2.1 体外培养的骨髓间充质干细胞阳性表达 CD29、 CD44、Sca-1 为了鉴定骨髓间充质干细胞，对第 3 代细 胞进行了流式细胞实验。流式细胞仪检测骨髓间充质干 细胞表面标记物 CD29、CD44、Sca-1 的平均阳性表达率分 别为 92.23%，96.93% 和 92.03%，CD31 和 CD45 的平均阳 性表达率分别为 0.81% 和 0.29%，见图 1。



2.2 体外培养的骨髓间充质干细胞具备成骨、成脂诱导分 化能力 经成骨诱导 21 d 后，茜素红染色可见红色颗粒物， 见图 2A；经成脂诱导 21 d 后，油红 O 染色可见大量红色 脂滴，见图 2B，表明体外培养的骨髓间充质干细胞经诱 导后可向成骨、成脂细胞分化。



2.3 不同浓度补骨脂素对骨髓间充质干细胞活力无显著 影响 为了检测补骨脂素本身对骨髓间充质干细胞活力 的影响，以添加不同浓度补骨脂素的培养基培养骨髓间 充质干细胞，以 MTT 法检测细胞活力变化，发现在 0， 24，48，72 h 时， 对 照 组、 补 骨 脂 素 25，50，100， 200 μmol/L 组间没有显著差别 (P > 0.05)，见图 3。



2.4 补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间 充质干细胞成骨分化能力降低 为了检测补骨脂素对环磷 酰胺条件培养基处理后骨髓间充质干细胞成骨分化能力 降低的影响，在环磷酰胺条件培养基处理细胞后，对其 进行成骨分化诱导，同时在诱导液中分别添加终浓度为0，10，50，100，200 μmol/L 的补骨脂素，培养 6 d 后进 行碱性磷酸酶染色，发现与对照组相比，环磷酰胺条件培 养基组染色强度减弱，而环磷酰胺条件培养基 + 补骨脂素 200 μmol/L 组染色强度明显恢复，见图 4。说明补骨脂素 对环磷酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞成骨分化 能力降低有逆转作用。



2.5 补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨髓 间充质干细胞成骨分化标志基因 mRNA 和蛋白表达降 低 为了检测补骨脂素逆转骨髓间充质干细胞成骨分化能 力的机制，用 RT-qPCR 法检测了各组成骨分化标志基因 Runx2、ALP、Osteocalcin 和骨保护素 mRNA 表达变化，发 现与对照组相比，环磷酰胺条件培养基组 Runx2、ALP、 Osteocalcin成骨标志基因mRNA表达都显著降低(P < 0.01)。与环磷酰胺条件培养基组相比，环磷酰胺条件培养基 + 补 骨脂素 200 μmol/L 组干预 24，48，72 h 的 Runx2、ALP 和 骨保护素 mRNA 表达均显著升高 (P < 0.001)；干预 48， 72 h 的 Osteocalcin mRNA 表 达 显 著 升 高 (P < 0.01，P < 0.001)，见图 5。Western blot 法检测各组成骨分化标志基 因 Runx2 蛋白表达变化，发现与对照组相比，环磷酰胺条 件培养基组 Runx2 蛋白表达显著降低 (P < 0.001)。与环磷 酰胺条件培养基组相比，环磷酰胺条件培养基 + 补骨脂素 200 μmol/L 组干预 72 h 的 Runx2 蛋白表达显著升高 (P < 0.01)，见图 6，表明补骨脂素通过促进 Runx2、ALP 和 Osteocalcin mRNA 表达和 Runx2 蛋白表达而逆转骨髓间充 质干细胞的成骨分化能力。







