32P-β射线致急性放射性皮肤损伤模型的建立及损伤机制

doi:10.12307/2024.303

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (14): 2173-2179.doi: 10.12307/2024.303

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

32P-β射线致急性放射性皮肤损伤模型的建立及损伤机制

武晓丹1，2，3，4，王治国1，2，3，4，战莹1，2，3，4，张国旭1，2，3，4

1中国人民解放军北部战区总医院核医学科，辽宁省沈阳市 110016；2核背景复合战创伤救治实验室，辽宁省沈阳市 110016；3辽宁省核医学分子影像重点实验室，辽宁省沈阳市 110016；4联勤医学优质学科，辽宁省沈阳市 110016

收稿日期:2023-02-16 接受日期:2023-04-12 出版日期:2024-05-18 发布日期:2023-07-28
通讯作者: 张国旭，硕士，主任医师，中国人民解放军北部战区总医院核医学科，辽宁省沈阳市 110016；核背景复合战创伤救治实验室，辽宁省沈阳市 110016；辽宁省核医学分子影像重点实验室，辽宁省沈阳市 110016；联勤医学优质学科，辽宁省沈阳市 110016
作者简介:武晓丹，女，1991年生，山西省大同市人，汉族，2016年天津医科大学毕业，硕士，主管药师，主要从事辐射防护与治疗的研究。

Establishment of an acute radioactive skin injury model induced by 32P-beta ray radiation and the mechanism of injury

Wu Xiaodan1, 2, 3, 4, Wang Zhiguo1, 2, 3, 4, Zhan Ying1, 2, 3, 4, Zhang Guoxu1, 2, 3, 4

1General Hospital of Northern Theater Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 2Nuclear Background Compound War Trauma Treatment Laboratory, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3Liaoning Key Laboratory of Nuclear Medicine Molecular Imaging, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 4High Quality Disciplines of Department of General Logistics Medicine, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

Received:2023-02-16 Accepted:2023-04-12 Online:2024-05-18 Published:2023-07-28
Contact: Zhang Guoxu, Master, Chief physician, General Hospital of Northern Theater Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China
About author:Wu Xiaodan, Master, Pharmacist in charge, General Hospital of Northern Theater Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

32P：同位素32P发射纯β射线，半衰期为14.263 d，平均能量0.695 MeV，组织平均射程为2-4 mm，核事故发生时，放射性核素32P沾染到皮肤上可引起放射性皮肤损伤。
急性放射性皮肤损伤：身体局部皮肤受到一次或短时间(数日)内多次大剂量(α、β、γ射线)外照射所引起的急性放射性皮炎及放射性皮肤溃疡。

背景：急性放射性皮肤损伤的临床表现为反复发作的坏死性溃疡，其发病机制仍不完全清楚，建立合适的动物模型对其发病机制及预防治疗的研究具有重要临床价值。

目的：建立急性β射线放射性皮肤损伤模型，初步探究其损伤机制。
方法：69只SD大鼠随机分为30，45和60 Gy β射线照射组(n=21)及对照组(n=6)，采用32P放射性核素对大鼠背部进行单次局部照射，对照组除不照射外其余操作与各照射组相同。造模后监测各组大鼠体质量，各照射组分别于照射后第7，15，30，45，60天各取3只大鼠切取皮肤组织观察损伤情况，包括皮肤外观、苏木精-伊红染色、Masson染色、透射电镜、TUNEL实验观察，另外采用免疫组化、Western Blot观察皮肤样本中Bcl-2、Bax及P53凋亡相关蛋白的表达。

