血红素氧合酶1促进氧化应激条件下神经干细胞向神经元分化

doi:10.12307/2025.513

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (23): 4931-4938.doi: 10.12307/2025.513

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

血红素氧合酶1促进氧化应激条件下神经干细胞向神经元分化

于庆贺1，蔡子鸣2，田禾3，李翩4，阮烨4，梁金柱2，林淑惠1，林文平1

广州中医药大学附属深圳平乐骨伤科医院，1脊柱外科，3妇科，广东省深圳市 518118；2广州中医药大学附属深圳平乐骨伤科医院，广东省深圳市 518118；4广州中医药大学第三临床医学院，广东省广州市 510006

收稿日期:2024-04-19 接受日期:2024-06-24 出版日期:2025-08-18 发布日期:2024-09-29
通讯作者: 林文平，博士，主任医师，博士生导师，广州中医药大学附属深圳平乐骨伤科医院脊柱外科，广东省深圳市 518118
作者简介:于庆贺，男，1992年生，河北省邢台市人，汉族，2020年南方医科大学毕业，硕士，医师，主要从事脊柱脊髓损伤修复方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81771323)，项目负责人：林文平；广东省自然科学基金面上项目(2021A1515010722)，项目负责人：林文平；深圳市自然科学基金面上项目(JCYJ20190813112401660)，项目负责人：林文平

Heme oxygenase 1 promotes differentiation of neural stem cells into neurons under oxidative stress condition

Yu Qinghe1, Cai Ziming2, Tian He3, Li Pian4, Ruan Ye4, Liang Jinzhu2, Lin Shuhui1, Lin Wenping1

1Department of Spine Surgery, 3Department of Gynaecology, Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China; 2Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China; 4Third School of Clinical Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

Received:2024-04-19 Accepted:2024-06-24 Online:2025-08-18 Published:2024-09-29
Contact: Lin Wenping, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China
About author:Yu Qinghe, Master, Physician, Department of Spine Surgery, Shenzhen Pingle Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Shenzhen 518118, Guangdong Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 81771323 (to LWP); Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2021A1515010722 (to LWP); Natural Science Foundation of Shenzhen Municipality, No. JCYJ20190813112401660 (to LWP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

血红素氧合酶1：是血红素代谢过程的限速酶，可催化血红素降解为一氧化碳、胆绿素和亚铁，具有抗炎、抗氧化的作用，参与调节细胞的增殖、凋亡等重要生理过程。
神经干细胞：存在于神经系统，正常生理情况下保持静止，在中枢神经系统损伤等条件下能进行自我更新并可分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，具有免疫调节和促进神经再生等多种功能。

摘要
背景：研究表明，血红素氧合酶1能增强细胞的抗氧化、抗凋亡能力，但血红素氧合酶1过表达对氧化应激条件下神经干细胞增殖和分化的影响尚不清楚。
目的：探讨血红素氧合酶1过表达对氧化应激条件下神经干细胞存活和分化能力的影响。
方法：①从新生Balb/c小鼠脊髓组织中分离培养小鼠原代神经干细胞，免疫荧光检测神经干细胞标志物Nestin的表达；②采用慢病毒感染神经干细胞以诱导血红素氧合酶1过表达，流式检测绿色荧光蛋白荧光强度，Western blot检测血红素氧合酶1的表达水平；③在慢病毒感染神经干细胞培养基中添加H2O2以模拟脊髓损伤后的氧化应激微环境，采用细胞增殖检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒和TUNEL染色试剂盒分析血红素氧合酶1过表达对神经干细胞增殖和凋亡水平的影响；④采用试剂盒检测脂质氧化标志物丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平；⑤采用流式检测细胞内的活性氧水平以及神经干细胞向星形胶质细胞和神经元分化情况；⑥光学和荧光显微镜观察血红素氧合酶1过表达对神经干细胞分化的神经元轴突生长的影响。
结果与结论：①小鼠神经干细胞球形态稳定，生长状态良好，免疫荧光检测Nestin呈阳性；②Western blot检测发现血红素氧合酶1过表达组神经干细胞中血红素氧合酶1的表达显著高于空载体对照组；流式检测血红素氧合酶1过表达组和空载体对照组神经干细胞均表达绿色荧光蛋白；③血红素氧合酶1过表达维持了神经干细胞在氧化应激条件下的增殖活力并显著减少了细胞凋亡数量；④血红素氧合酶1过表达抑制了氧化应激微环境下神经干细胞的脂质过氧化，增强了维持氧化-还原稳态的相关酶类表达，降低了细胞内的活性氧水平；⑤血红素氧合酶1过表达促进了神经干细胞向神经元分化，并抑制了向星形胶质细胞分化；⑥血红素氧合酶1过表达组的神经元轴突更长并且细胞间的连接更多。上述结果表明过表达血红素氧合酶1能减轻H2O2诱导的神经干细胞氧化损伤，抑制神经干细胞凋亡，促进神经干细胞增殖及向神经元细胞分化。