2.6 补骨脂素可以逆转环磷酰胺条件培养基导致的骨 髓间充质干细胞 Wnt/β-catenin 通路相关基因 mRNA 和 蛋白表达变化 为了进一步检测补骨脂素逆转骨髓间充 质干细胞成骨分化能力的机制，用 RT-qPCR 法检测了各 组 Wnt/β-catenin 通路相关基因 Wnt1、Wnt4、Wnt10b、 β-catenin 和 c-MYC mRNA 表 达 变 化， 与 对 照 组 相 比， 环 磷 酰 胺 条 件 培 养 基 组 β-catenin 和 Wnt10b mRNA 表 达都显著降低 (P < 0.001)；与环磷酰胺条件培养基组相 比，环磷酰胺条件培养基 + 补骨脂素 200 μmol/L 组干 预 24，48，72 h 的 β-catenin mRNA 表达均显著升高 (P < 0.001)；环磷酰胺条件培养基 + 补骨脂素 200 μmol/L 组 干预 24 h 使 Wnt1 和干预 24，72 h 使 Wnt4 mRNA 表达 均显著升高 (P < 0.05，P < 0.05，P < 0.001)；环磷酰胺条 件 培 养 基 + 补 骨 脂 素 200 μmol/L 组 干 预 24，48，72 h 的 Wnt10b mRNA 表达均显著降低 (P < 0.001，P < 0.001， P < 0.05)；环磷酰胺条件培养基 + 补骨脂素 200 μmol/L 组干预24，48 h的c-MYC mRNA表达均显著升高(P < 0.001， P < 0.01)，见图 7。 
Western blot 检测各组 Wnt/β-catenin 通路相关蛋白 表达变化，与对照组相比，环磷酰胺条件培养基组 Acttve β-catenin、c-MYC和CyclinD1蛋白表达显著降低(P < 0.001)， DKK1 蛋白表达显著升高 (P < 0.01)。与环磷酰胺条件培养 基组相比，环磷酰胺条件培养基 + 补骨脂素 200 μmol/L 组干预 48，72 h 的 Acttve β-catenin 和 CyclinD1 蛋白表达 均显著升高 (P < 0.001)；干预 24，72 h 的 c-MYC 蛋白表达 均显著升高 (P < 0.05，P < 0.001)；干预 72 h 的 DKK1 蛋白 表达显著降低 (P < 0.001)，见图 8。表明补骨脂素对环磷 酰胺条件培养基导致的骨髓间充质干细胞 Wnt/β-catenin 通路相关基因 mRNA 和蛋白表达变化有逆转作用，推测补 骨脂素可能通过调节 Wnt/β-catenin 通路相关蛋白 ( 促进 Wnt1、Wnt4、β-catenin、c-MYC mRNA 和 Acttve β-catenin、 c-MYC、CyclinD1 蛋白表达，抑制 DKK1 蛋白表达 ) 而促进 成骨分化标志基因表达，最终达成恢复骨髓间充质干细 胞成骨分化能力的效果。

