肾虚血瘀型SD大鼠膝骨关节炎模型的建立与验证

doi:10.12307/2024.548

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (27): 4273-4280.doi: 10.12307/2024.548

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

肾虚血瘀型SD大鼠膝骨关节炎模型的建立与验证

杨程1，2，李玉生1，2，焦泓焯1，2，尚曼3，刘琪1，2，李林臻1，2，樊方阳1，2，张成龙1，2，张晓宇1，2，张君涛1，2

1天津中医药大学第一附属医院，天津市 300381；2国家中医针灸临床医学研究中心，天津市 300381；3天津医科大学基础医学院，天津市 300193

收稿日期:2023-09-07 接受日期:2023-10-30 出版日期:2024-09-28 发布日期:2024-01-26
通讯作者: 张君涛，博士，硕士生导师，主任医师，天津中医药大学第一附属医院，天津市 300381；国家中医针灸临床医学研究中心，天津市 300381
作者简介:杨程，男，1995年生，天津中医药大学在读硕士，主要从事中医骨关节疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(82074470)，项目负责人：张君涛

Establishment and validation of the Sprague-Dawley rat model of osteoarthritis with kidney deficiency and blood stagnation

Yang Cheng1, 2, Li Yusheng1, 2, Jiao Hongzhuo1, 2, Shang Man3, Liu Qi1, 2, Li Linzhen1, 2, Fan Fangyang1, 2, Zhang Chenglong1, 2, Zhang Xiaoyu1, 2, Zhang Juntao1, 2

1The First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China; 2National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China; 3School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, Tianjin 300193, China

Received:2023-09-07 Accepted:2023-10-30 Online:2024-09-28 Published:2024-01-26
Contact: Zhang Juntao, MD, Master’s supervisor, Chief physician, The First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China; National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China
About author:Yang Cheng, Master candidate, The First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300381, China; National Clinical Research Center for Chinese Medicine Acupuncture and Moxibustion, Tianjin 300381, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 82074470 (to ZJT)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

肾虚血瘀：“肾虚血瘀证”作为中医理论中的重要证候之一，其中包含“肾虚”和“血瘀”2个病机，肾虚指天癸竭至、肾气亏虚，血瘀指瘀血阻滞气血经络；二者相互兼容、互相影响，肾气虚弱致使骨髓失养，日久而致气血不畅，致使瘀血生成阻滞气机，最终形成肾虚血瘀。肾虚血瘀是膝骨关节炎的常见证候。
膝骨关节炎：是一种膝骨关节退行性疾病。临床表现为膝关节疼痛、肿胀、活动受限甚至畸形等，病理学改变以软骨损伤为主，是临床常见的致畸性疾病。

背景：肾虚血瘀证候作为膝骨关节炎常见中医证候，又是膝骨关节炎的基本病机，二者之间有着重要联系。但肾虚血瘀证候如何促进膝关节软骨损伤及其潜在机制并不明确，还需进一步研究。

目的：探讨肾虚血瘀证候对SD大鼠膝骨关节炎进程的影响。
方法：将16只SD大鼠随机分为模型观察组和对照组，每组8只。模型观察组采用卵巢摘除方法建立肾虚模型，2个月后采用改良HULTH手术进行膝骨关节炎造模，HULTH手术后1周皮下注射盐酸肾上腺素进行血瘀造模；对照组给予卵巢摘除假手术，改良HULTH手术，皮下注射生理盐水。HULTH手术后第5周，检测血液流变学、凝血四项、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸及雌二醇水平；同时，拍摄膝关节X射线片，进行膝关节苏木精-伊红染色、番红-固绿染色和免疫组化染色。

结果与结论：①与对照组相比，模型观察组全血黏度低切、中切、高切和血浆黏度显著升高，凝血四项中纤维蛋白原水平显著升高，凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间显著下降；三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸及雌二醇水平均显著下降；②影像学结果显示模型观察组大鼠膝关节间隙狭窄程度更严重且表面欠光滑，出现高密度影；③苏木精-伊红染色和番红-固绿染色表明，模型观察组大鼠软骨损伤更严重，并且OARSI评分和Mankin评分明显高于对照组；④免疫组化染色结果显示，相较于对照组，模型观察组大鼠软骨外基质Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖蛋白表达显著下降，炎症因子基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白表达显著升高。结果表明，该研究成功建立了SD大鼠肾虚血瘀型膝骨关节炎模型；肾虚血瘀证候通过促进炎症因子表达进一步加重软骨外基质裂解和软骨退变，促进大鼠膝骨关节炎进程。

https://orcid.org/0009-0000-9450-6747(杨程)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 膝骨关节炎, 肾虚血瘀, 卵巢摘除, 改良HULTH术, 肾上腺素, 炎症, 软骨退化, SD大鼠