https://orcid.org/0000-0001-5029-5466 (林文平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 血红素氧合酶1, 神经干细胞, 氧化应激, 脊髓损伤, 神经元, 凋亡, 轴突

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that upregulation of heme oxygenase-1 expression enhances cellular antioxidant and anti-apoptotic abilities. However, the effects of upregulating heme oxygenase-1 expression on the proliferation and differentiation of neural stem cells under oxidative stress conditions remain unclear.
OBJECTIVE: To investigate the influence of heme oxygenase-1 overexpression on the survival and differentiation capacity of neural stem cells under oxidative stress conditions.
METHODS: (1) Mouse primary neural stem cells were isolated and cultured from newborn Balb/c mice. Immunofluorescence was used to detect the neural stem cell marker Nestin. (2) Lentivirus was used to infect neural stem cells to induce heme oxygenase-1 overexpression. Flow cytometry was used to assess green fluorescent protein fluorescence. Western blot assay was performed to detect the expression levels of heme oxygenase-1. (3) H2O2 was added to the lentivirus-infected neural stem cell culture medium to simulate the oxidative stress microenvironment after spinal cord injury. Effects of heme oxygenase-1 overexpression on neural stem cell proliferation and apoptosis levels were analyzed using cell proliferation assay kits, cell apoptosis assay kits, and TUNEL staining kits. (4) The levels of lipid oxidation markers malondialdehyde, catalase, superoxide dismutase, and glutathione peroxidase were detected using assay kits. (5) Flow cytometry was used to measure intracellular reactive oxygen species levels, and neural stem cell differentiation into astrocytes and neurons. (6) The effect of heme oxygenase-1 overexpression on neuronal axon growth during neural stem cell differentiation was observed under optical and fluorescence microscopes.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Mouse neural stem cells exhibited stable morphology, good growth status, and high expression of Nestin as detected by immunofluorescence. (2) Western blot analysis showed that the overexpression of heme oxygenase-1 in the overexpression group was significantly higher than that in the empty carrier control group. Flow cytometry was used to detect the expression of green fluorescent protein in the neural stem cells of the heme oxygenase-1 overexpression group and empty vector control group. (3) Overexpression of heme oxygenase-1 maintained the proliferative activity of neural stem cells and significantly reduced the number of apoptotic cells under oxidative stress conditions. (4) Overexpression of heme oxygenase-1 inhibited lipid peroxidation of neural stem cells under oxidative stress microenvironment, enhanced the expression of enzymes related to maintaining the oxidative-reductive balance, and significantly reduced intracellular reactive oxygen species levels. (5) Overexpression of heme oxygenase-1 promoted the differentiation of neural stem cells into neurons and reduced differentiation into astrocytes. (6) The heme oxygenase-1 overexpression group exhibited longer axons, and more intercellular connections. The above results indicate that overexpression of heme oxygenase-1 can alleviate oxidative damage of H2O2-induced neural stem cells, reduce neural stem cell apoptosis, promote proliferation, and facilitate differentiation of neural stem cells into neurons.

Key words: heme oxygenase-1, neural stem cell, oxidative stress, spinal cord injury, neuron, apoptosis, axon

中图分类号:

于庆贺, 蔡子鸣, 田禾, 李翩, 阮烨, 梁金柱, 林淑惠, 林文平. 血红素氧合酶1促进氧化应激条件下神经干细胞向神经元分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4931-4938.

Yu Qinghe, Cai Ziming, Tian He, Li Pian, Ruan Ye, Liang Jinzhu, Lin Shuhui, Lin Wenping. Heme oxygenase 1 promotes differentiation of neural stem cells into neurons under oxidative stress condition[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(23): 4931-4938.