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临床报道环磷酰胺等联合辅助治疗癌症疗效确切， 但随着化疗的推进，会出现严重的毒副作用，多数患者 接受治疗后出现骨质流失加快、骨密度降低和骨折 [1-4] 。 癌症治疗引起的骨量丢失是一种公认的长期毒性作用， 严重影响患者的生活质量 [5-6] 。实验发现环磷酰胺及其代 谢产物通过直接阻止前成骨细胞的细胞分裂，从而减少 骨表面的成骨细胞数量，抑制骨的形成 [7] 。作者前期研究 在环磷酰胺导致骨质疏松小鼠模型上提供了其抑制成骨 作用的分子证据，并显示抑制成骨作用与骨髓间充质干 细胞成骨分化功能降低及 Wnt/β-catenin 通路下调密切相 关 [8] 。骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞，具有分化为 成骨细胞、脂肪细胞等多种不同间质细胞谱系的潜能 [9] ， 当其分化功能受损后，导致成骨作用减弱，引起骨形成 和骨吸收失衡，进而导致骨代谢疾病。
Wnt/β-catenin 信号通路在骨髓间充质干细胞成骨分 化过程中扮演重要角色 [9-11] 。近年来研究发现，多种植物 单体通过调控骨髓间充质干细胞中 Wnt/β-catenin 信号通 路的相关因子，促进骨生成，防治骨质疏松，如淫羊藿 苷 [12] 、芝麻素 [13] 、西红花苷等 [14] 。补骨脂素是三环香豆 素样芳香族化合物，为常用补肾中药补骨脂的主要生物活 性成分，现代药理学研究显示补骨脂素具有抗骨质疏松、 抗肿瘤、抗炎等作用 [15-17] ，还可显著抑制人乳腺癌、胶质 瘤和骨肉瘤细胞的增殖 [18-20] 。研究显示补骨脂素通过激活 Wnt4/β-catenin 通路促进软骨细胞增殖 [21] ，也可以通过激 活 TGF-β/Smad3 途径促进人骨髓间充质干细胞成骨分化， 增加骨形成 [22] ，那么补骨脂素对环磷酰胺抑制小鼠骨髓 间充质干细胞成骨分化是否有治疗作用？如果有治疗作 用，是否与其调节 Wnt4/β-catenin 信号通路有关？此次实 验通过在体外建立环磷酰胺抑制小鼠骨髓间充质干细胞 成骨分化模型，检测补骨脂素对其恢复作用以及对 Wnt/ β-catenin 信号通路的调控，为中西医结合防治临床肿瘤 化疗所致的骨相关疾病提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1 设计 细胞学和分子生物学实验。 

1.2 时间及地点 实验于 2015 年 5 月至 2023 年 7 月在上 海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所完成。 

1.3 材料 

1.3.1 实验仪器 CFX96 实时荧光定量 PCR 仪 (BIO-RAD， USA)；ChemiDoc MP 凝胶成像仪 (BIO-RAD，USA)；DU 800 UV/Vis 分光光度计 (Beckman Coulter，USA)；CO2 培养箱 (Thermo Scienttffc，USA)；全波长扫描多功能读数仪(Thermo Scienttffc，USA)；5417R 高 速 冷 冻 离 心 机 (Eppendorf， DEU)。

1.3.2 药品和试剂 补骨脂素 ( 纯度 > 99%，20 mg/ 瓶， 批号：150301，上海友思生物技术有限公司 )；环磷酰胺 (0.2 g/ 瓶，批号：13022825，恒瑞医药股份有限公司 )； Trizol Reagent(Invitrogen，USA)；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq(Takara，JPN)；PCR 引物 ( 生工生物工程有限公司，中国 )；蛋白抽提试剂： RIPA 裂 解 液 ( 货 号 P0013B)、PMSF( 货 号 ST506)、BCA 蛋白浓度测定试剂盒 ( 货号 P0010S)( 碧云天，中国 )； Penicillin-Streptomycin(P-S，Biowest，FRA)； 流 式 抗 体 CD29-FITC( 克 隆 号 Ha2/5)、CD31-PE( 克 隆 号 MEC13.3)、 CD45-PerCP-Cy5.5( 克 隆 号 30-F11)(BD，USA)；CD44-APC克隆号 IM7)、Sca-1-PE-Cy7( 克隆号 D7) 及 CD45 同型对 照Rat IgG2b-PerCP-Cy5.5(克隆号eB149/10H5)(eBioscience， USA)；碱性磷酸酶染色试剂 1-Step NBT-BCIP(Pierce，Rockford，IL，USA)；茜素红 S(A5533，Sigma-Aldrich，USA)； OriCell 小鼠骨髓间充质干细胞成脂诱导分化试剂盒 (MUXMX-90031，Cyagen，中国 )；MTT 试剂、抗坏血酸、β- 甘 油磷酸钠、地塞米松、二甲基亚砜 (Sigma-Aldrich，USA)； Runx2( 货号 ab76956)、DKK1( 货号 ab61275) 抗体 (Abcam， GBR)；Acttve β-catenin( 货号 8814)、c-MYC( 货号 5605)、 Cyclin D1( 货 号 2978) 抗 体 (Cell Signaling Technology， USA)；β-acttn 抗体 (Sigma-Aldrich，USA)；辣根过氧化物 酶标记的二抗 ( 碧云天，中国 )。 