Abstract: BACKGROUND: Kidney deficiency and blood stasis syndrome are common traditional Chinese medicine syndromes observed in knee osteoarthritis, which serve as fundamental pathogenesis factors. There exists a significant connection between the two. Previous studies have demonstrated that kidney deficiency and blood stasis syndrome effectively contribute to knee joint cartilage degeneration and the progression of knee osteoarthritis. However, the mechanisms underlying the promotion of knee joint cartilage damage remain unclear and require further investigation.
OBJECTIVE: To investigate the influence of kidney deficiency and blood stasis syndrome on the progression of knee osteoarthritis in Sprague-Dawley rats.
METHODS: Sixteen Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups: a model observation group and a control group, with eight rats in each group. Animal models of kidney deficiency were induced by ovary removal in the model observation group, while the control group was given a sham procedure for ovarian removal. Two months after modeling, both groups underwent modified HULTH surgery to induce knee osteoarthritis. One week after modified HULTH surgery, the model observation group was subcutaneously given adrenaline hydrochloride to make blood stasis models, while the control group was subcutaneously given normal saline. At the 5th week after modified HULTH surgery, blood rheology, coagulation parameters, triiodothyronine, tetraiodothyronine, and estradiol levels were measured. Knee joint X-ray images were taken, and knee joint sections were stained with safranin O-fast green, hematoxylin-eosin, and immunohistochemistry.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the model observation group exhibited significant increases in whole blood viscosity at low, medium, and high shear rates, as well as increased plasma viscosity. Fibronectin levels in the coagulation parameters were significantly increased, while prothrombin time and activated partial thromboplastin time were significantly decreased. Triiodothyronine, tetraiodothyronine, and estradiol levels were all significantly decreased. Radiographic results showed that the model observation group exhibited more severe degree of knee joint space narrowing and surface roughness, with the appearance of high-density shadows. Hematoxylin-eosin and safranin O-fast green staining demonstrated more severe cartilage damage in the model observation group, with significantly higher OARSI and Mankin scores compared with the control group. Compared with the control group, immunohistochemistry results showed a significant reduction in the expression of extracellular matrix type II collagen and aggrecan protein in the cartilage of the model observation group rats. Moreover, there was a significant increase in the expression of matrix metalloproteinase 13 and aggrecanase 5, which are inflammatory factors. These results indicate that the Sprague-Dawley rat model of knee osteoarthritis with kidney deficiency and blood stasis was successfully established. Kidney deficiency and blood stasis syndrome further aggravate cartilage extracellular matrix degradation and cartilage degeneration by promoting the expression of inflammatory factors, thereby promoting the progression of knee osteoarthritis in rats.

Key words: knee osteoarthritis, kidney deficiency and blood stasis, ovariectomy, modified HULTH procedure, adrenaline, inflammation, cartilage degradation, Sprague-Dawley rat

中图分类号:

杨程, 李玉生, 焦泓焯, 尚曼, 刘琪, 李林臻, 樊方阳, 张成龙, 张晓宇, 张君涛. 肾虚血瘀型SD大鼠膝骨关节炎模型的建立与验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(27): 4273-4280.

Yang Cheng, Li Yusheng, Jiao Hongzhuo, Shang Man, Liu Qi, Li Linzhen, Fan Fangyang, Zhang Chenglong, Zhang Xiaoyu, Zhang Juntao. Establishment and validation of the Sprague-Dawley rat model of osteoarthritis with kidney deficiency and blood stagnation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(27): 4273-4280.