图/表（结果） 3

2.1 小鼠神经干细胞的培养和鉴定结果 培养第7天的小鼠神经干细胞呈现经典的“圆球状”，大部分呈现悬浮状态，少部分贴壁后的神经干细胞呈现分化状态，见图2A。
使用神经干细胞标志蛋白Nestin的特异性抗体进行鉴定，通过分析10个不同显微镜视野下同时携带蓝色DAPI荧光和红色Nestin荧光的细胞与只携带蓝色DAPI荧光细胞的比例，证实所提取出的小鼠原代神经干细胞纯度高于99.3%，见图2B。
2.2 慢病毒诱导神经干细胞过表达血红素氧合酶1 通过Western blot检测发现血红素氧合酶1过表达组神经干细胞中血红素氧合酶1的表达显著高于空载体对照组(P < 0.001)，见图3A。流式细胞术检测慢病毒所带的绿色荧光蛋白，发现血红素氧合酶1过表达组与空载体对照组细胞均感染成功，见图3B。
2.3 氧化应激条件下血红素氧合酶1过表达促进神经干细胞的存活并抑制凋亡 与空载体对照组相比，血红素氧合酶1过表达维持了神经干细胞在氧化应激条件下的增殖活力，见图4A，使用7-AAD和Annexin V标记坏死和凋亡的细胞，发现血红素氧合酶1过表达显著减少了氧化应激条件下的细胞凋亡数量，见图4B，C。
通过TUNEL染色标记凋亡的细胞核，同样证实了血红素氧合酶1过表达抑制了氧化应激条件下的神经干细胞凋亡，见图4D。

2.4 血红素氧合酶1过表达维持神经干细胞的氧化-还原稳态 通过试剂盒检测各组细胞中丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的水平，发现血红素氧合酶1过表达抑制了氧化应激微环境下神经干细胞的脂质过氧化，增强了维持氧化-还原稳态的相关酶类表达，见图5A。
使用DHE标记细胞内的活性氧，再通过流式检测发现血红素氧合酶1过表达显著降低了细胞内的活性氧水平，见图5B。
2.5 血红素氧合酶1过表达促进神经干细胞向神经元分化 Nissl bodies是神经元胞质特有的嗜碱性物质，胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞特有的标志蛋白，利用这一特性使用了相对应的抗体和染料以检测神经干细胞的分化情况。
感染慢病毒7 d后，血红素氧合酶1过表达促进了神经干细胞向神经元分化，并减少了向星形胶质细胞分化，见图6。

2.6 血红素氧合酶1过表达促进神经干细胞分化的神经元树突和轴突生长 通过显微镜观察发现，感染慢病毒7 d后血红素氧合酶1过表达组的细胞密度呈现更致密的状态，可见形态各异的未分化神经球、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，见图7A。通过免疫荧光对神经元特异性抗体Tublin-Ⅲ-β进行标记，发现慢病毒对照组的神经元轴突呈现较短的未分化状态，而血红素氧合酶1过表达组的树突、轴突更长并且细胞间的连接更多，见图7B，C。