结果与结论：①照射后大鼠无意外死亡，体质量呈逐渐增加趋势；②大鼠皮肤出现不同程度的表皮层坏死、炎症细胞浸润、毛囊及附属器减少、胶原纤维断裂，以60 Gy、45 Gy表现明显，血清炎症因子白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平显著升高，呈剂量依赖性；③电镜结果显示细胞内出现不同程度的线粒体数量减少、空泡化以及核固缩，细胞凋亡程度呈现一定的剂量依赖性；④免疫组织化学及Western Blot结果显示，照射后皮肤组织P53及Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减弱，45 Gy、60 Gy β射线组与30 Gy β射线组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；60 Gy β射线组与45 Gy β射线组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；⑤结果提示，32P放射性核素45 Gy及60 Gy照射大鼠背部可成功建立急性放射性皮肤损伤动物模型，其机制与凋亡相关因子P53、Bax上调及Bcl-2下调有关，该模型可为放射性皮肤损伤预防治疗及相关机制研究提供参考。

https://orcid.org/0009-0008-4632-5675(武晓丹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 32P, β射线, SD大鼠, 放射性皮肤损伤, 动物模型, P53, Bax, Bcl-2

Abstract: BACKGROUND: The clinical manifestation of acute radiation skin injury is recurrent necrotic ulcers, and its pathogenesis is still not fully understood. The establishment of a suitable animal model will have important clinical implications for the study of its pathogenesis, prevention and treatment.
OBJECTIVE: To establish a model of acute β-ray radiation skin injury and to investigate the mechanism of injury.
METHODS: Sixty-nine Sprague-Dawley rats were randomly divided into 30, 45, 60 Gy 32P-β-ray groups (n=21 per group) and control group (n=6). A single local irradiation of the back of the rats was performed using 32P radionuclide. The control group was operated in the same way as the irradiated groups except that it was not irradiated. The body mass and skin appearance of the rats were measured at 7, 15, 30, 45, and 60 days after irradiation. Three rats from each group were selected at each observation time point. The skin injury was observed by hematoxylin-eosin staining, Masson staining, transmission electron microscopy, and TUNEL assay. P53, Bcl-2 and Bax protein levels in the skin were measured by immunohistochemistry and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no accidental death after irradiation, and the body mass of rats showed a gradual increase. The rats showed different degrees of epidermal necrosis, inflammatory cell infiltration, reduction of hair follicles and appendages, and collagen fibrillation, which were evident at 60 and 45 Gy. The levels of serum inflammatory factors, interleukin-6 and tumor necrosis factor-α, were significantly increased in a dose-dependent manner. Under the electron microscope, there are varying degrees of mitochondrial reduction, vacuolization and nuclear pyknosis in the cells. The degree of cell apoptosis showed a certain dose-dependence. Immunohistochemistry and western blot results showed an increase in the expression of P53 and Bax proteins and a decrease in the expression of Bcl-2 protein in the skin after irradiation. There were significant differences between the 60 Gy group and the 45 Gy and 30 Gy groups (P < 0.05). To conclude, irradiation with 60 Gy and 45 Gy 32P radionuclide on the back of rats could successfully establish a practically pre-clinical animal model, and the mechanism is related to the up-regulation of P53 and Bax and the down-regulation of Bcl-2. This model can provide a reference for the establishment of animal models for the study of the mechanism of radiation skin injury and its prevention and treatment.

Key words: 32P, β-ray, Sprague-Dawley rat, radioactive skin injury, animal model, P53, Bax, Bcl-2

中图分类号:

武晓丹, 王治国, 战莹, 张国旭. 32P-β射线致急性放射性皮肤损伤模型的建立及损伤机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(14): 2173-2179.

Wu Xiaodan, Wang Zhiguo, Zhan Ying, Zhang Guoxu. Establishment of an acute radioactive skin injury model induced by 32P-beta ray radiation and the mechanism of injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(14): 2173-2179.

