创伤性脑损伤大鼠皮质神经元中 Lnx1 表达及参与继发性脑损伤的机制

doi:10.12307/2024.735

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (1): 24-30.doi: 10.12307/2024.735

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创伤性脑损伤大鼠皮质神经元中 Lnx1 表达及参与继发性脑损伤的机制

马艳霞 1，2 ，杨严伟 1 ，马宇航 3 ，李迪 4 ，王晓燕 5 ，邹明明 6 ，韦善文 1

1 苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215000；2 苏州大学骨科研究所，江苏省苏州市 215006；3 苏州大学附属第二医院，江苏省苏州市 215004；4 苏州大学附属张家港市第一人民医院，江苏省张家港市 215600；5 兰州生物制品研究所有限责任公司质量鉴定室，甘肃省兰州市 730046；6 解放军总医院第一医学中心神经外科医学部，北京市 100853

收稿日期:2023-10-07 接受日期:2023-11-25 出版日期:2025-01-08 发布日期:2024-05-18
通讯作者: 韦善文，硕士，主管技师，苏州大学附属第一医院骨科，江苏省苏州市 215000 共同通讯作者：邹明明，博士，主治医师，解放军总医院第一医学中心神经外科医学部，北京市 100853
作者简介:马艳霞，女，1986 年生，2015 年苏州大学毕业，硕士，实验师，主要从事大脑发育及神经损伤修复研究。共同第一作者：杨严伟，女，1986 年生，硕士，主治医师，主要从事肌骨 MR 诊断研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年项目 (8180052062)，项目负责人：李迪

Lnx1 expression in cortical neurons of rats with traumatic brain injury and mechanisms involved in secondary brain injury

Ma Yanxia1, 2 , Yang Yanwei 1 , Ma Yuhang3 , Li Di 4 , Wang Xiaoyan5 , Zou Mingming6 , Wei Shanwen1

Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; 2 Orthopedic Institute, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China; 3 Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, Jiangsu Province, China; 4 First People’s Hospital of Zhangjiagang Affiliated to Soochow University, Zhangjiagang 215600, Jiangsu Province, China; 5 Quality Control Department, Lanzhou Institute of Biological Products Co., Ltd., Lanzhou 730046, Gansu Province, China; 6 Department of Neurosurgery, First Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China Ma Yanxia, Master, Experimentalist, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Orthopedic Institute, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China

Received:2023-10-07 Accepted:2023-11-25 Online:2025-01-08 Published:2024-05-18
Contact: Wei Shanwen, Master, Technician-in -charge, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Co-corresponding author: Zou Mingming, MD, Attending physician, Department of Neurosurgery, First Medical Center of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China
About author:Ma Yanxia, Master, Experimentalist, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China; Orthopedic Institute, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China Yang Yanwei, Master, Attending physician, Department of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215000, Jiangsu Province, China Ma Yanxia and Yang Yanwei contributed equally to this article.
Supported by:
National Natural Science Foundation (Youth Project), No. 8180052062 (to LD)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

创伤性脑损伤模型：是一种由外力引发的颅内损伤，这种外力可来自于打击、撞击、子弹甚至是爆炸。目前，有以下几种创伤性脑损伤动物模型被广泛应用于实验研究：重物坠落损伤模型、液压冲击损伤模型、控制性皮质损伤模型、穿透弹道式脑损伤模型和爆炸伤模型。

Lnx1的分子结构：Lnx1蛋白的特征是存在一个氨基端环结构域，此结构域包含2个ZnF连接，1个Numb结合的NPAY/NPAF基序，还有4个PDZ 结构域和一个羧基端PDZ结合基序(TFL*或SLV*)。