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引言

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统疾病，根据脊髓损伤后的病理变化可以分为原发性脊髓损伤和继发性脊髓损伤[1]。原发性损伤指因创伤暴力作用于脊髓，使大量的神经元出现不可逆的轴突断裂和胞体破碎，继发性损伤包括氧化应激、炎症等介导的水肿、坏死、凋亡和自噬等，脊髓损伤区域的神经细胞由于恶劣的微环境而产生重大且不可逆的损伤[2]。神经修复是脊髓损伤最主要的治疗方式，主要手段有通过神经营养因子治疗和神经干细胞疗法等促进神经元再生和重建突触连接[3]。脑机接口结合康复训练是近期新兴的疗法，在临床研究中取得了重大进展，但是短期内很难实现广泛应用[4]。神经干细胞移植是目前前景最好的方法，目前已经进入临床试验
阶段[5-6]。
神经干细胞在中枢神经系统损伤等条件下能进行自我更新并可分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞，是神经修复领域理想的种子细胞[7-8]。然而，神经干细胞的实际应用受其脆弱性、敏感性和难以控制的分化特性的限制[9]。脊髓损伤发生后，氧化应激的微环境会诱发神经干细胞产生氧化损伤，诱导神经干细胞凋亡并抑制神经干细胞增殖和分化，严重影响神经功能的恢
复[10]。除此之外，在氧化应激的微环境下神经干细胞倾向于分化为星形胶质细胞，而不是神经元，这极大地限制了神经干细胞的作用[11]。因此，加强神经干细胞的抗氧化应激能力能有效提高其在中枢神经系统疾病中的神经修复效果[12]。
血红素氧合酶1是一种负责分解血红素的酶，可将血红素分解为一氧化碳、亚铁和胆绿素[13]。在正常生理条件下血红素氧合酶1仅在小部分神经元和神经胶质细胞中表达，当暴露于氧化应激或炎症条件下时，血红素氧合酶1表达显著上升[14]。近年来，血红素氧合酶1的抗炎、抗氧化作用已在多种细胞类型中被证实[15]。研究表明，血红素氧合酶1信号通路在脊髓损伤后运动功能恢复中起重要的作用，上调血红素氧合酶1表达能减少脊髓损伤区域中神经元的氧化应激和炎症，并促进轴突和髓鞘再生，促进运动功能的恢复[16]。然而，关于血红素氧合酶1对神经干细胞是否有保护作用的相关研究不多，并且没有统一的结论(图1)。部分学者的研究表明，上调血红素氧合酶1的表达可以增强神经干细胞的抗氧化应激能力，促进细胞增殖并减少凋亡[17-19]。然而，也有研究发现血红素氧合酶1过表达诱导了神经干细胞的凋亡[20]。