图/表（结果） 9

2.1 实验动物数量分析选取69只SD大鼠，随机分为30 Gy、45 Gy、60 Gy β射线组(n=21)及对照组(n=6)，造模后，30，45和60 Gy β射线组分别于照射后第7，15，30，45，60天各取3只大鼠切取皮肤组织观察损伤情况，每组中6只大鼠继续留观直到实验结束，实验过程中无意外死亡，所有大鼠均进入结果分析。
2.2 不同剂量β射线对SD大鼠体质量的影响 30 Gy、45 Gy以及60 Gy β射线单次局部照射后，各组大鼠饮食饮水正常，体质量呈逐渐增加趋势，各剂量组无统计学差异。与对照组相比，60 Gy剂量组在照射后第30天体质量有所下降(P < 0.05)，之后逐渐恢复，见图 1。

2.3 不同剂量β射线对SD大鼠皮肤愈合时间及愈合率的影响大鼠经不同剂量β射线照射后，均出现不同程度的皮肤损伤，见图2。

照射后第7天，各组大鼠照射部位均出现干性脱皮，45，60 Gy β射线组开始出现少量充血性红斑。照射后第15天，30 Gy β射线组出现少量片状红斑，45，60 Gy β射线照射部位皮肤红肿，出现显著性片状红斑，结痂，创面扩大。照射后第30天，30 Gy β射线组出现显著性片状红斑，创面结痂；45 Gy β射线组照射野皮肤结痂融合，创面扩大不明显；60 Gy β射线组照射野皮肤结痂加深、融合，有稀薄渗出液。照射后第45天，45 Gy β射线组出现痂皮脱落，60 Gy β射线组出现少量痂皮脱落，创面有收缩趋势，同时可观察到30 Gy β射线组痂皮脱落创面基本恢复。照射后第50天，45 Gy β射线组可见大量新生上皮部分覆盖创面，60 Gy β射线组可见少量痂皮脱落。照射后第60天，45 Gy β射线组大鼠创面基本恢复，未见毛发生长；60 Gy β射线组大鼠创面仍有大部分结痂未脱落，且创面溃疡反复迁延不愈。各组大鼠创面愈合时间及愈合率见表1，2。

2.4 苏木精-伊红染色和Masson染色观察β射线对大鼠皮肤组织病理学损伤苏木精-伊红染色和Masson染色结果显示：对照组大鼠皮肤表皮层细胞排列清晰，皮肤附属器结构完整。照射后15 d，30 Gy β射线组表皮细胞、毛囊上皮细胞肿胀，可见到坏死细胞，附属器减少，周围少量炎症细胞浸润；45 Gy以及60 Gy β射线组表皮可见小灶状缺失灶，浅表糜烂加深，真皮内胶原纤维出现水肿、融解、断裂、排列紊乱，其内有散在炎症细胞浸润。照射后30 d，30 Gy β射线组真皮内胶原纤维肿胀，胶原纤维断裂，溶解，排列紊乱；45 Gy β射线组可见上皮细胞变性坏死，真皮层胶原纤维断裂，炎性细胞浸润；60 Gy β射线组真皮层大量断裂，成纤维细胞很少，大量炎性细胞浸润。照射后45 d，30 Gy β射线组有新生上皮覆盖创面，新生肉芽组织明显，胶原纤维增生明显，排列较为整齐；45 Gy β射线组可见大量胶原纤维增生及上皮组织向创面中心爬行，胶原纤维丰富、真皮深层及皮下组织水肿较轻；60 Gy β射线组可见少量胶原纤维增生，真皮层可见大量炎性细胞浸润。照射后60 d，45 Gy β射线组有大量新生上皮覆盖创面，胶原纤维增生明显，排列整齐；60 Gy β射线组真皮层结缔组织有少量增生，皮肤表层结构有明显缺损。见图3，4。

2.5 ELISA法检测各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平与30 Gy β射线组比较，45，60 Gy β射线组血清IL-6、TNF-α水平显著升高(P < 0.05)；与45 Gy β射线组比较，60 Gy β射线组IL-6、TNF-α水平显著升高(P < 0.05)。见表3。