图/表（结果） 15

2.1 实验动物数量分析对照组大鼠因术后感染死亡2只，模型观察组大鼠因术中出血死亡2只，并不影响实验进程，选取每组6只大鼠进行影像学观察，发现模型观察组大鼠膝骨关节炎进程更严重，后续随机选择3只大鼠进行血液学检测以及病理学切片染色和免疫组化分析，尽可能减少对实验动物的应用。
2.2 肾虚血瘀证候建立成功见图1-3。模型观察组和对照组大鼠进行左膝关节改良HULTH手术，术后膝关节抽屉实验为阳性。模型观察组大鼠进行卵巢摘除和肾上腺素皮下注射，术后可见舌苔暗紫，舌下络脉瘀点瘀斑，后足底和尾部颜色暗紫，精神萎靡，易惊恐，弓背，皮毛暗淡粗糙。对照组大鼠应用卵巢摘除假手术和生理盐水皮下注射方式进行对照处理，术后可见舌苔红润且舌下络脉不可见瘀点瘀斑，后足底和尾部颜色红润，精神状态较好，皮毛柔顺且光泽。

2.3 卵巢摘除有效抑制大鼠下丘脑-垂体-靶腺轴(甲状腺轴、性腺轴)表达与对照组相比，模型观察组大鼠三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、雌二醇水平均显著下降，见表1，图4。

2.4 小剂量连续皮下注射肾上腺素促进大鼠血浆黏度和凝血功能升高与对照组相比，模型观察组全血黏度低切、中切、高切和血浆黏度均显著升高，见表2，图5A-D；与对照组相比，模型观察组纤维蛋白原水平显著升高，凝血酶原时间与活化部分凝血活酶时间显著降低，但凝血酶时间无统计学差异，见表3，图5E-H。

2.5 两组大鼠膝关节影像学比较见图6。对照组大鼠左侧膝关节内侧间隙出现狭窄，但表面相对光滑，密度相对均匀；模型观察组可明显观察到左侧膝关节内侧间隙狭窄更严重且模糊，膝关节表面欠光滑并出现高密度影。

2.6 两组大鼠膝关节苏木精-伊红染色评估和Mankin评分比较对照组膝关节胫骨平台内侧软骨层表面相对光滑，软骨细胞分布均匀，排列相对规则整齐，软骨细胞生长相对正常，基质染色相对均匀，潮线完整；模型观察组膝关节胫骨平台内侧软骨层表面粗糙，可见细胞簇状聚集，排列不规则，软骨细胞总量减小且呈不规则样生长，基质染色不均匀，潮线扭曲中断，见图7。模型观察组Mankin评分显著高于对照组(对照组：3.33±0.58，模型观察组：7.67±0.58，P < 0.001)，对照组为早期关节软骨损伤，模型观察组为中期关节软骨损伤，见图8。

2.7 两组大鼠膝关节番红-固绿染色评估和OARSI评分比较对照组膝关节内侧胫骨平台和股骨内侧髁软骨层番红着色相对均匀且颜色较深，软骨表面相对光滑，偶有裂隙可见延伸至过渡层，软骨细胞生长相对规则，细胞数量均匀，潮线相对完整；模型观察组膝关节内侧胫骨平台和股骨内侧髁软骨层番红着色较浅且不均匀，软骨表面粗糙，可见裂隙生成延伸至软骨辐射层，可见软骨缺失，软骨细胞肥大、凋亡，软骨细胞生长排列不规则，簇状聚集生长，潮线中断且可见血管翳生成，见图9。模型观察组OARSI评分显著高于对照组(对照组：4.00±1.73，模型观察组：9.67±2.08，P < 0.05)，模型观察组表现出更严重的膝骨关节炎进程，见图10。

