一步证实褪黑激素对退变髓核细胞具有积极的保护作用[17-18]。
考虑到退行性人椎间盘标本中髓核细胞的凋亡率高达53%-73%，因此抑制人髓核细胞凋亡是缓解IDD进展的一种有前途的疗法[19]。研究表明，激活PI3K/AKT信号通路可以保护乙醇诱导的细胞凋亡和氧化应激[20]。褪黑激素在各种细胞系中发挥抗细胞凋亡作用[21]。因此，诱导PI3K/AKT信号通路的激活可能是褪黑素治疗IDD的潜在机制。该研究在体外建立过氧化氢诱导的人髓核细胞氧化损伤模型，用于研究人髓核细胞损伤后的氧化应激和细胞凋亡情况，并初步探索褪黑素通过PI3K/AKT信号通路保护人髓核细胞免受过氧化氢诱导的损伤，为褪黑素治疗IDD提供理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2022年1-12月在广州中医药大学完成。
1.3 材料
1.3.1 实验主要仪器 CO2恒温培养箱(Forma-3111，Thermo Scientific公司，美国)；台式离心机(4200，KUBOTA公司，日本)；全自动细胞计数仪(Nexcelom Bioscience公司，美国)；多功能酶标仪(Varioskan Flash，Thermo Scientific公司，美国)；倒置荧光显微镜(DMI4000B，Leica公司，德国)；实时荧光定量PCR仪(iQ™5，Bio-RAD公司，美国)。
1.3.2 实验主要试剂褪黑素(纯度≥98%，ChemeGen公司，美国)；DMEM/F12培养基(Sigma公司，美国)；胎牛血清(Gibco公司，美国)；胰酶(Gibco公司，美国)；双抗(Gibco公司，美国)；CCK-8试剂盒(同仁公司，日本)；PBS(Gibco公司，美国)；活性氧检测试剂盒(索莱宝公司，中国)；总RNA提取试剂盒(Accutate Biology，中国)；反转录试剂盒(Accutate Biology，中国)；BAX抗体(ab263897，Abcam公司，美国)；Caspase3抗体(ab32351，Abcam公司，美国)；山羊抗兔二抗(ab150077，Abcam公司，美国)；牛血清白蛋白(Sigma公司，美国)；40 g/L多聚甲醛(Biosharp公司，中国)；防脱载玻片(世泰公司，中国)；抗荧光衰减封片剂(含DAPI)(索莱宝公司，中国)；过氧化氢(广东恒健制药有限公司，中国)。
1.4 实验方法
1.4.1 人髓核细胞的培养人退行性椎间盘髓核细胞(Cat NO: CP-H170)购自普诺赛公司，用含体积分数10%胎牛血清和1%双抗的DMEM/F12培养基进行培养，并置于37 ℃、体积分数为5% CO2细胞培养箱中，隔天更换一次培养基，在显微镜下观察细胞生长状态。实验所用人髓核细胞均为第3-6代细胞。
1.4.2 CCK-8法检测人髓核细胞的增殖活性将褪黑素分散于DMEM/F12完全培养基中，分别配置含褪黑素浓度为100，50，25，10，5，1，0.5 µmol/L的培养基备用。将第3代人髓核细胞配成细胞浓度为2×107 L-1的细胞悬液，将配置好的细胞悬液按每孔100 μL接种于96孔板中，放入细胞培养箱孵育24 h，更换上述含不同浓度褪黑素的培养基，将不含褪黑素的培养基设置为对照组，每组实验独立重复3次。培养1，2，3 d后，取出细胞培养板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，放入细胞培养箱孵育1 h，随后取出细胞培养板，采用酶标仪检测波长为450 nm处吸光度值，取最佳浓度用作后续研究。
1.4.3 过氧化氢诱导氧化应激对人髓核细胞增殖的影响将第3代人髓核细胞调整为浓度2×107 L-1的细胞悬液，将配置好的细胞悬液按每孔100 μL接种于96孔板中，放入细胞培养箱孵育24 h，分别用100，200，400，800 μmol/L的过氧化氢干预2 h，然后用CCK-8 法测出吸光度值，计算出不同浓度过氧化氢干预条件下人髓核细胞的存活率，并取最佳干预浓度用作后续研究。
1.4.4 褪黑素对过氧化氢干预的人髓核细胞增殖的影响将第3代人髓核细胞调整为浓度2×107 L-1的细胞悬液，将配置好的细胞悬液按每孔100 μL接种于96孔板中，放入细胞培养箱培养24 h，更换为含褪黑素浓度为5，1，0.5 µmol/L的培养基孵育24 h，然后使用浓度为400 μmol/L的过氧化氢干预2 h，采用CCK-8法测出吸光度值，计算出不同浓度褪黑素在过氧化氢干预条件下人髓核细胞的存活率，取最佳浓度用作后续研究。
1.4.5 活性氧测定使用活性氧荧光探针(DCFH-DA)检测活性氧水平。将第3代人髓核细胞调整为浓度5×107 L-1的细胞悬液，将配置好的细胞悬液按每孔300 μL接种于24孔板中，放入细胞培养箱培养24 h。对照组予以正常培养基常规培养；过氧化氢模型组使用浓度为400 μmol/L的过氧化氢干预2 h；褪黑素组采用含5 µmol/L褪黑素的培养基培养24 h，然后使用浓度为400 μmol/L的过氧化氢干预2 h。干预结束后，吸弃培养基，每孔加入500 μL的DFCH-DA在室温避光环境下孵育30 min，PBS洗涤后置于荧光显微镜(激发波长为480 nm)下拍照并分析荧光强度。
1.4.6 免疫荧光将直径为15 mm的细胞爬片置于24孔板内，随后将第3代人髓核细胞调整为浓度5×107 L-1的细胞悬液接种至孔板中。按1.4.5方法进行干预，干预结束后，弃培养基，使用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，随后加入0.5% Triton X-100处理细胞5 min，PBS洗涤后加入5%牛血清白蛋白封闭30 min，PBS洗涤后分别滴加BAX和Casepase3一抗稀释液(1∶100)，4 ℃孵育过夜并滴加二抗稀释液，避光孵育
1 h后在细胞爬片上滴加含DAPI的抗荧光衰减封片剂复染细胞核，密封盖玻片后使用荧光显微镜下观察并采集图像，采用Image J软件对图片进行荧光强度定量分析。

