中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (4): 633-638.doi: 10.12307/2023.862
• 组织构建综述 tissue construction review • 上一篇 下一篇
股骨骨缺损动物模型制备现状及特点
周世博1，关健斌1，俞 兴2，赵 赫2，杨永栋2，刘 涛1
- 1北京中医药大学第一临床医学院，北京市 100029；2北京中医药大学东直门医院，北京市 100070
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收稿日期:2022-10-31接受日期:2023-01-10出版日期:2024-02-08发布日期:2023-07-14 -
通讯作者:俞兴，博士，主任医师，北京中医药大学东直门医院，北京市 100070 -
作者简介:周世博，男，1994年生，河南省洛阳市人，汉族，在读博士，医师，主要从事脊柱脊髓损伤、椎间盘退变及骨组织工程研究。
Animal models of femoral bone defects: preparation status and characteristics
Zhou Shibo1, Guan Jianbin1, Yu Xing2, Zhao He2, Yang Yongdong2, Liu Tao1
- 1First Clinical School of Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
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Received:2022-10-31Accepted:2023-01-10Online:2024-02-08Published:2023-07-14 -
Contact:Yu Xing, MD, Chief physician, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China -
About author:Zhou Shibo, MD candidate, Physician, First Clinical School of Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China
摘要：
文题释义：
临界性骨缺损：骨发生缺损后，不经任何处理在自然状态下不能自行愈合的最小骨缺损的尺寸。动物模型：是基于实验动物建立的模拟人类疾病或满足研究的动物，是实验治疗方式走向临床的一个重要过程。
背景：骨缺损的修复及后期临床转归仍是临床研究中的热点和难点，是困扰临床医师的常见问题。构建合适、可重复性及无限接近临床的动物实验模型及科学的评估对进一步的临床治疗相关疾病至关重要。
目的：回顾性分析文献中股骨骨缺损常用实验动物模型制备方法及不同模型特点，评估优势与不足，为相关研究者选择合适的股骨骨缺损动物模型提供一定的参考。方法：检索PubMed、Web of Science、Medline数据库及CNKI数据库，设定英文检索词为：bone defect，bone，bones，defect，defects，defective，animal model，animal，model，laboratory，laboratory animal，animal laboratory；中文检索词为：骨缺损，动物模型，实验。检索时限为2000-01-01/2022-08-01。
结果与结论：①对入选的27篇随机对照动物实验进行了分析和评估，实验动物包含大鼠、小鼠、新西兰兔及羊，骨缺损类型主要包含圆柱形骨缺损和节段性截骨骨缺损，部位以股骨中段及远端居多。多用于评估骨修复材料、药物、载药活性物质及物理治疗等方法对骨缺损修复的影响及缺损愈合机制研究，尤其是负重骨缺损修复机制的研究。②不同缺损类型及不同实验动物股骨骨缺损值的范围不同，研究者可结合实验目的，选择合适的动物及骨缺损类型，并设置合理的骨缺损值。③目前的研究表明，股骨骨缺损模型以圆柱形及节段截骨骨缺损为主，主要是在股骨远端及中段，手术方法及术后处理较为成熟，可操作性强，能够提供成熟的实验动物模型。④就圆柱形骨缺损而言，大鼠及新西兰兔更适合，而节段性截骨则无特殊要求，各种动物均能满足实验要求。
https://orcid.org/0000-0003-1260-0807(周世博)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
中图分类号:
引用本文
周世博, 关健斌, 俞 兴, 赵 赫, 杨永栋, 刘 涛. 股骨骨缺损动物模型制备现状及特点[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 633-638.
Zhou Shibo, Guan Jianbin, Yu Xing, Zhao He, Yang Yongdong, Liu Tao. Animal models of femoral bone defects: preparation status and characteristics[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(4): 633-638.