2.8 两组大鼠膝关节软骨外基质和炎症因子表达比较对照组大鼠膝关节软骨外基质聚集蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白表达显著高于模型观察组；对照组炎症因子基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白表达显著低于模型观察组，见图11-13，表4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间采用独立样本t检验进行数据分析。
1.2 时间及地点实验于2022年11月在天津市易生源生物科技有限公司和天津中医药大学第一附属医院实验中心开展。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取无特定病原体(SPF级)SD大鼠16只，雌性，8周龄，体质量为200-220 g，由北京华阜康生物有限公司提供，动物使用许可证号：SCXK(京)2019-0008，动物质量合格证号：110322230100257837，饲养于天津市易生源生物科技有限公司，环境使用许可证号：SYXK (津)2021-0003。实验期间，所有实验大鼠在无特定病原体环境下(SPF级)饲养，实验期间除手术操作外，大鼠可自由进食和进水，12 h光照/黑暗循环，室内温度为(22±2) ℃，相对湿度控制在55%左右，每小时换气16次。此次实验所有动物均遵循天津市医学实验动物保护中心的指导原则，动物实验方案经易生源基因科技(天津)有限公司动物伦理委员会批准，批准号：YSY-DWLL-2022177。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 实验试剂异氟烷(山东安特牧业科技有限公司，批号：151987015)；乌拉坦(源叶生物科技有限公司，批号：S11036-500g)；注射用青霉素钠(中诺药业有限公司，批号：H13021632)；盐酸肾上腺素(天津金耀药业有限公司，批号：H12020526)；苏木精、伊红试剂(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G1004，G1001)；番红固绿染色试剂(武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G1053)；Ⅱ型胶原(COL2A1)抗体(武汉三鹰生物有限公司，批号：28459-1-AP)；聚集蛋白聚糖(AGGRECAN)抗体(武汉三鹰生物有限公司，批号：13880-1-AP)；基质金属蛋白酶13(MMP-13)抗体(武汉三鹰生物有限公司，批号：18165-1-AP)；解聚蛋白样金属蛋白酶5(ADAMTS-5)抗体(成都正能生物有限公司，批号：160094)。
1.3.3 实验仪器血流变仪(山东淄博恒拓生物有限公司，型号：HT-100A)；凝血分析仪(浙江普施康生物科技有限公司，型号：MSC100V)；全自动化学发光免疫分析仪(北京美联泰科生物有限公司，型号：MS-Fast)；石蜡切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2235)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组及模型建立 16只SD大鼠随机分为对照组和模型观察组各8只，对照组大鼠进行卵巢摘除假手术和生理盐水皮下注射方式进行对照处理，左侧膝关节建立膝骨关节炎模型；模型观察组进行卵巢摘除(肾虚)和肾上腺素皮下注射(血瘀)，左侧膝关节建立膝骨关节炎模型。对照组大鼠因术后感染死亡2只，模型观察组大鼠因术中出血死亡2只，并不影响实验进程，遂正常开展实验。模型建立如下：
(1)肾虚模型建立：采用卵巢摘除方法建立大鼠肾虚模型[7]。模型观察组应用3%异氟烷麻醉大鼠，拉拽大鼠尾巴，无明显活动，即表明大鼠已进入麻醉状态，之后应用2%异氟烷维持麻醉，对大鼠腰背部进行剃毛处理，随后切开大鼠左侧腰腹部皮肤，切开腹膜，进入到腹膜腔，找到大鼠左侧卵巢，探寻到粉红色菜花样组织即为大鼠卵巢，剥离脂肪等组织，应用5-0缝合线对大鼠卵巢进行结扎，切除卵巢，出血部位进行短暂按压止血，待无可见出血后，回纳组织。右侧卵巢摘除同左侧操作方法。对照组大鼠采用假手术方式，切开腹膜，但不切除卵巢组织。术后肌肉注射(4万U/d)3 d青霉素以防止感染。2个月后进行骨关节炎模型建立。
(2)膝骨关节炎模型建立：在肾虚模型建立后2个月，进行膝骨关节炎模型的建立，采用改良的HULTH方法[8]，应用3%异氟烷麻醉大鼠，拉拽大鼠尾部，无明显活动，即表明大鼠已进入麻醉状态，之后应用2%异氟烷维持麻醉，对大鼠左膝关节进行剃毛处理，选择大鼠膝关节内侧入式，切开皮肤，离断膝关节内侧副韧带，屈曲大鼠膝关节，切开关节囊，找到内侧半月板，切除内侧2/3半月板组织，离断交叉韧带，抽屉现象阳性，表明改良HULTH手术成功。术后肌肉注射(4万U/d)3 d青霉素防止感染，对大鼠进行强迫驱赶运动4周，每天上午30 min，下午30 min，共计1 h。第5周麻醉后处死并取材。

(3)血瘀模型建立：在膝骨关节炎模型术后1周，模型观察组开始进行血瘀模型建立，皮下注射0.6 mg/kg盐酸肾上腺素[9]；对照组采用同体积生理盐水皮下注射进行对照处理。每天1次，连续注射1周。