1.3.3 细胞 小鼠胚胎肝细胞株 (BNL CL.2) 购于中国科学院 细胞库。 1.3.4 实 验 动 物 8 周 龄 雄 性 C57BL/6 小 鼠 30 只，SPF 级，体质量 18-22 g，由上海斯莱克实验动物有限责任 公 司 提 供， 合 格 证 号：2015000500404， 许 可 证 号： SCXK( 沪 )2012-0002。 实 验 过 程 中 对 动 物 的 处 置 符 合 上 海 中 医 药 大 学 实 验 动 物 伦 理 学 要 求 ( 伦 理 批 号： PZSHUTCM2211070009)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养 采用改良的全 骨髓贴壁法分离培养 C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞 [23] ， 用 α-MEM 培养基 ( 含体积分数为 10% 胎牛血清及 1% 青 链霉素 ) 培养，第 5 天用无菌 PBS 清洗 2 次后换液，待细 胞生长至 80% 融合度后，胰酶消化进行传代培养 ( 此为 第1代)。至第3代时进行表型、功能鉴定或进行相关实验， 96 孔板、24 孔板、6 孔板、10 cm 培养皿接种密度分别 为 1×104 ，1×105 ，4×105 ，2×106 个 / 孔 ( 皿 )。 

1.4.2 骨髓间充质干细胞表型鉴定 取第 3 代骨髓间充质 干细胞，待生长至 80% 融合度后，胰酶消化并制备细胞 悬液，400×g 离心 5 min，弃去上清液，重悬细胞，每管 取 5×105 个细胞，设置空白对照管、同型对照管 (CD45) 和各单染管，按说明书分别加入 CD29-FITC、CD44-APC、 Sca-1-PE-Cy7、CD31-PE、CD45-PerCP-Cy5.5 抗体及其同型 对照 IgG2b-PerCP-Cy5.5，混匀，避光 4 ℃孵育 30 min，离 心洗去多余抗体，加入 300 μL PBS，上 Cytoffex 流式细胞 仪检测。 

1.4.3 骨髓间充质干细胞分化功能鉴定 取第 3 代骨髓间 充质干细胞，分别铺 24 孔板 ( 用于成骨分化及鉴定 ) 和 10 cm 培养皿 ( 用于成脂分化及鉴定 )。用成骨分化诱导 液 (α-MEM 完全培养基，含 10 mmol/L β- 甘油磷酸钠、 50 mg/L L- 抗坏血酸及 10-8 mol/L 地塞米松 ) 培养 21 d， 每周更换 2 次培养基，然后用体积分数为 10% 甲醛溶液 固定细胞 20 min，再用 PBS 洗 2 次，培养孔中加入 0.1%茜素红 S[ 以 0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.3) 配制 ]，在 37 ℃下 染色 30 min，清洗后观察并拍照。成脂分化诱导和鉴定 按试剂盒说明书进行，成脂诱导 21 d 后，以油红 O 染色 30 min，显微镜下观察并拍照。

1.4.4 药物配制 补骨脂素 (20 mg/ 瓶 ) 用二甲基亚砜 溶解为 1×10-1 mol/L 后，以 α-MEM 基本培养基稀释为 1×10-3 mol/L 补骨脂素母液，1 mL/ 管分装密封，-20 ℃贮 藏备用。 