2.1 文献筛选 研究共纳入27篇随机对照动物实验文献，对其进行归纳、总结并进行评价，详细内容见表1。
2.2.1 动物类别 27篇文献中共涉及动物模型4种，大鼠最常用，占比48.15%，其次为新西兰兔(18.52%)、小鼠(18.52%)及羊(14.81%)，详见图3。
2.2.2 缺损模型 纳入的文献中，股骨远端出现频率最高，占比55.56%，其次为股骨中段(37.04%)、股骨近端(7.41%)；其中圆柱形缺损为62.96%、节段性截骨骨缺损为29.63%、楔形截骨为3.70%、椭圆形为3.70%。详见图3。
2.2.3 动物模型 大鼠、小鼠及兔来源广泛，具备较强的抗感染能力，围术期便于集中管理，整体死亡率较低。但啮齿类动物适合短期内骨修复材料及其生物相容性的初步研究，不适合做长期评估；同时，啮齿类动物模型缺乏固有的哈佛管系统，不能完全模仿临床中骨的修复过程。兔介于啮齿类动物和大型动物模型之间，生命周期较长，且具备与人类相似的哈佛氏管，是临床常见的动物模型选择[46-47]。山羊和绵羊作为不同的物种，在实验中也被用来制备骨缺损动物模型。相比山羊，绵羊更加温顺，且绵羊的骨再生率与骨重塑能力与人类较为相似，故可以更加客观地评估骨缺损修复能力或相关修复材料的再生作用 [48-49]。理论上讲动物模型越大，骨缺损愈合机制越接近临床，缺损的模型也越容易制备，但实验成本、操作的可控性及实验样本量难以保证[50-51]。相比之下虽然不同动物之间有不同的解剖学、生物化学、生物力学及相关基因表达的差异[52]，但仍有一定的共性。
圆柱形骨缺损大部分以股骨远端外侧髁为手术部位，于股骨外侧髁行纵向切口，在股四头肌和肌腱的外侧通过钝性剥离暴露股骨外侧髁，之后骨科钻或牙科钻形成单皮质圆柱形的骨缺损。在建模的过程中生理盐水局部降温，清理骨屑后根据实验目的选择填充或不填充内容物，止血、缝合及包扎。此模型制备的优点在于股骨外髁层次较为清楚且周围没有重要的神经、血管等解剖结构，便于操作。
节段性截骨骨缺损以股骨中段为手术部位，沿股骨外侧大转子和髌骨之间作一长度合适的切口，切开外侧筋膜，肌间隙钝性分离，暴露股骨外侧，保留大转子臀肌止点，避免损伤神经血管束。根据术者不同习惯及实验目的选用钢板螺钉、克氏针或外固定架固定，之后截骨。KERZNER等[38]暴露股骨外侧后，1.0 mm克氏针打通骨道，之后放置外固定架，4支带纹1.0 mm克氏针分别于股骨近端及远端固定，之后在骨干中部制造一个5 mm节段性骨缺损；PICKE等[42]使用四孔钢板在股骨近端及远端分别固定2枚螺钉，在股骨中轴处形成3 mm的节段性截面缺损；ALLURI等[39]首先将聚乙烯四孔板通过钢丝固定于大鼠股骨近端及远端，之后用高速磨钻形成一长约6 mm的节段性骨缺损，之后3D打印的TCP支架填充缺损处。上述节段性骨缺损模型制备后经过适应性治疗后均允许动物进行负重，在实验期间未出现内固定物的松动。
2.2.4 骨缺损动物模型应用 股骨缺损动物模型主要集中在大鼠[23，25，27，31，34-35，37-43，45]、新西兰兔及小鼠[19，23，26，28-29，32-33，36，43-44]；造模方法以圆柱形骨缺损及节段性截骨缺损为主[19-35，38-45]；造模方法决定了股骨造模部位，圆柱形骨缺损动物模型主要集中在实验对象的股骨远端，而节段性截骨骨缺损的动物模型主要集中在股骨中段；观察指标主要集中在生物力学[24，27，30-31，39，41-44]、影像学及组织学的相关评价[19，21-25，27，30-45]。