1.4.2 膝关节X射线检测在大鼠进行膝骨关节炎造模术后第5周，对每组6只大鼠进行膝关节X射线片拍摄。应用乌拉坦(1 000 mg/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后，将其放置在X射线机上，选择大鼠双侧膝关节正位和侧位进行拍摄。
1.4.3 大鼠形态学观察观察大鼠舌象、双侧后足底、尾部以及整体形态体征，判断是否形成肾虚血瘀体征。
1.4.4 血液流变学、凝血四项、三碘甲状腺原氨酸(T3)、四碘甲状腺原氨酸(T4)、雌二醇水平检测膝骨关节炎造模术后第5周取腹主动脉血。取血前1 d，禁食12 h。每组大鼠随机抽取3只进行血液流变学、凝血四项、三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、雌二醇水平检测。应用3%异氟烷对大鼠进行麻醉后，取约3 mL腹主动脉血于肝素锂抗凝管内，上下混匀后上机检测血液流变学指标；取约2 mL腹主动脉血于柠檬酸钠采血管内，室温3 000 r/min离心15 min，按照凝血四项试剂盒要求进行操作，上机检测凝血四项指标(凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、纤维蛋白原)；取约3 mL腹主动脉血于促凝管内，提取血清约1 mL，上机检测三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、雌二醇水平。
1.4.5 膝关节组织石蜡切片制备取血后大鼠由3%异氟烷维持麻醉即刻转入5%异氟烷深度麻醉处死，分离大鼠下肢，剥离肌肉等结缔组织，保留膝关节完整性，应用砂轮切断大鼠的股骨和胫骨，保留膝关节上下股骨、胫骨5 mm左右，随后放入40 g/L多聚甲醛溶液中固定72 h，放入EDTA脱钙液进行脱钙处理，每3 d更换1次脱钙液，当针能够无阻碍穿透组织时表明脱钙完成，随后用不同体积分数乙醇梯度脱水，用二甲苯透明，最后进行石蜡包埋，待冷却后进行切片，厚度4 μm。
1.4.6 苏木精-伊红染色和改良Mankin评分依次将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ(20 min)-二甲苯Ⅱ(20 min)-无水乙醇Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-体积分数90%乙醇(5 min)- 体积分数80%乙醇(5 min)- 体积分数70%乙醇(5 min)-蒸馏水(5 min)进行脱蜡至水。将切片浸入苏木精染液5 min，蒸馏水洗涤，盐酸分化，再次蒸馏水洗涤，氨水返蓝，冲洗干净后置入伊红染液 3 min，最后进行脱水透明，中性树胶封固，镜下观察。对已封固的苏木精-伊红染色切片标本进行Mankin评分[10-11]，放大倍数40倍，将退变程度划分为4个阶段：0-1分为正常的软骨形态，2-6分为早期退变，7-9分为中期退变，10-14分为晚期退变。Mankin评分越高，意味着关节软骨损伤程度越严重。
1.4.7 番红-固绿染色和OARSI评分将切片进行脱蜡至水，应用固绿染色剂浸染10 min，应用蒸馏水洗涤至软骨无色，盐酸分化并再次洗涤，置入番红O染色剂中浸染30 s，最后脱水透明，中性树胶封固，镜下观察。对已封固的番红-固绿染色切片标本进行OARSI评分[11-12]，放大倍数40倍，OARSI评分=分级×分期，评分越高表示骨关节炎进展越严重。
1.4.8 免疫组化染色将切片脱蜡至水后，浸入含有EDTA的抗原修复液中进行抗原修复，将切片置于体积分数3%过氧化氢溶液避光孵育30 min，应用组化笔沿标本进行边界描绘，应用3%牛血清白蛋白封闭30 min，滴入Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖、基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5一抗(稀释比例1∶500)，湿盒内4 ℃过夜孵育，PBS洗涤，滴入对应的二抗(稀释比例1∶200)，室温孵育30 min，PBS洗涤，滴加DAB显色液显色1 min左右，应用蒸馏水洗涤以终止显色，最后使用苏木精染色剂复染2 min，蒸馏水洗涤干净后脱水封固，镜下观察。应用Image J软件进行平均吸光度分析。
1.5 主要观察指标 ①大鼠体征形态观察：精神状态、活动能力、皮毛状态、舌象、舌下络脉、双足底颜色、尾部颜色；②膝关节影像学变化；③血液流变学指标：全血黏度低切、全血黏度中切、全血黏度高切、血浆黏度；④凝血四项指标：纤维蛋白原、凝血酶时间、凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间；⑤甲状腺和性腺功能指标：三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、雌二醇水平；⑥组织病理学变化和评分：苏木精-伊红染色和Mankin评分，番红固绿染色和OARSI评分；⑦免疫组化染色观察膝关节软骨外基质Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖蛋白的表达；⑧免疫组化染色观察膝关节软骨炎症因子基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白的表达。
1.6 统计学分析用统计软件SPSS 23.0进行统计学分析，计量资料数据以x±s表示，经方差齐性检验后，符合正态分布两组间采用独立样本t检验。不符合正态分布两组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。此次研究所有结果均采用独立样本 t 检验进行统计，P < 0.05为差异有显著性意义，文章统计学方法由天津中医药大学第一附属医院生物医学统计学专家审核。