2.6 透射电镜观察β射线对大鼠皮肤组织的损伤情况照射后30 d，与对照组相比，30 Gy β射线组可见成纤维细胞内粗面内质网增加，轻度扩张，细胞核膜结构完整，线粒体轻微空泡化、损伤较轻；45 Gy β射线组成纤维细胞内见少数线粒体，呈空泡样变，粗面内质网扩张，细胞间隙增宽，可见胶原纤维增生，可见少量自噬溶酶体结构；60 Gy β射线组毛囊基本消失，成纤维细胞内见少数线粒体，呈空泡样变，内质网肿胀明显，胞浆内有自噬空泡，细胞间隙明显增宽，核固缩明显，细胞核调亡，可见大量自噬溶酶体结构。见图5。

2.7 TUNEL法检测细胞凋亡程度照射后15 d，各组均有少量细胞凋亡，主要为炎症细胞和少量的成纤维细胞，各组无明显差异；照射后30 d，各组凋亡细胞均增多，主要为成纤维细胞和血管内皮细胞，60 Gy及45 Gy β射线组呈表达高峰，60 Gy β射线组凋亡细胞数量高于45 Gy β射线组(P < 0.05)，45 Gy β射线组高于30 Gy β射线组(P < 0.05)；照射后45 d，各组凋亡细胞呈下降趋势，30 Gy可见少量凋亡细胞，60 Gy β射线组凋亡细胞数量仍高于45 Gy β射线组(P < 0.05)。见图6。

2.8 免疫组化学检测P53、Bax及Bcl-2蛋白表达水平照射后第15天，3 组大鼠皮肤组织中P53及Bax蛋白的表达均呈阳性，60 Gy及45 Gy β射线组P53、Bax 蛋白的表达水平高于30 Gy β射线组；照射后第30 天，各组表达均呈增长趋势，60 Gy及45 Gy β射线组大鼠皮肤组织 P53、Bax 蛋白的表达水平达峰值，且60 Gy β射线组高于45 Gy β射线组(P < 0.05)，45 Gy β射线组高于30 Gy β射线组(P < 0.05)；照射后第45 天，60 Gy β射线组P53、Bax 蛋白的表达仍呈较高水平，30 Gy及45 Gy β射线组P53、Bax 蛋白表达明显减弱(P < 0.05)。照射后第15 天，3 组大鼠皮肤组织中Bcl-2 蛋白的表达均呈阳性；照射第30 天，各组Bcl-2表达均呈下降趋势，60 Gy及45 Gy β射线组大鼠皮肤组织Bcl-2蛋白的表达水平达低峰值，且60 Gy β射线组显著低于30 Gy及45 Gy β射线组(P < 0.05)，见图7；照射后第45 天，60 Gy β射线组Bcl-2蛋白的表达仍呈较低水平，30 Gy及45 Gy β射线组P53、Bax 蛋白表达显著增加(P < 0.05)。