背景：细胞凋亡在继发性脑损伤中发挥重要作用。探究创伤性脑损伤后促进神经细胞存活的病理生理机制，将为防治创伤性脑损伤提供新的方向和理论依据。

目的：探究Lnx1分子在哺乳动物脑损伤后皮质神经元中的表达变化及参与继发性脑损伤的可能机制。

方法：80只成年SD大鼠平均分成假手术组和创伤性脑损伤组，每组雌雄各20只。采用重物坠落方法建立创伤性脑损伤大鼠模型，分别在脑损伤后6，12，24，48，72 h，通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光染色等技术分析相关分子在受损皮质神经元中的表达情况。

结果与结论：①创伤性脑损伤组大鼠损伤部位脑组织出血，可观察到明显的组织损伤，脑组织含水量升高；②与假手术组相比，创伤性脑损伤组皮质神经元中Lnx1表达在损伤24 h开始显著升高；③创伤性脑损伤后与Lnx1相结合的PBK和BCR蛋白表达降低，促存活因子ctgf的表达升高；④结果表明：脑损伤后神经元中Lnx1表达上调，其通过降低靶分子PBK和BCR的表达，进一步上调促成活因子ctgf的表达，对受损神经元具有保护作用。

https://orcid.org/0000-0002-8930-0274 ( 马艳霞 )

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 创伤性脑损伤, 继发性脑损伤, 神经元, SD大鼠, Lnx1, PBK, BCR, ctgf

Abstract:

BACKGROUND: Apoptosis plays an important role in secondary brain injury. Therefore, to explore the pathophysiological mechanism of promoting nerve cell survival after traumatic brain injury provides a new direction and theoretical basis for the prevention and treatment of traumatic brain injury.

OBJECTIVE: To explore the expression changes of Lnx1 molecule in mammalian cortical neurons after brain injury and the possible mechanism involved in secondary brain injury.

METHODS: Eighty adult SD rats were divided into 20 male and 20 female mice in sham operation group and 20 male and 20 female mice in traumatic brain injury group. The traumatic brain injury rat model was established by heavy falling method. At 6, 12, 24, 48, and 72 hours after brain injury, the expression of related molecules in damaged cortical neurons was analyzed by RT-qPCR, western blot assay, and immunofluorescence staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The brain tissue of traumatic brain injury group was bleeding and obvious tissue injury could be observed. Water content of brain tissue increased after traumatic brain injury. (2) Compared with the sham operation group, the expression of Lnx1 in cortical neurons after traumatic brain injury increased significantly at 24 hours after injury. (3) After traumatic brain injury, the expression of PBK and BCR protein decreased, and the prosurvival factor ctgf increased. (4) These findings suggest that after traumatic brain injury, the expression of Lnx1 is up-regulated in neurons, which may be due to the decrease of the expression of its target molecules PBK and BCR, and further promote the expression of living factor ctgf, which has a protective effect on the damaged neurons.

Key words: traumatic brain injury, secondary brain injury, neuron, SD rat, Lnx1, PBK, BCR, ctgf

中图分类号:

马艳霞 , 杨严伟 , 马宇航, 李迪 , 王晓燕 , 邹明明 , 韦善文. 创伤性脑损伤大鼠皮质神经元中 Lnx1 表达及参与继发性脑损伤的机制[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(1): 24-30.

Ma Yanxia , Yang Yanwei , Ma Yuhang , Li Di , Wang Xiaoyan , Zou Mingming , Wei Shanwen. Lnx1 expression in cortical neurons of rats with traumatic brain injury and mechanisms involved in secondary brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(1): 24-30.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析参加实验 SD 大鼠共有 80 只，建立脑损伤模型后 3 只大鼠死亡，39 只造模成功大鼠与假手术组 38 只大鼠进入结果分析。
2.2 建立 SD 大鼠创伤性脑损伤模型构建创伤性脑损伤模型后收取脑组织，将组织放在干净的细胞培养皿中，体式显微镜下观察大脑组织损伤情况。与假手术组相比，创伤性脑损伤组大鼠的脑组织损伤部位呈明显的坏死腔，见图 2，这说明造模成功。课题研究中所检测脑组织区域见图 2。
2.3 创伤性脑损伤后脑组织含水量升高在致伤后不同时间点用干 / 湿比重法测定脑组织含水量，见表 1。与假手术组相比较，在不同时间点创伤性脑损伤组的脑组织含水量有升高趋势，但差异无显著性意义 (P > 0.05)。