大鼠股骨节段性骨缺损模型制备范围在3-8 mm；圆柱形骨缺损范围在(3-5) mm(深度)×(2.6-3) mm(直径)[21，25，35]；小鼠节段性骨缺损模型制备范围在1.6-3 mm之间；兔股骨远端圆柱形骨缺损范围在(6-15) mm(深度)×(5-6) mm (直径)；羊股骨远端圆柱形骨缺损缺损范围(12-15) mm(深度)×(4-8) mm(直径) [23，32-33]。纳入文献中，有3篇文献对动物实验过程中的不良反应进行了报道[31，35，39]，包括感染、应力性骨折；4篇文献报道了分别因麻醉过量及其他原因导致的动物死亡[31，35，39，43]，整体安全性尚可。基于上述不良反应，在达到手术造模目的的同时，及时止血，减少创伤，特别是骨缺损制备使用器械的过程中更应该精细操作；同时根据不同麻醉剂的特点，精确计算麻醉剂量，尽量避免由于人为因素导致的实验动物的死亡。
2.3 实验目的 文献中股骨骨缺损动物模型多用于骨修复材料、药物、物理疗法等治疗骨缺损的疗效评价，同时也用于骨缺损愈合机制的相关研究，对于骨缺损形状的选择标准未作特殊说明。圆柱形、节段性截骨及楔形骨缺损动物模型均可评估上述治疗方法的有效性与安全性。对于评估特殊类型骨缺损而言则需要相对特殊的骨缺损模型，例如文献中评估松质骨或骨质疏松骨缺损愈合机制多选用股骨远端圆柱形骨缺损模型；同时，如果实验需要，股骨远端缺损可以同时造成骨与软骨损伤，在有限的实验时间内同时观察骨与软骨损伤的修复过程。而对皮质骨缺损及髓腔再通机制的研究则多选用股骨中段截骨骨缺损，且节段性截骨骨缺损也适用于大段骨缺损愈合机制及生理状态下载荷能力的研究，根据实验目的选择合适的骨缺损模型可以更加客观评估不同治疗方法对骨缺损干预的有效性。颅骨骨缺损从第一例临床报道至今已有百年历史，而颅骨骨缺损动物模型也以其标准化的骨缺损模型、组织学和放射学易于评估，在骨缺损动物模型中占据了相当高的比例。但是作为非负重区域，无法在生理状态下评估力学载荷实验，也无法同时评估骨与软骨修复过程，在一定程度上限制了该模型的应用。因此在上述方面股骨骨缺损可能是更好的骨缺损模型。
2.4 骨缺损范围的选择 动物实验过程中，良好的空白对照对实验结果的观察具有重要作用，不同实验对象本身具备不同的自我修复能力，因此骨缺损模型制备过程中骨缺损大小如何限定是需要考虑的问题。若缺损过小的骨缺损自行愈合会影响实验结果，对骨缺损修复材料的治疗效果、是否具有促成骨作用以及促成骨作用机制的评估产生误判，进而失去研究的意义。因此在1986年有学者提出临界性骨缺损(bone size defect，CSD)的概念，SCHMITZ等[53]提出动物一生中不会自动愈合的最小尺寸的骨缺损即为CSD，将CSD定义为周径的1.5-2.5倍或缺损长度为模型对象的1/10以上，超过此范围就会出现缺损不愈合；1990年HOLLINGER等[54]进一步定义了CSD，他认为在动物生命周期内愈合率小于10%的骨缺损即可定义为CSD。CSD超出了机体自然状态下的再生极限，需要借助材料才能促进骨缺损的愈合。若实验目的用于骨组织材料促成骨性能的评估，则设置大于CSD的骨缺损动物模型对于实验的指导就具有至关重要的意义，缺损范围小于临界性骨缺损值，在观察期内自行愈合，进而影响最终的实验结果。不同动物模型、不同模型制备方法及不同动物自我愈合能力不同，CSD值也不同，甚至部分文献并未叙述CSD的取值范围。作者认为CSD与动物模型、模型制备方法以及实验目的密切相关，而是否需要设定临界性骨缺损的实验动物模型在很大程度上取决于实验目的。