2.9 Western Blot检测P53、Bax及Bcl-2蛋白表达水平见图8。

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引言

随着核技术在各领域的广泛应用，放射性物质给人类带来许多益处的同时由于其自身的危险属性必然会在使用过程中发生辐射损害[1-2]。核事故发生时，皮肤作为人体的第一道屏障，是辐射的第一个靶器官，放射性核素沾染到人体皮肤组织表面可引发放射性皮肤损伤[3-4]，其临床表现为发病缓慢、病程长、反复发作的坏死性溃疡，迁延不愈甚至恶变，是典型的难愈性创面[5-7]。核辐射所致皮肤组织损伤程度决定于射线类型和受照剂量，不同剂量的α、β、γ射线及中子对皮肤的损伤不全相似，其机制也不完全相同，但皮肤损伤的表现形式相近[8-10]。放射性皮肤损伤的分子机制涉及多种因素，辐射诱导的DNA链断裂、炎症反应以及活性氧被认为是辐射诱发组织损伤的触发因素[10]。目前认为放射性皮肤损伤难愈合与照射后产生大量自由基[10-13]、炎症反应[12-13]，以及凋亡相关基因[14-16]、生长因子[17]、信号通路改变密切相关[18]。辐射引起机体细胞产生大量活性氧可损伤DNA，激活P53基因表达，改变Bcl-2/Bax比值，进而导致细胞周期阻滞、DNA无法修复，诱导细胞进入凋亡状态[12，15-16]，同时受照后皮肤组织过度炎症反应抑制细胞增殖及肉芽组织生长，导致创面难以愈合[6]。
针对核事故与核辐射突发事件中辐射所致放射性皮肤损伤，尤其是中重度以上的损伤，一直是临床预防治疗中的重点及难点[12-13]，研究其致伤机制、生理生化机制以及寻找有效物理及药物防治手段已成为国内外研究的热点，在研究中首要的步骤是建立有效可靠的动物模型。国内外有关放射性核素沾染所致皮肤损伤动物模型构建过程中大多采用电子线、60Co以及X射线照射建立急性放射性皮肤损伤模型，且在造模过程中的照射剂量、照射方式及损伤程度评价均未统一[18-20]，所建立的皮肤损伤模型不能完全模拟核沾染所致皮肤损伤的特点，而放射性核素32P发射纯β射线，其沾染到皮肤上可引起放射性皮肤损伤，可作为急性β射线皮肤损伤的理想放射源。鉴于目前的研究现状，此次实验采用32P放射性核素辐射器敷贴于SD大鼠背部模拟建立放射性核素沾染到皮肤组织引起的β射线皮肤损，通过观察照射后皮肤组织形态学、炎症反应、细胞凋亡相关基因(p53、Bax、Bcl-2)的变化，寻找不同损伤程度放射性皮肤损伤动物模型的最佳照射剂量，初步探究其致伤机制，以期为β射线所致放射性皮肤损伤的预防治疗研究提供可靠的动物模型。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年6月至2023年1月在北部战区总医院动物实验科完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠69只，体质量250-300 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，动物许可证号：SCXK (辽)2020-0001，在北部战区总医院动物实验科饲养。标准动物房温度为(22±2) ℃，湿度(50±5)%，每隔12 h进行开关灯，饲养笼均设置独立空气净化系统，饲料及纯净水灭菌，待大鼠适应环境1周后称体质量，进行实验操作。实验方案经北部战区总医院动物实验伦理委员会批准，批准号为 2018024 号。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》。
1.3.2 实验试剂及仪器 32P同位素溶液购自中国原子高科股份有限公司，P53抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、内参 Actin(Abcam公司)，HRP-山羊抗兔/小鼠(Servicebio公司)，TUNEL试剂盒(罗氏公司)，苏木精-伊红染液套装、Masson染液套装、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素 6(interleukin 6，IL-6)酶联免疫试剂盒(Servicebio公司)。低温高速离心机(贝克曼)，透射电子显微镜(Hitachi 公司)，酶标仪(Thermo公司)，光学显微镜(Nikon公司)，倒置荧光显微镜(Nikon公司)。
1.4 方法

1.4.1 实验动物分组及模型建立采用随机数字表法将69只SD大鼠随机分为4组，分别为30 Gy、45 Gy、60 Gy β射线组(n=21)及0 Gy对照组(简称对照组，n=6)。制备32P-β照射辐射器(2 cm×2 cm)，照射前大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(4 mL/kg)，背部毛发用剃毛器剃去，将辐射器固定于大鼠背部皮肤2 cm×2 cm方形区域，吸收剂量分别为30 Gy、45 Gy以及60 Gy。照射完放回笼子饲养，自由饮水摄食。对照组除不照射外其余操作与各照射组相同。