2.4 脑损伤后 Lnx1 在转录水平的表达量上调通过实时荧光定量 PCR 检测 Lnx1 的表达，从损伤 12 h 开始，与假手术组相比，创伤性脑损伤组的Lnx1 mRNA表达明显升高，且在 24 h 时差异更加显著，持续至 72 h，见图 3。由以上结果初步推测，Lnx1 基因表达改变可能参与脑损伤后的病理生理变化。
2.5 脑损伤后 Lnx1 蛋白表达上调 Western blot 检测 Lnx1 蛋白的表达。与假手术组相比，在损伤 24 h 后，脑组织中 Lnx1 蛋白的表达显著升高，见图 4。这说明创伤性脑损伤后 Lnx1 蛋白在脑组织中的表达发生了改变。
2.6 脑损伤后 Lnx1 在神经元上的荧光强度增强为了进一步确认Lnx1蛋白的表达改变是在皮质神经元中发生的，该研究采用神经元的特异性抗体 Tuj1 和 Lnx1 进行免疫荧光双标记染色来分析神经元中 Lnx1 表达情况。假手术组和创伤性脑损伤组各时间点均随机选择 6 个脑组织，每个脑组织选择 8 张切片，对切片进行 Lnx1 和神经元特异性标记物 Tuj1 免疫荧光双染，染色结束后在正置荧光显微镜下采集图片，用 Image J 软件分析 Tuj1 阳性神经元上 Lnx1 的荧光强度。与假手术组相比，从脑损伤 24 h 开始皮质神经元上 Lnx1 蛋白的荧光强度显著增强，见图 5。
2.7 创伤性脑损伤后 PBK、BCR 的表达降低，促存活基因 ctgf 的表达升高通过上述实验发现，创伤性脑损伤后 Lnx1 在皮质神经元中的表达显著上调，表明 Lnx1 参与创伤性脑损伤的病理发生，那么创伤性脑损伤后 Lnx1 的表达上调是如何来行使其功能的呢？先前的研究表明了与 Lnx1 存在相互作用的蛋白质，Lnx1 与细胞质和细胞核中的以下几种分子存在结合，结合后通过泛素化使其降解，如胞质蛋白 KIF7、BCR 及 c-SRC、核蛋白 E4F1、PBK 和 SKIP[11] 。因此实验进一步检测了创伤性脑损伤后 KIF7、 BCR 及 c-SRC、核蛋白 E4F1、PBK 和 SKIP 的表达变化。 Western blot 检测结果显示，脑损伤 24 h 后，脑组织中 PBK 和 BCR 蛋白表达显著降低，见图 6。RT-qPCR 检测促存活因子 ctgf、cyr61、fgf2 的表达变化，结果显示创伤性脑损伤后ctgf mRNA表达显著升高，见图6。以上结果表明， Lnx1 可能通过下调 PBK 和 BCR 的表达，促进 ctgf 的表达，从而对受损神经元具有保护作用。

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引言

创伤性脑损伤是一种高发病率、致残率和致死率的神经外科急症，是目前国际上主要关注的公共卫生和社会经济问题之一 [1-3] ，主要发生原因为交通事故、高空作业以及运动损伤等。由于创伤性脑损伤住院周期较长、并发症多以及预后不佳等原因，每年都会消耗大量医疗费用与资源，更严重的是，每年创伤性脑损伤都会造成大量患者死亡和永久性的功能障碍 ( 如语言和感觉运动障碍 )，严重损害患者身心健康。近半个世纪以来，由于对创伤性脑损伤研究的深入以及医疗技术的进步，创伤性脑损伤死亡率已从 50% 下降到 20%[4-6] ，但致残率仍居高不下。也就是说，存活下来的患者其后期生活可能会伴随永久性的功能障碍，如语言、运动障碍和精神问题等 [4-5，7] 。因此，深入认识创伤性脑损伤的病理生理反应，针对其机制寻找有效防治脑损伤的潜在靶点，是降低创伤性脑损伤致死、致残率的关键。