骨缺损特别是大段骨缺损是临床工作中的重点和难点，不同动物自我修复能力不同，故CSD值也有所差异。文献中大鼠股骨节段性骨缺损模型制备范围在3-8 mm之间。T?LLI等[55]、SKALICZKI等[56]学者通过股骨节段性截骨、钢板螺钉固定构建骨缺损模型，结果发现给予活性物质治疗后，8 mm和6 mm并未出现骨重建，产生了稳定的临界性骨缺损，因此认为6-8 mm可以作为大鼠节段性截骨临界性骨缺损值。ZWINGENBERGER等[43]分别制备了长度1，2，3 mm的小鼠节段性骨缺损模型，治疗后发现，3 mm骨缺损组最终产生了稳定的骨缺损不愈合；TAZAWA等[57]和ALAEE等[58]发现2 mm的小鼠节段性截骨不给予活性物质干预的情况下没有表现出愈合趋势，国内学者靳慧勇等[59]分别制备了长度1，2及2.5 mm的股骨干中段骨缺损模型，3个月后经过影像学发现2 mm及2.5 mm的骨缺损没有发生愈合。通过上述研究可以发现，小鼠2 mm节段性骨缺损应该可以作为临界性骨缺损值，在实验设计过程中可以作为参考。圆柱形骨缺损动物模型较少用于节段骨缺损愈合机制的研究，多用于评估材料的成骨性及骨诱导能力或其他研究目的，有报道称10 mm(深度)×6/7 mm(直径)兔股骨髁圆柱骨缺损模型，可以作为临界性骨缺损模型进行实验研究[60-61]。羊是大型动物的代表，有研究认为其根据部位的不同CSD值也不尽相同，约等于相对应骨干直径的3倍[62]，但仍需进一步考证。同时受困于动物体型、实验场地、实验经费以及管理所存在的不便性，选择大型动物作为实验观察对象较少。综上，临界性骨缺损需要综合考虑实验对象及实验目的的不同，同时结合既往报道进行设定。与此同时，可视化软件的应用也为骨缺损值的量化提供了一定的可行性。参照SCHMITZ等[53]及HOLLINGER等[54]的论述，结合可视化软件的应用，对不同性别、不同月龄动物的股骨进行量化，做好术前规划，选取合适的骨缺损部位及大小，既可以避免动物资源的浪费，又可以为临床提供可靠的数据支持。可视化软件应用于动物手术过程中已有报道，ABO，STAMM等[63-64]通过将放射学数据对骨骼模型进行重建，模拟手术过程进行精确截骨；SINGH，LOHRE等[65-66]通过显微CT重建模拟大鼠肝叶精确切除手术。因此在后期的发展过程中，完好的术前规划、精细化管理也是发展的方向所在，但是此种方法的不足之处在于会增加实验成本。
2.5 骨缺损与骨骺损伤 既往文献较少论述骨缺损制备过程中如何避免骨骺损伤，对骨损伤与骨骺损伤如何划分也未作过多说明。SUN等 [67]以成年大鼠为研究对象，通过3D解剖和虚拟手术，将大鼠股骨分为Ⅰ-Ⅲ共6个区域，其中认为当缺损部位靠近Ⅲ区特别是Ⅲb区时所形成的损伤更接近骨骺损伤而非骨缺损或损伤，继而影响骨的生长；同时Ⅲ区操作有可能出现骨折，进而造成关节、韧带以及滑膜损伤，以至于出现关节的早期退化与不稳定，对骨愈合造成不良影响[68]。对于其他动物模型，有关骨损伤和骨骺损伤的描述较少。同时啮齿类动物的生长过程似乎终生留有生长软骨板，因此在实验过程中，需要综合考虑，可以结合既往研究，尽可能远离骨骺与关节区域。
2.6 缺损部位的干预及固定方式的选择 圆柱形骨缺损模型通常以填充的方式填充缺损处，而节段性、楔形骨缺损模型的固定方式包括钢板螺钉、钢丝困扎及外固定架等。