1.4.2 动物大体观察照射后对大鼠进行拍照观察，称取体质量，记录大鼠的全身状态、创面出现的时间、创面色泽、渗出液、伤口愈合等情况，计算各组创面愈合时间及愈合率。创面愈合率(%)=(开始照射面面积-未愈合创面面积)/开始照射面面积。创面愈合标准：创面结痂面积<创面面积5%或愈合面积> 95%为完全愈合。
1.4.3 苏木精-伊红染色照射后第7，15，30，45，60天，无菌条件下采集各个时间段各组3只大鼠的创伤皮肤组织(0.5 cm×0.5 cm)，甲醛固定，石蜡包埋、切片。脱蜡至水，依次进行苏木精染色、梯度乙醇脱水、伊红染色。依次放入乙醇逐级脱色、二甲苯至透明，中性树胶封固。显微镜镜检，图像采集分析。
1.4.4 Masson染色取1.4.3中个各时间段石蜡切片，浸入Masson A液中浸泡过夜。切片依次入Masson B液及Masson C液等比混合的染液、Masson D液浸染、Masson E液浸染。稍沥干直接入Masson F液染，1%冰醋酸漂洗分化，无水乙醇脱水，中性树胶封固，显微镜镜检，图像采集分析。
1.4.5 ELISA法严格按照试剂盒说明书检测大鼠血清中IL-6、TNF-α水平。
1.4.6 电镜观察照射后第30天，取各组皮肤组织4%戊二醛固定，1%锇酸避光室温固定。室温脱水：梯度乙醇脱水，丙酮洗脱，渗透包埋；将样品插入包埋板后37 ℃烤箱恒温聚合，超薄切片机切片，2%醋酸铀-2.6%枸橼酸铅溶液染色，室温干燥过夜，透射电子显微镜下观察，采集图像分析。
1.4.7 TUNEL实验取1.4.3中个各时间段石蜡切片，TUNEL法检测创面成纤维细胞和血管内皮细胞凋亡程度。甲醛固定，严格按照TUNEL试剂盒方法进行检测。显微镜下观察皮肤组织细胞凋亡情况。
1.4.8 免疫组织化学检测照射后第7，15，30，45，60天皮肤样本中P53、Bax、Bcl-2及表达情况。取1.4.3中备用切片，依次将切片脱蜡至水；抗原修复；体积分数3%双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶；在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30 min；在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗(P53、Bax、Bcl-2，比例均为1∶500)，4 ℃孵育过夜。滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，室温孵育50 min；DAB显色液显色，显微镜下控制显色时间，自来水终止显色，苏木精复染细胞核，脱水封固；置于光学显微镜下拍摄，测量平均吸光度值。
1.4.9 Western Blot 照射后第30天，取各组皮肤组织块加入裂解液，低温充分研磨，4 ℃，12 000 r/min离心后收集上清，BCA蛋白试剂盒定量蛋白浓度，根据检测蛋白分子质量确定浓缩胶浓度为5%，电泳后转 PVDF 膜，4 ℃过夜孵化以下抗体P53(1∶1 000)，Bax(1∶ 2 000)，Bcl-2(1∶2 000)，Actin(1∶2 000)，回收一抗，用1×TBST 洗涤样品3次，室温下与相应的二抗一起孵育30 min，再用1×TBST 冲洗3次，增强化学发光液ECL可视化蛋白条带，Image J进行定量分析。
1.5 主要观察指标 ①大鼠体质量；②大鼠皮肤创面大体观察、皮肤创面愈合时间及愈合率；③苏木精-伊红染色、Masson染色观察创面病理学改变；④ELISA检测血清IL-6、TNF-α水平；⑤透射电镜观察细胞凋亡形态及TUNEL法检测细胞细胞凋亡程度；⑥免疫组化及Western Blot检测P53、Bax及Bcl-2表达水平。
1.6 统计学分析采用 SPSS 17.0及GraphPad Prism 8.0.2 统计软件。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过北部战区总医院生物统计学专家审核。