创伤性脑损伤是一个复杂的病理生理过程，它涉及炎性反应、细胞凋亡、血脑屏障破坏、脑缺血和神经退行性疾病等众多机制。从病理生理学角度，创伤性脑损伤大致可分为 2 个阶段：原发性脑损伤和继发性脑损伤 [4，7-8] 。原发性损伤源于环境中机械外力直接作用于颅骨和脑，瞬间造成脑部神经细胞死亡，属于不可逆的机械损伤；继发性脑损伤包括线粒体功能障碍、神经细胞凋亡、炎性反应和自由基损伤等 [9-10] 。

Lnx(Ligand of Numb Protein-X) 蛋白家族由一个共同的祖先蛋白进化而来，该蛋白包含 1 个环状锌指结构域和 4 个 PDZ 结构域。环状锌指结构域是 E3 泛素连接酶中最常见的催化结构域；PDZ 结构域介导蛋白质 - 蛋白质相互作用，通常结合其相互作用伙伴的羧基末端序列发挥作用 [11] 。环状锌指结构域和 PDZ 结构域在一个多肽中的组合是 Lnx 蛋白质所特有的并且反映在这个家族的另一个名称中：PDZRN(PDZ 和环 )，哺乳动物 Lnx1 因能够与 Numb 相互作用而得名 [12] 。 Lnx1 在成年小鼠及胚胎小鼠的组织中广泛表达。在胚胎 14.5 d 小鼠中 Lnx1 的表达仅限于大脑和脊髓，在出生后的大脑中 Lnx1 表达逐渐升高，且 Lnx1 主要在鼠脑神经元中表达 [13] ，可见 Lnx1 基因在胚胎时期就在中枢神经系统中开始表达，且在出生后哺乳动物大脑中的表达更多。

在哺乳动物大脑发育时期，甘氨酸信号传导通过抑制神经干细胞中 Lnx1 的表达，从而控制 Numb 蛋白降解调节 Notch 活性，最终调控神经干细胞的增殖能力 [14] 。 Lnx1 蛋白与多个神经元突触前蛋白有相互作用，推测 Lnx1 蛋白在突触前神经末梢有着重要的潜在功能 [11] 。许多在突触形成中发挥重要作用的蛋白也被报道与 Lnx1 蛋白有关 [15] 。研究表明，Lnx1 在出生后苔藓状纤维轴突的靶向过程中不可或缺 [16] ，Lnx1 通过与 NMDAR 形成 Lnx1- NMDAR 多蛋白复合物介导海马的初始社会记忆 [17] 。近期的研究也表明， Lnx1 调节 GlyT2 蛋白的泛素化状态从而参与由神经递质异常而引起的过度兴奋和慢性疼痛 [18] 。此外，Lnx1 在人脑胶质瘤的发生中也起重要作用 [19] 。上述研究发现 Lnx1 在大脑神经元中高表达且起着重要的调控作用。但是，Lnx1 在脑损伤中是否有作用还未有相关的报道，因此该研究建立大鼠创伤性脑损伤模型，探究 Lnx1 是否参与创伤性脑损伤的病理生理变化。研究结果显示，损伤侧皮质神经元中 Lnx1 在 mRNA 和蛋白水平的表达均上调，这说明 Lnx1 可能与创伤性脑损伤的病理生理变化有关，进一步的研究显示 Lnx1 表达升高后 PDZ 结合激酶 (PDZ-binding kinase，PBK) 和断点簇区蛋白 (breakpoint cluster region protein，BCR) 的表达降低，促成活因子结缔组织生长因子 (connecttve ttssue growth factor，ctgf) 的表达升高，作者推测 Lnx1 可能通过下调 PBK 和 BCR 的表达从而保护受损神经元。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计建立 SD 大鼠创伤性脑损伤模型，通过 qPCR、 Western blot 和脑组织免疫荧光染色方法检测 Lnx1 和相关分子的表达量。