该研究采用H2O2构建神经干细胞氧化应激模型，通过血红素氧合酶1过表达慢病毒感染神经干细胞，探讨血红素氧合酶1是否对氧化应激条件下的神经干细胞具有保护作用，以及血红素氧合酶1过表达对氧化应激条件下神经干细胞增殖、分化能力的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。
1.2 时间及地点 实验于2024年1-4月在深圳平乐骨伤科医院实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 新生24 h的Balb/c小鼠由广东省医学实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(粤)2022-0002，用于提取神经干细胞，实验方案经深圳市荣湾生物医学实验动物中心批准，批准号为RW-IACUC-24-0004。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验试剂和仪器 空载体对照慢病毒和血红素氧合酶1过表达慢病毒购自吉满生物科技有限公司；抗Nestin抗体(美国ABCAM，ab307624)；抗血红素氧合酶1抗体(美国ABCAM，ab189491)；抗胶质纤维酸性蛋白抗体(美国Thermo，51-9792-82)；Nissl 530/615红色荧光染色剂(美国Thermo，N21482)；EdU-594细胞增殖检测试剂盒(上海碧云天，C0078S)；Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物，KGA1106)；丙二醛检测试剂盒(上海碧云天，S0131S)；过氧化氢酶检测试剂盒(上海碧云天，S0051)；总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(上海碧云天，S0101S)；还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽检测试剂盒(上海碧云天，S0053)；超氧化物阴离子荧光探针Dihydroethidium(上海碧云天，S0063)；CO2恒温培养箱(美国Thermo)；超净工作台(苏州净化)；Western blot电泳转印系统(美国Bio-Rad)；倒置光学显微镜(日本Olympus)；流式细胞分析仪(美国Thermo)。
1.4 方法
1.4.1 小鼠神经干细胞提取、培养和鉴定 在超净工作台中将新生24 h内的BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，用体积分数70%乙醇消毒，置于预冷的D-Hank’s缓冲液中，分离出脊髓组织，用DMEM/12基础培养基冲洗三四遍，以去除脊髓组织表面的血细胞和杂质。用无菌剪刀将脊髓组织剪碎后置于培养管中，用适量0.25%胰酶-EDTA溶液于37 ℃水浴消化15 min。当脊髓组织呈絮状时加入5 mL DNaseⅠ，用移液管轻柔吹打30次，重悬为单细胞悬液后用400目滤网过滤，1 000 r/min离心5 min，弃上清液后加入含有20 µg/L表皮生长因子、10 µg/L碱性成纤维细胞生长因子、2%B27的DMEM/F12完全培养基，计数并调整细胞浓度为1×109 L-1接种于培养瓶中，每3 d半量换液，每6 d传代1次，每天观察细胞生长、增殖、贴壁等特性。
神经干细胞的鉴定：将涂有多聚赖氨酸的载玻片置于24孔板中，将提取的神经干细胞以2×104/cm2的密度种植于24孔板，每孔1 mL，培养3 d后取出载玻片，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次后加入0.2%的TritonX-100破膜10 min，PBS清洗3次后加入10%BSA封闭1 h，PBS清洗3次后加入Alexa 594-Anti-Nestin抗体，PBS清洗3次后滴入含DAPI的封片液，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。
1.4.2 慢病毒感染和氧化应激模型 将原代神经干细胞以5×109 L-1细胞浓度种植于24孔板，每孔1 mL，分别添加空载体对照慢病毒(LV-Ctrl)和血红素氧合酶1过表达慢病毒(LV-HO-1)至1×108 TU/mL，感染24 h后换成新鲜培养基，继续培养24-48 h，通过添加嘌呤霉素(1.6 μg/mL)筛选稳定转染的细胞。在培养基中添加100 μmol/L H2O2干预12 h以模拟体内脊髓组织损伤后的氧化应激微环
境[21]，培养基中添加等量PBS为空白对照组。
1.4.3 Western blot检测 收集上述慢病毒感染以及造模后的神经干细胞球于离心管中，加入RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制剂)裂解后收集蛋白，使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，定量配平后加入蛋白上样缓冲液混合，100 ℃加热10 min制备成上样样品。取20 µg蛋白进行SDS-PAGE电泳，随后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后加入一抗4 ℃孵育过夜(抗血红素氧合酶1抗体，稀释比例为1∶1 000，抗β-actin抗体，稀释比例为1∶5 000)，TBST洗净后加入稀释好的辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(稀释比例为1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗净后使用化学发光底物进行信号检测，化学发光成像系统分析信号强度。
1.4.4 EdU-594细胞增殖检测试剂盒检测神经干细胞增殖情况在上述慢病毒感染以及造模后的神经干细胞培养基中添加EDU至终浓度为5 μmol/L，孵育24 h后离心(1 200 r/min，5 min)，使用神经干细胞培养基重悬，40 μm滤网过滤后上流式细胞仪检测。
1.4.5 Annexin V-APC/7-AAD双染细胞凋亡检测将上述慢病毒感染以及造模后的神经干细胞离心(1 200 r/min，5 min)重悬，PBS洗涤2次，加入500 μL Binding Buffer轻轻吹匀成单细胞悬液，加入5 μL Annexin V-APC 和5 μL的7-AAD染液，轻轻吹匀，室温避光反应30 min再进行过滤后上流式细胞仪检测。
1.4.6 DHE染色检测细胞活性氧水平 在上述慢病毒感染以及造模后的神经干细胞培养基中添加DHE至终浓度为5 μmol/L，37 ℃孵育30 min后进行离心、重悬，通过滤网过滤后上流式细胞仪检测。
1.4.7 Alexa 647-GFAP和Nissl双染 收集上述慢病毒感染7 d后的神经干细胞，以5×109 L-1细胞浓度接种于涂有多聚赖氨酸的24孔板，将培养基更换成含100 μmol/L H2O2的分化培养液(DMEM/F12，体积分数2%胎牛血清)，12 h后弃去培养基，换入不含H2O2的分化培养液，培养60 h后检测分化结果。使用封闭液室温封闭15 min后离心(1 200 r/min，5 min)，去除封闭液后加入Alexa 647-GFAP抗体室温孵育1 h后离心(1 200 r/min，5 min)，破膜清洗液洗2遍，加入NeuroTrace Nissl 530/615 红色荧光染色剂室温孵育10 min后去除染液，用PBS重悬细胞，随后上流式细胞仪检测。
1.4.8 氧化-还原相关酶类的检测 根据碧云天产品说明书，分装标准品并在96孔板中正确上样，随后神经干细胞裂解液样本也同样上样，根据标准曲线计算各组神经干细胞中丙二醛、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶水平。
1.4.9 TUNEL染色 收集上述慢病毒感染以及造模后的细胞球于离心管中，PBS清洗3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，加入0.2% TritonX-100破膜10 min，PBS清洗3次，加入配置好的TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗3次，涂片后在荧光显微镜下观察。
1.4.10 免疫荧光检测 将涂有多聚赖氨酸的载玻片置于24孔板中，将上述慢病毒感染7 d后的神经干细胞以2×104/cm2的密度种植于24孔板，将培养基更换成含100 μmol/L H2O2的分化培养液，12 h后弃去培养基，换入不含H2O2的分化培养液，培养60 h后取出载玻片，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS清洗3次后加入0.2%的TritonX-100破膜10 min，PBS清洗3次后加入10%BSA封闭1 h，PBS清洗3次后加入Anti-Tublin-Ⅲ-β抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，PBS清洗3次后加入FITC标记的荧光二抗(1∶100稀释)，室温避光孵育1 h，PBS清洗3次后滴入含DAPI的封片液，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。
1.5 主要观察指标 ①血红素氧合酶1过表达慢病毒载体及空载体转染神经干细胞后的转染效率和血红素氧合酶1的表达；②血红素氧合酶1过表达对氧化应激微环境下神经干细胞增殖、凋亡和分化的影响。