讨论

膝骨关节炎作为常见的骨关节疾病，其致病因素并不清晰。当前研究表明，膝骨关节炎的发生和进展与年龄、肥胖、代谢性疾病以及力学结构改变等有显著联系[13]。膝骨关节炎在中医理论中归属为“痹症”的范畴，其基本病机为“肾虚”和“血瘀”[14-15]，《素问•上古天真论》中有描述：“丈夫……，肾气平均，筋骨劲强……四八，筋骨隆盛，肌肉满壮，五八，肾气衰，发堕齿槁……八八，天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极则齿发去”，在《外台秘要》中也有相关描述：“凡骨极者，主肾也。肾应骨，骨与肾合”，这说明肾虚作为人体衰老的标志，也是膝骨关节炎之本；血瘀作为膝骨关节炎的致病之标，瘀血阻滞气血经络之运行，致使筋骨难得其养，《医林改错》中也提出“瘀血致痹”的理论。因此，从肾虚血瘀的角度研究膝骨关节炎，能够更全面探索疾病的转归进程。
肾虚血瘀作为膝骨关节炎重要证候之一，关键在于“不荣”和“不通”，肾精亏虚致使骨失濡养，最终导致骨关节发生退行性病变，此外，肾气不足还会导致气血运行不畅，加重关节老化，现代生物学研究表明肾虚血瘀导致的下丘脑-垂体-甲状腺轴/性腺轴表达功能紊乱和关节内微循环障碍改变，进一步加重骨关节炎进程[5]。DYREK等[16]研究报告指出甲状腺功能紊乱会加重骨关节负荷，继而促进骨关节炎进程。BASSETT等[17]研究发现下丘脑-垂体-甲状腺轴会通过三碘甲状腺原氨酸调节小鼠骨骼发育。张薇薇等[18]研究发现促甲状腺激素异常升高会促使软骨细胞分化和炎症因子分泌增加。 LI等[19]研究表明三碘甲状腺原氨酸可通过PI3K/AKT信号通路调节成骨细胞血管内皮生长因子A表达，继而影响骨关节炎进程。牟利民等[20]通过对性激素水平和膝关节患者疼痛指标以及炎症因子进行分析，结果表明性激素与患者膝关节疼痛和炎症因子表达具有显著性联系。雌二醇作为性激素中主要激素之一，在软骨组织生长发育中发挥着重要作用。KAROLCZAK等[21]在近期的研究报告中指出，雌二醇可通过调节SIRT1靶点蛋白激活软骨细胞自噬系统，减缓软骨细胞衰老和骨关节炎进程。血液流变学和凝血功能异常作为“血瘀”主要病理学特征，与膝骨关节炎有着紧密联系。WU等[22]对膝骨关节炎患者进行膝关节超声检测，结果表明膝骨关节炎早期膝关节周围分支血管的血流动力学呈现出显著异常。血液流变学和凝血功能异常会导致膝关节周围微循环障碍，进一步影响关节软骨供能和微环境异常。唐利等[23]通过针刺艾灸方法治疗膝骨关节炎，能够有效改善膝骨关节炎患者血液流变学水平和血清炎症因子表达以及氧化应激水平。
该实验参考前人肾虚血瘀型膝骨关节炎造模方法[7，9，24]，应用去卵巢加小剂量连续皮下注射肾上腺素结合改良的HULTH法构建大鼠肾虚血瘀膝骨关节炎模型。造模后发现，相较于对照组，模型观察组大鼠表现出精神萎靡、懒散少动、易惊恐、弓背、皮毛粗糙暗淡、尾部和足底部颜色紫暗、舌质紫暗且可见舌下络脉瘀点瘀斑等体征，符合人类肾虚血瘀体征表现。病理学结果表明，与对照组相比，模型观察组大鼠的血清三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、雌二醇指标均显著降低，表明卵巢摘除方法能够有效抑制大鼠下丘脑-垂体-靶腺轴(甲状腺轴、性腺轴)的表达，符合肾虚的病理学特征[25-28]；与对照组相比，模型观察组大鼠全血黏度低切、全血黏度中切、全血黏度高切和血浆黏度均显著升高，凝血四项结果表明，除凝血酶时间无差异性外，模型观察组大鼠纤维蛋白原显著高于对照组，凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间均显著低于对照组，符合血瘀证候的病理学特征[29-31]。综上所述，应用卵巢摘除结合小剂量连续皮下注射肾上腺素方法能够有效建立大鼠肾虚血瘀证候。此外，通过对大鼠膝关节进行苏木精-伊红染色和番红固绿染色，观察到模型观察组大鼠膝关节骨软骨缺失，软骨层裂隙增加且延伸至软骨辐射层，染色不均匀，软骨层厚度降低，软骨细胞整体密度下降，排列不规则，且在裂隙周围可见明显软骨细胞簇集现象。模型观察组病理学Mankin评分和OARSI评分均显著高于对照组，这表明肾虚血瘀证候促进了大鼠膝骨关节炎进程和软骨退变，与刘振峰等[7]的研究呈现出一致性，但肾虚血瘀对于膝骨关节炎影像学的影响以及如何影响膝骨关节炎进程和软骨退变并不明确。