讨论

放射性皮肤损伤是身体局部皮肤受到一次或短时间(数日)内多次大剂量(α、β、γ射线)外照射所引起的急性放射性皮肤溃疡[21]，可见于核事故及核战争发生时放射性核素沾染到皮肤组织或外照射引发的皮肤损伤，也见于临床放射治疗引起的并发症，其表现为受照皮肤红斑、脱毛、脱屑、色素沉着、糜烂坏死，严重程度与照射剂量相关[22-24]。根据皮肤损伤的临床表现不同，可分为轻度( Ⅰ度反应)、中度(Ⅱ度反应) 及重度(Ⅲ度反应)，Ⅰ度反应表现形式主要为红斑、烧灼及刺痒感；Ⅱ度反应主要表现为高度充血、水肿及水疱形成；Ⅲ度反应会出现皮肤溃疡、坏死，并迁延不愈[10]。轻度皮肤损伤可以自愈，对于中重度以上的损伤目前缺乏有效的预防和治疗手段，预后极差[25-26]。鉴于放射性皮肤损伤的特殊性，研究其致伤机制及预防治疗方法需建立合适的动物模型。
目前急性放射性皮肤损伤的造模中照射源主要采用电子线、X射线以及γ射线，剂量为5-75 Gy不等。KIM等[27]采用6 MeV电子束单次照射建立猪皮肤辐射损伤模型，以皮肤损伤微血管密度下降为标志，发现15，30 Gy 照射后，皮肤组织在4-6周损伤达高峰，之后创面逐渐恢复，但经50，75 Gy照射后的皮肤因损伤严重无法完全恢复。陈宇彤等[19]采用X射线建立急性Wistar大鼠放射性皮肤损伤大鼠模型，通过检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3及巨噬细胞变化，认为38 Gy X射线照射组大鼠皮肤符合急性放射性皮炎标准。FALLAH等[28]发现15 Gy γ射线局部照射小鼠皮肤，照射区域的纤溶酶原水平升高，纤溶酶原被激活为纤溶酶，导致严重的放射性皮肤损伤。沈国良等[20]采用4 MeV电子线照射SD大鼠臀部皮肤建立45 Gy β射线深Ⅱ度烧伤创面。HOLLER等[29]使用单次剂量为 8.5-45 Gy 的60Co射线照射小鼠背部皮肤建立急性放射性皮肤损伤模型。MEI等[30]采用60Co射线照射SD大鼠的头颈部建立了15，20，25，30 Gy的辐射模型。以上文献研究可知，电子线、X射线、γ射线以及60Co射线照射后均可建立不同损伤程度的放射性皮肤模型，但X射线及γ射线穿透性强易造成动物脏器损伤继而大量死亡[31-32]，60Co射线源的保存和防护比较复杂[33]。大多研究者采用直线加速器产生的电子线模拟β射线照射所致急性放射性皮肤损伤。此方法安全性及动物耐受性较好，但尚存在不足之处，首先直线加速器产生的电子线照射无法完全模拟核事故或核爆发生中放射性核素沾染到皮肤组织后发射β射线产生的生物学效应，其次照射剂量未统一[18]，评价指标尚不明确[19]，照射后创面形状不规则，因此急需建立一种可靠且能反映损伤病理特征的β射线引起放射性皮肤损伤动物模型。
此次实验采用32P放射性核素辐射器敷贴于大鼠臀背部成功建立不同损伤程度大鼠皮肤损伤模型，30，45，60 Gy照射后均可产生明显的放射性皮损且安全性良好，损伤程度与照射剂量呈正相关。大体观察及病理生化结果显示，30 Gy照射后大鼠皮肤为轻度皮肤损伤，仅出现红斑、薄纸样改变，可见表皮细胞肿胀，少量炎症细胞浸润，短时间创面自愈。此剂量照射后皮肤病理变化不明显，创面损伤较轻，不符合急性放射性皮肤损伤模型基本要求[10，19，26]。45 Gy照射后大鼠皮肤出现红斑、薄纸样改变、溃疡及结痂，上皮细胞变性坏死，真皮层胶原纤维断裂，炎性细胞浸润，血清炎症因子IL-6、TNF-α水平显著升高，照射后60 d基本愈合。该结果与陈宇彤等[19]采用38 Gy X射线建立的大鼠深Ⅱ度急性放射性皮炎、沈国良等[20]采用4 MeV电子线照射大鼠建立45 Gy β 射线深Ⅱ度烧伤创面皮肤损伤情况相似。而60 Gy β射线组真皮层胶原纤维大量断裂，成纤维细胞极少，大量炎性细胞浸润，皮肤反复溃疡，经久不愈，血清炎症因子IL-6、TNF-α水平显著高于45 Gy β射线组，为重度炎症反应[10]。KIM等[27]