骨缺损特别是节段性骨缺损和楔形骨缺损的修复，必须在稳定状态下才能实现，因此在股骨骨缺损模型制备过程中，必须重建稳定性，才能客观全面观察骨缺损的愈合，对愈合时间及愈合机制做出合理、客观的评价。常用的固定方式包括外固定(如外固定架)和内固定(如钢板螺钉) [69-71]。外固定架在一定程度上保留骨膜和软组织，对局部血液供应影响较小，且外固定对植骨材料影响较小，可最大程度避免外在因素对骨愈合的干扰；但是钉道易感染，外固定术后动物如何护理是实验设计者需要考虑的问题，如动物是否会撕咬固定器进而对实验结果造成影响。钢板内固定易实现缺损部位的刚性固定，可以较好地重建骨缺损区域的稳定性，但是钢板固定会在一定程度上破坏了骨组织的血液供应，由此是否会影响自然状态下骨的修复及对骨材料是否造成影响文献中并未提及[72-74]。一项大型动物骨缺损固定方式回顾性分析显示[75]，认为外固定较内固定而言更具有优势。由于重建缺损部位稳定性的干扰因素较多，因此有学者选择非负重长骨进行骨缺损动物实验，动物实验中大多认为新西兰兔的前肢骨和鼠的胫骨属于非负重骨，缺损后不需要额外固定，一定程度上解决了固定方式不同给研究者造成的困扰。但是实验中仍存在因过度运动或其他原因导致骨折的发生。似乎没有哪一种固定方式是完美的，可以结合实验目的及实验条件对骨缺损进行合适的固定。
2.7 评价指标 骨缺损动物模型主要为临床骨组织工程、生物活性支架以及基于此所构建的复合材料的临床应用提供支持，评价指标主要集中在影像学、生物力学、骨组织形态及组织学[76-80]。
X射线片可以从成骨、连接及髓腔改建各方面对新生骨组织进行评估。双能X射线还可以对骨密度进行评估，骨密度主要作为骨质疏松模型的常用指标，用来观察对骨质疏松模型干预效果的评估，对于常规动物模型骨密度检测并不作为常规指标使用。骨小梁的微观结构较小，X射线片并不能得到清晰可辨的骨小梁结构图。随着医学影像技术的发展，骨形态计量学在骨科领域的应用逐渐增加。Micro-CT除了能对骨密度进行评估外，还可以客观反映骨缺损在填充不同修复材料后，新生骨小梁的生长变化特点，通过三维模式直观反映填充材料的吸收降解状况，对骨小梁面积百分比、骨小梁厚度、骨小梁密度及骨小梁的分离度等进行量化，从多个方面评估新生骨的生成情况[81-83]。由于治疗骨缺损材料需要植入承重部位，对未缺损的骨骼起到连接和支撑等作用，故需要一定的力学强度。临床中可以通过多种方式对植入材料的力学性能进行评估，比如压缩试验、三点弯曲试验及复合载荷加载试验等，可以根据不同的实验设计及现有条件，选择合适的检测方法，系统评估植入材料的生物力学性能[84-85]；除此之外用于骨缺损修复的材料大都具备一定的生物活性，因此材料植入后观察其成骨活性及相关骨代谢指标也有一定的必要性，如碱性磷酸酶、Ⅰ型原胶原羧基端前肽等，用于评估骨材料的成骨情况[86-87]。总之，临床现有检测手段可以对骨缺损植入后材料的转归及骨组织的再生情况进行观察，从静态到动态，从宏观到微观，通过检测手段可以做到良好的追踪，进而全面评估治疗手段的有效性与安全性。
2.8 存在的不足 无论是圆柱形骨缺损还是节段性骨缺损动物模型，文献中尚存在一定不足。第一、文献中并未提及圆柱形骨缺损模型制备过程中如何区别骨缺损与骨骺损伤，也未说明不同骨缺损模型及不同的固定方式对最终的实验结果是否存在影响；第二、骨缺损范围的大小并未进行规范的量化；第三、未说明内植物位置是否需要评估，是否需要影像学的监测及监测时间点如何选择；第四、文中未说明动物性别及月龄选择标准，这两种因素对实验结果存在一定影响[88-89]。除非特别需要(如绝经后骨质疏松骨缺损)，建议在实验过程中对不同性别及月龄同时进行评估，避免由此造成的差异；第五、纳入文献中动物样本量参差不齐；第六、文献中仅涉及正常动物模型，未评价炎性、病理性骨缺损等其他情况。
2.2.1 动物类别 27篇文献中共涉及动物模型4种，大鼠最常用，占比48.15%，其次为新西兰兔(18.52%)、小鼠(18.52%)及羊(14.81%)，详见图3。