1.4.5 环磷酰胺条件培养基的制备 因环磷酰胺在体外无 细胞毒性，需经体内肝脏微粒体细胞色素 P450 酶氧化后 分解生成磷酰胺氮芥，才能发挥细胞毒作用，故制备条 件培养基用于体外研究，方法同前期研究 [23] 。将小鼠胚 胎肝细胞株 (BNL CL.2) 用 DMEM 完全培养基 ( 含体积分数 为 10% 胎牛血清、1% 青链霉素 ) 培养于 25 cm 培养皿； 待细胞达 70% 融合度后，加入 DMEM 基础培养基 ( 含 1% 青链霉素、无胎牛血清 ) 饥饿处理 12 h，更换为含有环 磷酰胺 (4 000 μmol/L) 的 DMEM 培养基 ( 含体积分数为 2% 胎牛血清、1% 青链霉素 )，培养 24 h；收集培养基， 3 200×g 离心 15 min，0.22 μm 滤器过滤后分装，-20 ℃保 存备用；以不含环磷酰胺的相应溶剂处理所得的条件培 养基作为对照。 

1.4.6 细胞活力检测 取第 3 代骨髓间充质干细胞，接种 于 96 孔板培养，待 80% 融合度后更换为 α-MEM 培养基 ( 含体积分数为 5% 胎牛血清 )，补骨脂素各组在培养基 中加入补骨脂素母液，使其终浓度为 0，25，50，100， 200 μmol/L，每个浓度 6 个副孔，对照组加入等体积的基 本培养基，于培养 24，48，72 h 进行 MTT 检测，0 h 为未 添加补骨脂素培养液即刻检测。用酶标仪于 570 nm 波长 处测定吸光度 (A) 以代表细胞活力。细胞活力 (%)=A 给药组 / A 对照组 ×100%。 

1.4.7 碱性磷酸酶染色 取第 3 代骨髓间充质干细胞，接 种于 24 孔板培养，待达 80% 融合度后更换环磷酰胺条件 培养基培养，对照组用不含环磷酰胺条件培养基作对照， 干预 72 h 后更换为成骨分化诱导液培养，环磷酰胺条件 培养基 + 补骨脂素 10，50，100，200 μmol/L 组在成骨分化诱导液中分别加入补骨脂素母液，使其终浓度为 10， 50，100，200 μmol/L，环磷酰胺条件培养基组加入等体 积成骨分化诱导液，每 3 d 换液 1 次，于第 6 天弃旧液， 无菌 PBS 洗 2 次，用体积分数为 10% 中性甲醛溶液固定 10 min，加入碱性磷酸酶染色试剂 1-Step NBT-BCIP，锡箔 纸包裹避光，37 ℃孵育30 min，观察碱性磷酸酶染色情况， 拍照保存结果。 

1.4.8 Real ttme-qPCR 分析 取第 3 代骨髓间充质干细胞， 接种于 6 孔板，待达 80% 融合度后更换环磷酰胺条件培 养基培养，对照组用不含环磷酰胺条件培养基作对照， 干预 72 h 后更换为成骨分化诱导液培养，环磷酰胺条件 培养基 + 补骨脂素 72，48，24 h 组按 72，48，24 h 时间 倒序添加补骨脂素，使各组可以一起收集细胞，补骨脂 素干预浓度为 200 μmol/L，环磷酰胺条件培养基组加入等 体积成骨分化诱导液。干预后吸弃上清，PBS 洗 2 次，用 Trizol消化，按说明书提取总RNA，检测RNA质量及浓度后， 按 RT-PCR 法测定试剂盒及 Bio-Rad CFX96 型实时荧光定量 PCR 仪操作步骤说明，检测相关基因的表达，反应条件： 95 ℃预变性 1 min，95 ℃变性 5 s，58 ℃退火 15 s，72 ℃ 延伸 30 s，共 40 次循环。以 β-acttn 为内参，2-ΔΔct 法统计 分析，目的基因引物序列见表 1。