同样发现皮肤组织经 6 MeV电子线照射50，75 Gy照射后的皮肤因损伤严重无法完全恢复，由此可见，电离辐射生物效应与照射剂量关系密切，在一定范围内皮肤损伤程度与受照剂量呈正相关性[19]。45，60 Gy β射线照射后均建立急性放射性皮肤损伤模型，45 Gy照射后大鼠皮肤依次出现红肿-炎症-溃疡-愈合的病程规律，符合急性放射性皮肤损伤Ⅱ度反应[10，19]，60 Gy照射后的大鼠皮肤损伤严重，反复溃疡难以愈合。
细胞凋亡在放射性皮肤损伤发生发展过程中发挥重要作用，凋亡存在多种相关凋亡基因调控，与凋亡关系最密切的是Bcl-2家族和P53[34]。P53参与调控多种凋亡途径，射线照射后引起细胞 DNA损伤，首先激活P53基因诱导受照细胞进入凋亡阶段[35]，Bax是一种重要的促凋亡蛋白，它的作用与其含量密切相关[36]。在细胞凋亡过程中，Bcl-2是特异性抑制细胞凋亡的存活基因，Bcl-2/Bax的比值决定了细胞凋亡是被抑制还是被加强[15-16，37]。CUI等[38]研究发现Bax蛋白的表达随着细胞凋亡的增加而明显增加，与伤口愈合过程中的细胞凋亡数量呈正相关，而Bcl-2蛋白的表达在细胞凋亡达到最高点时明显下降，当细胞凋亡明显减少时，Bcl-2蛋白的表达呈现上升趋势。赵小瑜等[39]观察大鼠急性β射线皮肤损伤创面相关凋亡基因表达发现表明P53抑制Bcl-2抗凋亡活性，激活促凋亡基因 Bax，使得创面肉芽组织形成延迟，创面难以愈合。此次实验结果显示β射线皮肤损伤创面形成过程中，45 Gy β射线照射后成纤维细胞内线粒体损伤明显，细胞凋亡数量增加，60 Gy β射线照射后线粒体严重损伤，细胞核固缩明显，细胞濒临死亡；45，60 Gy β射线组P53、Bax持续高表达，且对应Bcl-2表达减弱，由此提示，β射线照射可导致皮肤凋亡细胞数量明显增加，其机制是通过活化P53及促凋亡基因Bax活性[34-36]、抑制Bcl-2抗凋亡活性[16，37]，
从不同途径介导细胞凋亡，从而影响细胞增殖分化及相关细胞因子的合成与分泌，使溃疡肉芽组织形成不良，上皮化过程延迟，导致创面迁延不愈[15-16，35]。
综上所述，在β射线皮肤损伤创面愈合过程中相关凋亡基因的表达发挥了重要作用，其机制可能与射线增强皮损细胞中P53、Bax蛋白表达、降低bcl-2基因表达、促进细胞凋亡的作用有关，具体机制仍需进一步验证。此次研究结果推荐使用45，60 Gy 32P放射性核素建立急性放射性皮肤损伤模型，其中45 Gy可作为Ⅱ度放射性皮肤损伤模型的剂量，所建立的动物模型具有安全性高、耐受性好、方便观察取材等特点，可作为β射线所致放射性皮肤损伤预防治疗研究的可靠动物模型。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

32P-β射线致急性放射性皮肤损伤模型的建立及损伤机制

Establishment of an acute radioactive skin injury model induced by 32P-beta ray radiation and the mechanism of injury

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