课题组在刘振峰等[7]的研究基础上，对肾虚血瘀型膝骨关节炎大鼠进行进一步影像学观察和免疫组化检测。X射线片结果表明，与对照组相比，模型观察组大鼠左下肢膝关节内侧呈现高密度影，间隙狭窄也更严重，符合膝骨关节炎影像学表现[32]，但模型观察组未发现明显骨赘生成，这说明肾虚血瘀证候对膝骨关节炎的影响主要体现在促进膝骨关节炎的炎症表达，免疫组化结果与影像学结果相一致。Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白作为软骨外基质标志物，可作为软骨退化的标志[33]，基质金属蛋白酶13和解聚蛋白样金属蛋白酶5作为炎症因子，可降解Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖，常被用来检测膝骨关节炎的炎症反应进程[34]。对这4个指标进行免疫组化分析，结果表明模型观察组大鼠的软骨外基质Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖蛋白显著低于对照组，炎症因子基质金属蛋白酶13和解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白显著高于对照组，这说明肾虚血瘀证候促进了膝关节软骨外基质裂解和炎症因子表达。
综上所述，肾虚血瘀证候抑制大鼠三碘甲状腺原氨酸、四碘甲状腺原氨酸、雌二醇表达和促进血流变以及凝血功能异常升高，导致下丘脑-垂体-甲状腺轴/性腺轴功能紊乱和膝关节微循环障碍，致使关节内微环境改变，促进膝关节软骨炎症因子表达和软骨外基质裂解，继而加重膝关节软骨退变和膝骨关节炎进程。
不足与展望：该研究基于刘振峰等[7]的研究，对肾虚血瘀证候影响膝骨关节炎的进程进行进一步探索。由于刘振峰等[7]已证明肾虚血瘀证候会促进膝骨关节炎进程，考虑减少实验动物应用，该研究在分组上并未设立空白对照组，后续实验中会增加空白对照组用来排除手术等混杂因素的影响。此次研究考虑肾虚血瘀证候作为一个整体观念如何影响膝骨关节炎进程，所以血液指标检测均在膝骨关节炎模型建立5周后进行，后续实验中会进一步探讨肾虚和血瘀对下丘脑-垂体-甲状腺轴/性腺轴和血液流变学以及凝血功能的直接影响，明确肾虚和血瘀对膝骨关节炎的影响。该实验由于每组大鼠死亡2只，后续采用每组6只大鼠进行影像学观察，发现模型观察组大鼠膝骨关节炎进程更严重，后续随机选择3只进行血液指标、病理学切片染色和免疫组化分析，尽可能减少对实验动物的应用。该研究证明肾虚血瘀证候会通过促进膝关节软骨炎症因子表达影响膝骨关节炎进程，但是肾虚血瘀证候对膝关节软骨能量代谢、线粒体自噬、氧化应激以及相关信号通路表达的影响并不明确，后续会在这几个方面进行进一步研究和探索。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

肾虚血瘀型SD大鼠膝骨关节炎模型的建立与验证

Establishment and validation of the Sprague-Dawley rat model of osteoarthritis with kidney deficiency and blood stagnation

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