1.4.9 Western blot 分析 取第 3 代骨髓间充质干细胞，接 种于 10 cm 培养皿，待 80% 融合度后更换环磷酰胺条件 培养基培养，对照组用不含环磷酰胺条件培养基作对照， 干预 72 h 后更换为成骨分化诱导液培养，环磷酰胺条件 培养基 + 补骨脂素 72，48，24 h 组按 72，48，24 h 时间 倒序添加补骨脂素，使各组可以一起收集细胞，补骨脂 素干预浓度为 200 μmol/L，环磷酰胺条件培养基组加入等 体积成骨分化诱导液。干预后吸弃上清，PBS洗2次，吸干，每皿用 400 μL RIPA 细胞裂解液 ( 含有 1 mmol/L PMSF) 消 化，按说明书提取总蛋白。BCA 法测蛋白浓度，进行 SDSPAGE 电泳分离蛋白，转膜和封闭，加入 Acttve β-catenin、 Runx2、Cyclin D1、C-MYC 抗体 ( 稀释比例为 1 ∶ 1 000)， DKK1 抗体 ( 稀释比例为 1 ∶ 500)，β-acttn 抗体 ( 稀释比 例为 1 ∶ 10 000)，4 ℃摇床过夜孵育，漂洗后加入 HRP 多克隆二抗室温孵育 1 h，再次漂洗，加入高灵敏度底物 ECL 发光试剂盒 (A ︰ B=1 ︰ 1) 显色底物进行化学显色。 

1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞流式鉴定及成骨 ( 茜素红染色 )、成脂 ( 油红 O 染色 ) 分化功能验证；②补 骨脂素对骨髓间充质干细胞活力的影响 (MTT)；③补骨脂 素对环磷酰胺条件培养基诱导骨髓间充质干细胞成骨分 化能力的影响 ( 碱性磷酸酶染色 )；④补骨脂素对环磷酰 胺条件培养基诱导骨髓间充质干细胞成骨分化标志基因 和 Wnt/β-catenin 通路相关基因 mRNA 和蛋白表达的影响 (RT-qPCR 和 Western blot 分析 )。

1.6 统计学分析 采用 GraphPad Prism 8 软件处理实验数 据。实验数据以 x - ±s 表示，两两比较采用 t 检验法，多组 间比较采用 ANOVA-One Way 检验。P < 0.05 为差异有显著 性意义。文章统计学方法已经通过上海中医药大学生物 统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