1.6 统计学分析 所有实验重复至少3次，使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过福建省疾病预防控制中心生物统计学专家肖方震主任医师审核。

讨论

脊髓损伤是一个灾难性事件，对生物医学学科来说仍然是一项巨大的挑战[22]。全球学者在数十年的研究中寻求有效的治疗方案以最大程度地减轻或逆转神经功能的丧失，在康复治疗、手术和生物工程领域取得了可喜的成果[23-24]。然而，由于脊髓损伤的发病机制包含多种复杂的细胞和生化过程，如氧化应激、炎症反应、细胞自噬、凋亡等，临床上尚没有有效的方法能改善脊髓损伤后的神经功能[25]。
神经干细胞能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，在脊髓损伤后神经功能恢复中起着关键的作用[26]。生理情况下，神经干细胞保持静止，脊髓损伤发生后，神经干细胞被激活并迁移到脊髓损伤区域[27]。研究表明，迁移至脊髓损伤区域的神经干细胞在炎症、氧化应激的微环境下多数分化为星形胶质细胞，从而形成了围绕受伤中心的胶质瘢痕[28]。脊髓损伤区域氧化应激的微环境抑制神经干细胞增殖并诱导其凋亡，同时抑制神经干细胞向神经元分化[29]。调控神经干细胞的命运对脊髓损伤后神经功能的恢复至关重要[30]。
血红素氧合酶1是一种与多种生理过程相关的酶，在多种物种的大多数组织中普遍表达，能催化游离的血红素降解并能发挥重要的生理保护作用[31]。课题组前期研究表明，上调血红素氧合酶1的表达能减轻细胞受到的氧化损伤，从而发挥对细胞的保护作用和抗凋亡作用[32-34]。一些学者认为神经干细胞中血红素氧合酶1表达上升能保护神经干细胞免受氧化损伤，并能促进其分化[19]。然而，血红素氧合酶1是否能减轻氧化应激微环境中神经干细胞的氧化损伤和凋亡目前并不明确。
该研究从小鼠脊髓中提取原代神经干细胞，悬浮培养时细胞汇聚成细胞球，免疫荧光鉴定其表面标志物Nestin表达阳性，提示神经干细胞分离培养成功。然后分别采用LV-Ctrl和LV-HO-1感染神经干细胞，通过在培养基中添加H2O2模拟氧化应激的微环境，结果发现血红素氧合酶1过表达促进了氧化应激微环境中神经干细胞的增殖并抑制其凋亡，随后发现血红素氧合酶1过表达抑制了氧化应激微环境下神经干细胞的脂质过氧化，并增强了维持氧化-还原稳态密切相关的酶类表达，降低了神经干细胞的活性氧水平，这进一步说明血红素氧合酶1过表达减轻了氧化应激微环境中神经干细胞的氧化损伤。除此之外，血红素氧合酶1过表达促进了氧化应激环境下神经干细胞的神经元分化及神经元的轴突生长。该研究通过构建稳定过表达血红素氧合酶1的神经干细胞并以H2O2模拟氧化应激微环境，直接证实血红素氧合酶1对神经干细胞的抗氧化保护作用。但体外细胞实验与生物体内的环境不同，体内的复杂生化环境可能会影响研究的最终结果。因此，需要进一步的体内实验验证该结论。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

血红素氧合酶1促进氧化应激条件下神经干细胞向神经元分化

Heme oxygenase 1 promotes differentiation of neural stem cells into neurons under oxidative stress condition

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