1.4.7 RT-qPCR 将第3代人髓核细胞调整为浓度5×107 L-1的细胞悬液，然后接种至24孔板中，放入细胞培养箱培养24 h。按1.4.5方法进行干预，随后根据说明书，使用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，通过反转录试剂盒得到cDNA，反转录的cDNA在iQ5实时PCR检测系统扩增cDNA以检测BAX、BCL-2、Casepase3、PI3K和AKT的mRNA表达水平。PCR反应条件：95 ℃预变性12 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，40个循环。PCR扩增后进行熔解曲线分析。以β-actin为内参基因，通过2-ΔΔCt法来计算细胞中基因的相对表达水平。所有引物的序列如表1所示。

1.5 主要观察指标 ①各组人髓核细胞增殖水平；②各组人髓核细胞的活性氧表达水平；③各组人髓核细胞的BAX和Caspase3表达水平；④各组人髓核细胞的BAX、BCL-2、Casepase3、PI3K和AKT mRNA表达水平。
1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 25.0(IBM，美国)统计软件进行统计学分析。对于参数数据，采用单因素方差分析(one way ANOVA test)；对于非参数数据，采用Kruskal-Wallis检验。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。文章统计学方法已经通过东莞市第八人民医院生物统计学专家审核。

讨论

腰痛是造成世界伤残损失健康生命年的主要原因，在过去20年中增加了50%以上，随着人口老龄化加剧，腰痛的患病率和残疾率也将进一步增加[22]。腰痛已经对全球医疗系统和社会经济造成了巨大负担。IDD是一系列退行性脊柱疾病的前提和病理基础，也是腰痛的主要原因。IDD的病理变化包括软骨终板钙化、纤维环破裂、髓核细胞凋亡和细胞外基质破坏[23]。从机制上讲，IDD与氧化应激、自噬通量不足、炎症递质的参与、细胞凋亡途径的激活以及椎间盘中基质金属蛋白酶的增加有关[24-26]。随着人口的老龄化，IDD的发病率正在迅速增加。一项针对1 043名志愿者的研究表明，在50岁以上的人群中，超过90%的椎间盘出现不同程度退化[27]。虽然有药物可以暂时缓解IDD的症状，但很少有药物被批准用于抑制其病程。由于IDD的分子机制十分复杂，目前其病因及发病过程仍未完全阐明，这也造成药物开发困难。
褪黑素是一种由松果体分泌的天然多效性脂溶性分子，广泛分布于全身。褪黑素具有抗肿瘤、抗骨质疏松、抗炎和抗氧化的特性，目前，褪黑素已被广泛应用于助眠、抗肿瘤、肾脏疾病、抗心脑血管疾病和延缓衰老等[28-31]。作为一种具有低毒性和高可溶性的分子，褪黑素可有效抵抗软骨退化动物模型中的氧化应激反应、炎症反应和细胞凋亡[32]。CHEN等[33]报道褪黑素通过抑制细胞凋亡来改善椎间盘退变。ZHANG等[34]发现褪黑激素通过SIRT1-自噬途径抑制软骨终板细胞凋亡。这些研究表明，褪黑素和细胞凋亡之间存在密切关系。该研究旨在探讨褪黑素在调控过氧化氢诱导的人髓核细胞凋亡中的作用及其分子机制。