环磷酰胺是一种烷基化类化疗药物，经体内肝细胞 色素 P450 酶作用后，产生的代谢物发挥细胞毒作用 [24] ， 这是其发挥治疗作用的基础，同时也会导致机体组织细 胞损伤。该实验通过制备环磷酰胺条件培养基干预骨髓 间充质干细胞模型，模拟环磷酰胺在体内经肝脏代谢后 对骨髓间充质干细胞的影响。骨髓间充质干细胞已被证 实在骨质疏松症的发生和发展中起着关键作用，并有望 成为治疗骨质疏松症的潜在种子细胞。骨髓贴壁培养分 离法是经典的分离骨髓间充质干细胞的方法 [23，25] ，该研究从小鼠骨髓分离培养骨髓间充质干细胞，经过流式鉴 定具有间充质干细胞的免疫表型和成骨、成脂分化潜能。
作者在前期研究中发现环磷酰胺条件培养基可以使 骨髓间充质干细胞成骨分化能力降低 ( 碱性磷酸酶染色减 弱 )，并使成骨分化标志基因 (Runx2、ALP、Osteocalcin)、 Wnt/β-catenin 通路相关基因 (Wnt4、β-catenin、c-MYC、 CyclinD1)mRNA 和蛋白表达降低 [23] 。动物实验中发现环 磷酰胺使小鼠胫骨骨密度和骨体积分数等指标降低， 骨 小 梁 减 少， 腰 椎 Runx2、ALP、Osteocalcin、Wnt1、 Wnt4、Wnt10b、β-catenin、CyclinD1 的 mRNA 表达降低， Runx2、β-catenin、c-MYC、CyclinD1 蛋白表达也降低 [8] 。
补骨脂素是常用补肾中药补骨脂的主要有效成分。 实验结果发现，补骨脂素对小鼠骨髓间充质干细胞活力 没有显著影响 (P > 0.05)，但可以逆转环磷酰胺条件培养 基导致的骨髓间充质干细胞成骨分化能力降低，说明补 骨脂素对小鼠骨髓间充质干细胞的增殖没有影响，却促 进其成骨分化，这一点与在大鼠软骨细胞 [21] 、人源成骨 细胞中的研究不同 [26] ，在后面 2 种细胞中，补骨脂素都 通过不同的机制促进其增殖。而在大鼠骨髓间充质干细 胞和人骨髓间充质干细胞研究中 [22，27] ，补骨脂素都通过 不同的机制既促进其增殖，又促进其成骨分化。是否因 为细胞来源不同而有这样差别，有待进一步研究。
根据细胞活力实验和碱性磷酸酶染色结果，选用 200 μmol/L 补骨脂素作为后续实验的干预剂量，在关于补 骨脂素的研究中这是相对大的剂量。既往研究在大鼠骨髓 间充质干细胞中使用 107 μmol/L (20 μg/mL) 补骨脂素促进 其成骨分化 [27] ，而在大鼠软骨细胞中使用 1 μmol/L 补骨 脂素促进其增殖 [21] ，在人骨髓间充质干细胞中 1 μmol/L 补骨脂素具有最好的促增殖和成骨分化效果 [22] ，在人源成 骨细胞中 15 μmol/L 补骨脂素具有最佳促进增殖效果 [26] ， 在小鼠骨骼干细胞中 10 μmol/L 补骨脂素具有促进其增殖 和维持其干性的作用 [28] 。是否因为细胞来源与类型不同 而有这样差别，有待进一步研究数据的积累。
碱性磷酸酶染色可以反映成骨细胞早期骨性分化强 弱。实验结果显示环磷酰胺条件培养基使骨髓间充质干细 胞成骨分化能力降低，这与前期细胞研究结果和动物模型 研究结果都一致 [8，23] ，该研究在体外细胞实验中显示补骨 脂素对此有逆转作用。分子检测显示环磷酰胺条件培养基 使骨髓间充质干细胞中成骨分化标志基因 Runx2、ALP、 Osteocalcin mRNA 和 Runx2 蛋白表达降低，使骨髓间充质 干细胞中 Wnt/β-catenin 通路相关基因 Wnt4、β-catenin、 c-MYC mRNA 表达降低，Acttve β-catenin、c-MYC、CyclinD1 蛋白表达降低及 DKK1 蛋白表达升高，这也与前期研究在 模型小鼠和细胞实验中的结果一致 [8，23] ，而补骨脂素对于 上述指标的降低及 DKK1 升高具有显著逆转作用。