1.2 时间及地点 2020 年 10 月至 2023 年 3 月在苏州大学骨科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物成年 SD 大鼠 80 只，雌雄各 40 只，体质量 250-270 g，购买于南京大学实验动物中心并饲养于苏州大学 SPF 级动物房中，室温控制在 20-26 ℃，相对湿度为 40%-60%，模拟自然光照条件，每日光照 12 h，自由饮食饮水，每周更换经过紫外线严格消毒的垫料、食物及饮用水。将 80 只 SD 大鼠平均分为 2 组，假手术组和创伤性脑损伤组，每组雌雄各 20 只。所有动物实验均遵守苏州大学伦理与使用委员会批准的实验方案进行处理 ( 编号： SUDA20231108A01)。该课题研究中少量死亡实验鼠不计入数据统计，尸体按照动物伦理要求进行处理。

1.3.2 实验器材实验中所用仪器如脑立体定位仪、电子天平、骨头钻子及 40 g 砝码等仪器均购自深圳瑞沃德股份有限公司；实验用外科显微手术器械购自苏州施强股份有限公司；荧光显微镜 (ZEISS，M1)；图像软件 AxioVision 4.7 软件；高速离心机 (Eppendorf)；冰冻切片机 (Leica 3050S，德国 )；SDS-PAGE 转移槽、水平摇床、凝胶成像系统(Bio-Rad)；PCR仪(Applied biosystems)；加热垫(RWD)；水浴锅、金属浴锅和精密电子称等。 1.3.3 主要试剂 40 g/L 多聚甲醛、体积分数 75% 乙醇、 Triton X-100、胎牛血清、0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液、生理盐水、安尔碘消毒剂、麻醉剂 ( 氯胺酮 100 mg/kg+ 塞拉嗪 10 mg/kg+ 生理盐水 8 mL)、Trizol、RIPA 裂解液、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂 (Gibco)、ECL 显影液 (Millipore)、无菌去离子水、封片剂、异丙醇、氯仿、甲醇、柠檬酸三钠和柠檬酸等。

1.4 实验方法

1.4.1 创伤性脑损伤模型的建立腹腔注射麻醉剂 ( 氯胺酮100 mg/kg+塞拉嗪10 mg/kg+生理盐水8 mL)麻醉大鼠，将大鼠俯卧固定于立体定位仪操作台上，保持颅顶水平位，颅顶前囟部备皮、消毒，沿正中矢状线头皮开口，分离肌肉及骨膜暴露出颅骨，之后进行开窗，开窗数据如下：距颅顶部前囟前方 7.5 mm、中线旁开 3 mm，开直径 5 mm 骨窗。暴露出脑组织后，将 40 g 砝码从 25 cm 高处自由落体撞击大鼠脑组织；砝码深陷，移开砝码，消毒缝合头皮，单笼饲养，自由饮食饮水。假手术组开颅窗后不给予颅脑撞击。实验模式图和操作流程见图 1A，B。在创伤性脑损伤后 6，12，24，48，72 h，每个时间点各取 6 只大鼠脑组织，留取部分损伤区新鲜脑组织于液氮中以备提取蛋白，部分损伤区脑组织置于 40 g/L 多聚甲醛中固定，进行冰冻切片后以备免疫荧光染色。