该研究首先检测褪黑激素对人髓核细胞增殖行为的影响。细胞活力是细胞存活的重要因素，也是IDD的重要生物学特征。该研究采用CCK-8法检测人髓核细胞的生存能力，结果表明，不同浓度的褪黑素可增加人髓核细胞的活力并促进退化的人髓核细胞增殖。褪黑素是一种强大的天然抗氧化剂，对组织和细胞具有很强的保护作用。过量的自由基会造成细胞损伤从而加速衰老，而褪黑素的保护作用则是通过增加细胞中的各种抗氧化酶发挥作用，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶[35]。在这项研究中，活性氧实验结果表明褪黑素可以降低过氧化氢诱导的人髓核细胞中的氧化应激，从而提高细胞存活率。氧化应激是造成椎间盘损伤的原因之一，主要由活性氧介导。活性氧由细胞内线粒体产生，主要包括超氧阴离子(O2-)、过氧化氢、羟基自由基(OH-)、一氧化氮、臭氧(O3)和单线态氧(1O2)。细胞氧化和代谢的副产物通常与身体的抗氧化剂保持平衡。当椎间盘损伤后，细胞线粒体结构遭到破坏，导致线粒体功能受损，从而增加活性氧的产生。过量的活性氧会氧化降解细胞膜中的不饱和脂肪酸(即脂质过氧化)，从而破坏细胞膜的完整性并最终导致细胞死亡[36]。在该研究中，褪黑素减少了细胞内活性氧含量并提高了经过氧化氢诱导的人髓核细胞的存活率。
细胞凋亡是髓核细胞继发性损伤的主要原因之一，细胞凋亡也是椎间盘损伤中研究最多的细胞死亡机制，因此抑制细胞凋亡是椎间盘损伤后功能恢复的关键。细胞凋亡是一种程序化的能量依赖性细胞死亡模式，涉及内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径。线粒体途径主要由Bcl-2和Caspase家族介导[37]。 Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax在接收到凋亡信号(如过氧化氢)后，聚集在线粒体表面，降低线粒体膜电位，增加其通透性，随后细胞色素C从线粒体释放到细胞质，可以导致凋亡小体的形成以及激活促凋亡蛋白酶Caspase，最终导致细胞凋亡[38]。在该研究中，褪黑素抑制了过氧化氢诱导的人髓核细胞的凋亡。经过氧化氢处理人髓核细胞后，BAX和Caspase3的表达显著增加，褪黑素降低了经过氧化氢诱导人髓核细胞中BAX和Caspase3的mRNA表达，并增加Bcl-2的mRNA表达，表明褪黑素可以通过抑制线粒体凋亡来保护细胞。
PI3K/Akt信号通路是参与椎间盘细胞增殖、衰老、凋亡和细胞生物合成等多种细胞生物学行为的共同通路[39-40]。PI3K是PI3K/AKT信号通路的上游启动子蛋白，接受细胞外信号后被募集到细胞膜上。PI3K磷酸化其下游分子AKT，从而抑制BAX介导的细胞凋亡。既往研究表明，褪黑素可以激活PI3K/Akt通路，以发挥其对细胞的保护作用[41-42]。在该研究中，过氧化氢显著降低了PI3K和AKT的mRNA表达，而褪黑素增加了经过氧化氢诱导的人髓核细胞中PI3K和AKT的mRNA表达，表明褪黑素通过PI3K/Akt通路抑制过氧化氢诱导的人髓核细胞凋亡。上述研究结果表明，褪黑素可能通过PI3K/AKT信号通路保护退行性椎间盘髓核细胞免受过氧化氢诱导的氧化损伤。考虑到该研究是一项体外研究，因此尚存在一定局限性，如果进行体内研究，此研究结论可能更有说服力。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

褪黑素抑制过氧化氢诱导人髓核细胞的损伤

Melatonin inhibits hydrogen peroxide-induced injury of human nucleus pulposus cells

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