在环磷酰胺条件培养基处理后，添加补骨脂素后 在不同时间检测相关通路分子的表达，Wnt1 和 Wnt4 都有升高 ( 而 Wnt10b 没有升高，显示补骨脂素不通过 Wnt10b 起作用 )，其中比较突出的是 Wnt4，其 mRNA 表 达 升 高 2-8 倍， 具 有 深 入 研 究 的 价 值。Wnt4 属 于 保守的 Wnt 蛋白家族，在胚胎发育和成年后的多种细 胞类型的发育、分化中发挥着重要作用。越来越多的 证据表明，Wnt4 是一种特殊的配体，基于不同的细 胞过程，它不仅可以激活非经典的不依赖于 β-catenin 的通路，而且还可以作用于经典的 β-catenin 信号通路 [29] 。 目前研究证实在小鼠前成骨细胞和人骨髓间充质干细胞中 Wnt4 同时通过经典的 Wnt4/β-catenin 和非经典的 Wnt4/ p38-JNK MAPK 途径 [30-32] ，还有通过抑制 NF-κB 途径促进 骨形成 [33] 。实验中补骨脂素处理骨髓间充质干细胞 72 h 后，Wnt4 提高表达 8 倍，表明 Wnt4 具有重要调节作用， 从 Acttve β-catenin 和 DKK1 蛋白的改变，推测是通过经典 的 Wnt4/β-catenin 发挥促成骨分化作用的，然而是否通 过非经典的 Wnt4/p38-JNK MAPK 途径或者通过抑制 NF-κB 途径还有待进一步研究。
环磷酰胺条件培养基使骨髓间充质干细胞中 CyclinD1 蛋白表达显著降低。前期研究显示在环磷酰胺导致骨质 疏松的模型小鼠中，腰椎 CyclinD1 在 mRNA 和蛋白水平 都显著降低 [8] 。该实验研究结果与此一致。CyclinD1 蛋白 是细胞周期 G1/S 期特异性蛋白，主要是促进细胞增殖。 CyclinD1 蛋白的降低，必然带来细胞周期的阻滞、细胞分 裂的减慢。早期研究表明环磷酰胺及其代谢物阻止前成 骨细胞和破骨细胞的分裂，导致细胞数量减少 [7] ，此项研 究为其提供了部分分子证据。该实验中补骨脂素可以显 著升高 CyclinD1 蛋白的表达，表明在体外细胞实验中它 可以逆转环磷酰胺导致的细胞分裂阻滞。
该实验中 200 μmol/L 补骨脂素使环磷酰胺条件培养 基处理的骨髓间充质干细胞中骨保护素 mRNA 的表达升 高 1.5-3 倍，表明补骨脂素在促进成骨分化的同时，也抑 制破骨作用，这与其他研究结果一致 [34] 。众所周知，破 骨作用的活跃有利于肿瘤细胞的转移，所以补骨脂素抑 制破骨作用，也具有阻碍肿瘤细胞转移的效果。
综上所述，应用环磷酰胺条件培养基干预骨髓间充 质干细胞后，导致骨髓间充质干细胞成骨分化障碍。补 骨脂素可通过提高成骨分化标志基因 Osteocalcin、ALP、 Runx2 和骨保护素的 mRNA 表达及 Runx2 蛋白表达，保 护骨髓间充质干细胞成骨分化能力，其机制可能与激活 Wnt4/β-catenin 信号途径有关。肿瘤患者放化疗后，容易 导致骨质疏松，补骨脂素可以通过促进成骨作用，改善化 疗导致的骨质疏松；辅助肿瘤治疗，抑制肿瘤增殖；还通 过抑制破骨作用，阻碍肿瘤骨转移。相关机制需要实验深入阐明，以增加对该药物的认识。该实验为进一步体内、 体外实验奠定了基础，同时也为化疗导致骨质疏松的药 物开发提供了基础数据支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义： 

补骨脂素：属呋喃香豆素类化合物，为常用补肾中药补骨脂的主要生物活性成分，现代药理学研究显示补骨脂素具有抗骨质疏松、抗肿 瘤、抗菌和抗炎等作用。 

骨髓间充质干细胞：是骨髓中一类来源于中胚层的多能干细胞，具有分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种不同间质细胞谱系的能力。

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中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

传统补肾中药补骨脂中提取的单体成分——补骨脂素，已被证明具有抗骨质疏松(如促进成骨，抑制破骨，促进骨折修复等)、抗肿瘤(如抑制乳腺癌、骨肉瘤细胞增殖等)、抗炎(如降低软骨细胞炎症，治疗骨关节炎等)作用。肿瘤病人放化疗后，容易导致骨质疏松，补骨脂素可以通过促进成骨作用，改善化疗导致的骨质疏松；辅助肿瘤治疗，抑制肿瘤增殖；还通过抑制破骨作用，阻碍肿瘤骨转移。相关机制需要实验深入阐明，以增加对该药物的认识，给病人带来福音。

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