1.4.2 Western blot 检测 (1) 总蛋白的提取：取出脑组织，放入加有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液中用玻璃研磨棒进行研磨至无可见的组织块，研磨后置于冰上静止 30 min，之后进行离心 (11 000 r/min，5 min)，吸取上清液转移至准备好的离心管中备用。 (2) 蛋白浓度测定：标准品孔为 8 个，每个样品均做 3 个副孔以减少实验误差。按照 BCA 试剂盒操作说明进行目的样品浓度测定，使用全波长酶标仪测定 562 nm 波长处的吸光度值，绘制标准浓度曲线以计算蛋白样品的最终浓度。 (3) 蛋白质电泳：将备用的样品与 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液按照4∶1体积比例混匀，于95 ℃水浴使蛋白变性。将预先制备的 10% SDS-PAGE 凝胶放入电泳装置中，加入电泳缓冲液后，将 60 μg 的蛋白量加入凝胶孔内，同时加入蛋白标准品以标识分子条带所在位置。在 70 V 恒压下电泳至分离胶，出现标准品条带后在 110 V 恒压下电泳直至蛋白标准品条带分离完全。 (4) 转膜：在 250 mA 恒流条件下，将凝胶上的蛋白条带平行转移到经甲醇浸润过的 PVDF 膜上，之后用 1×TBS 配制成的 5% 脱脂牛奶封闭 PVDF 膜 1 h。 (5) 抗体孵育：封闭结束后，剪裁出目的蛋白相应的 PVDF 膜条带，用 5% 脱脂牛奶配制 Lnx1(Abcam； ab230704)、KIF7(Abcam；ab95884)、BCR(CST；#3902)、 c-SRC(CST；#2109)、E4F1(Abcam；ab70618)、SKIP(CST； ab67715)、PBK(Abcam；ab236872) 和内参 GAPDH(CST； #92310) 抗体，所有一抗配制浓度为 1 ∶ 1 000，抗体充分覆盖目的条带于 4 ℃孵育过夜，一抗孵育过夜后将目的条带用 1×TBST 洗涤 3 次，1×TBS 洗涤 1 次，每次 15 min，充分洗涤后，同样用 5% 脱脂牛奶配制的相应二抗在室温孵育 1 h，再次用 1×TBST 洗涤条带 3 次，每次 15 min。 (6) 显影及分析：将洗涤后的 PVDF 膜置于 Bio-Rad 凝胶成像仪的显影平台中，加入适量的 ECL 显影液覆盖住 PVDF 膜进行显影。最后，使用 Image J 软件对蛋白印迹进行灰度值分析。

1.4.3 实时荧光定量 (RT-qPCR) 引物序列：Lnx1：上游引物 5’-TGG AGG CGG GCT GGT GA-3’，下游引物 5’-TTC CTC AGG GGC AGG TCA AGA-3’；ctgf：上游引物 5’-AGG GCC TCT TCT GTG ACT TCG-3’，下游引物 5’-GAA GAC ACT GAA GCC GAG GG-3’；cry61：上游引物 5’-ACC GTG CTA AGG ATG GCT GTT C-3’，下游引物 5’-TGT TGG CTT GTA GTT TGC TTC TGT G-3’；fgf2：上游引物 5’- GCC AGG TAA CGG Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 29｜No.1｜January 2025｜27 中国组织工程研究 Chinese Journal of Tissue Engineering Research www.CJTER.com 研究原著 TTA GCA CAC-3’，下游引物 5’-GGC TTC TTC CTG CGC ATC C-3’；内参 18s：上游引物 5’-AGG AAT TGA CGG AAG GGC ACC -3’，下游引物 5’-GTG CAG CCC CGG ACA TCT AAG-3’。反应体系为 SYBR Green I Premix 10 µL、Forward Primer 1 µL、Reverse Primer 1 µL、cDNA 3 µL、无菌去离子水至 20 µL，将加好样的 96 孔板放在实时定量 PCR 仪内，反应程序为：95 ℃预变性 10 s；95 ℃变性 15 s；55 ℃退火 30 s； 72 ℃延伸 30 s，40 个循环。将得到的 Ct 值进行统计分析 (2-ΔΔCt )。

1.4.4 脑水肿检测用干 / 湿比重法检测脑水肿。获取创伤性脑损伤组大鼠损伤侧脑组织及假手术组大鼠半个脑组织后，立即称质量 ( 湿质量 )，然后置于 100 ℃烘箱中连续烘 72 h 再称质量 ( 干质量 )。按公式：[( 湿质量 - 干质量 )/ 湿质量 ]×100% 计算脑含水量。 1.4.5 组织免疫荧光染色将冰冻切片放在室温环境 10 min，晾干多余水分之后放入 0.01 mol/L PBS 中洗去组织上包被的 OCT，用体积分数 10% 胎牛血清封闭组织 1 h，接着用一抗 Lnx1(Abcam 公司，ab230704，1 ∶ 200) 和 Tuj1 (Abcam 公司，ab18207，1 ∶ 200) 于 4 ℃孵育 48 h，之后用 0.01 mol/L PBS 洗涤 3 次，每次 15 min；加入相应二抗 (Life technogy 公司，1 ∶ 500) 常温孵育 1 h，用 0.01 mol/L PBS 洗涤 3 次，每次 15 min，最后用封片剂封固，用正置荧光显微镜观察。

1.5 主要观察指标 ①脑损伤后脑水肿的评估及脑皮质中 Lnx1 基因的表达；②脑损伤后皮质 Tuj1 阳性神经元中 Lnx1 蛋白的表达；③ Lnx1 的靶基因 KIF7、c-SRC、E4F1、 SKIP、PBK、BCR 及促成活因子 ctgf、cyr61、fgf2 的表达。

1.6 统计学分析应用 SPSS 22.0 统计分析软件对数据进行统计学分析。数据以均数 ± 标准误表示，采用单因素方差分析、多因素方差分析或非参数方差分析等分析方法， P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

讨论

中枢神经系统损伤后会发生一系列复杂的病理生理过程，如反应性胶质细胞增生、氧化自由基生成、线粒体损伤、能量代谢障碍和神经炎症激活等，这会导致神经元细胞死亡和随后的继发性脑组织损伤 [20-22] 。创伤性脑损伤是临床神经外科的常见疾病，发病率呈逐年上升趋势。脑损伤后药物治疗的匮乏始终是神经科学的难点，系统地开展脑损伤后的病理生理、神经再生以及功能恢复等方面的研究，是探索有效的脑保护药物的基础。目前较成熟的哺乳动物脑损伤模型有机械损伤、压力损伤、爆炸伤和重复性轻度损伤等 [23-24] 。

Lnx1/2 样基因存在于一些无脊椎动物谱系中。例如，在圆角类和软体动物中有明确的 Lnx1/2 同源物，而在线虫和节肢动物中则没有，这表明 Lnx1/2 蛋白并非在所有无脊椎动物谱系中都是必需的。在脊椎动物谱系中，祖先 Lnx1/2 样基因的重复产生了 Lnx1、Lnx2 和 Lnx2b 3 个成，这 3 个基因似乎在所有脊椎动物谱系中都是保守的。

该研究通过建立 SD 大鼠创伤性脑损伤模型探究 Lnx1 在脑损伤后皮质神经元中的表达情况，初步探究 Lnx1 是否与脑损伤的病理发生发展过程相关。分别在转录和蛋白水平分析了 Lnx1 在假手术组和创伤性脑损伤组大鼠皮质神经元中的表达情况，结果发现创伤性脑损伤后 Lnx1 的表达显著上调，尤其在损伤 24 h 后上升更显著，而在损伤后6 h和12 h脑组织中Lnx1蛋白表达无明显改变。但是，在损伤 12 h 脑组织中 Lnx1 mRNA 表达开始上升，这是因为蛋白质的表达需要经过转录和翻译的过程，因此其表达变化需要一定的时间才能检测到。

Lnx1 蛋白在皮质神经发生中的重要作用已经有文献报道 [13] 。最近的研究也表明，Lnx1 表达上调促进了人多种癌细胞的细胞周期进程 [25] ，也有研究证明 Numb 是 Lnx1 介导的泛素化的底物 [26] 。Lnx1 介导的泛素化似乎都以 Numb 为靶点进行蛋白酶体降解。多项研究表明胞质蛋白 KIF7、BCR、c-SRC 以及核蛋白 E4F1、PBK、SKIP 均可通过 Lnx1 被泛素化降解。因此作者推测，Lnx1 参与创伤性脑损伤的病理机制可能与其泛素化的下游分子相关。实验结果显示，创伤性脑损伤后胞质蛋白 BCR 和核蛋白 PBK 的表达均显著降低，但胞质蛋白 KIF7、c-SRC 及核蛋白 E4F1、SKIP 的表达未发生改变，表明 Lnx1 可能通过调控 PBK 和 BCR 的表达参与创伤性脑损伤的病理机制。BCR 是一种 RHO GTPase 激活蛋白，Lnx1 也会通过泛素化导致 BCR 蛋白水平降低。实验结果显示，与假手术组相比，脑损伤后 BCR 表达显著降低，作者推测其可能作为 Lnx1 的下游分子参与调控脑损伤后的病理进展。

哺乳动物 Lnx1 与核蛋白的一些相互作用已经被报道。一些研究发现 Lnx1 部分定位于细胞核 [27] ，并且 Lnx1 与细胞周期控制和转录调节有关 [28-29] ，这些发现提示 Lnx1 在细胞核中的功能。PBK 作为一种丝裂原激活的蛋白激酶，可以下调肿瘤抑制蛋白 p53，并在许多人类癌症中上调 [29-30] 。PBK 可以通过外源表达蛋白与 Lnx1 发生免疫共沉淀。作者查阅文献得知，Lnx1 可以通过泛素化 PBK，使其以蛋白酶体依赖的方式降解 [31] ，Lnx1 过表达会降低 PBK 蛋白的水平，抑制细胞生长能力。以上关于 Lnx1 与核蛋白的相互关系与该研究结果相一致。SKIP 是另一种与 Lnx1 有相互作用的核蛋白 , 以 Lnx1 的 PDZ1 为诱饵，在酵母双杂交筛选中鉴定出 Ski 相互作用蛋白 (SKIP/SNW1)。 SKIP/SNW1 作为转录调节因子，可以调节与几种信号通路相关的转录。但是在脑损伤模型上并未检测到 SKIP 的表达变化，这表明 SKIP 可能不参与脑损伤后的病理生理进展。另外，研究表明 Lnx1 敲低会使细胞对阿奇霉素诱导的 HEK293T 细胞凋亡敏感，而 Lnx1 过表达则保护细胞 [31] 。实验进一步分析了促进细胞存活的相关因子，发现促存活因子 ctgf 在损伤大脑中的表达显著升高。结合以上实验数据，作者推测创伤性脑损伤后神经元中 Lnx1 表达的升高对细胞具有保护作用，Lnx1 的高表达使 PBK 和 BCR 蛋白降解，最后使得促存活因子 ctgf 的表达升高从而促进神经元存活。此外，有研究报道 MicroRNA-325-3p 通过 NEK6 积累靶向 Lnx1，促进抗凋亡 STAT3 信号通路的激活 [32] 。该研究数据表明，创伤性脑损伤后皮质神经元中 Lnx1 表达上调，可见 Lnx1 表达上调可能与创伤性脑损伤后神经元的存活有关。因此作者推测，脑损伤后 Lnx1 在神经元上的表达上调可能对受损神经元具有保护作用，但是这还需要进一步的研究证明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

创伤性脑损伤大鼠皮质神经元中 Lnx1 表达及参与继发性脑损伤的机制

Lnx1 expression in cortical neurons of rats with traumatic brain injury and mechanisms involved in secondary brain injury

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