2.2.2 缺损模型 纳入的文献中，股骨远端出现频率最高，占比55.56%，其次为股骨中段(37.04%)、股骨近端(7.41%)；其中圆柱形缺损为62.96%、节段性截骨骨缺损为29.63%、楔形截骨为3.70%、椭圆形为3.70%。详见图3。
2.2.3 动物模型 大鼠、小鼠及兔来源广泛，具备较强的抗感染能力，围术期便于集中管理，整体死亡率较低。但啮齿类动物适合短期内骨修复材料及其生物相容性的初步研究，不适合做长期评估；同时，啮齿类动物模型缺乏固有的哈佛管系统，不能完全模仿临床中骨的修复过程。兔介于啮齿类动物和大型动物模型之间，生命周期较长，且具备与人类相似的哈佛氏管，是临床常见的动物模型选择[46-47]。山羊和绵羊作为不同的物种，在实验中也被用来制备骨缺损动物模型。相比山羊，绵羊更加温顺，且绵羊的骨再生率与骨重塑能力与人类较为相似，故可以更加客观地评估骨缺损修复能力或相关修复材料的再生作用 [48-49]。理论上讲动物模型越大，骨缺损愈合机制越接近临床，缺损的模型也越容易制备，但实验成本、操作的可控性及实验样本量难以保证[50-51]。相比之下虽然不同动物之间有不同的解剖学、生物化学、生物力学及相关基因表达的差异[52]，但仍有一定的共性。
圆柱形骨缺损大部分以股骨远端外侧髁为手术部位，于股骨外侧髁行纵向切口，在股四头肌和肌腱的外侧通过钝性剥离暴露股骨外侧髁，之后骨科钻或牙科钻形成单皮质圆柱形的骨缺损。在建模的过程中生理盐水局部降温，清理骨屑后根据实验目的选择填充或不填充内容物，止血、缝合及包扎。此模型制备的优点在于股骨外髁层次较为清楚且周围没有重要的神经、血管等解剖结构，便于操作。
节段性截骨骨缺损以股骨中段为手术部位，沿股骨外侧大转子和髌骨之间作一长度合适的切口，切开外侧筋膜，肌间隙钝性分离，暴露股骨外侧，保留大转子臀肌止点，避免损伤神经血管束。根据术者不同习惯及实验目的选用钢板螺钉、克氏针或外固定架固定，之后截骨。KERZNER等[38]暴露股骨外侧后，1.0 mm克氏针打通骨道，之后放置外固定架，4支带纹1.0 mm克氏针分别于股骨近端及远端固定，之后在骨干中部制造一个5 mm节段性骨缺损；PICKE等[42]使用四孔钢板在股骨近端及远端分别固定2枚螺钉，在股骨中轴处形成3 mm的节段性截面缺损；ALLURI等[39]首先将聚乙烯四孔板通过钢丝固定于大鼠股骨近端及远端，之后用高速磨钻形成一长约6 mm的节段性骨缺损，之后3D打印的TCP支架填充缺损处。上述节段性骨缺损模型制备后经过适应性治疗后均允许动物进行负重，在实验期间未出现内固定物的松动。
2.2.4 骨缺损动物模型应用 股骨缺损动物模型主要集中在大鼠[23，25，27，31，34-35，37-43，45]、新西兰兔及小鼠[19，23，26，28-29，32-33，36，43-44]；造模方法以圆柱形骨缺损及节段性截骨缺损为主[19-35，38-45]；造模方法决定了股骨造模部位，圆柱形骨缺损动物模型主要集中在实验对象的股骨远端，而节段性截骨骨缺损的动物模型主要集中在股骨中段；观察指标主要集中在生物力学[24，27，30-31，39，41-44]、影像学及组织学的相关评价[19，21-25，27，30-45]。大鼠股骨节段性骨缺损模型制备范围在3-8 mm；圆柱形骨缺损范围在(3-5) mm(深度)×(2.6-3) mm(直径)[21，25，35]；小鼠节段性骨缺损模型制备范围在1.6-3 mm之间；兔股骨远端圆柱形骨缺损范围在(6-15) mm(深度)×(5-6) mm (直径)；羊股骨远端圆柱形骨缺损缺损范围(12-15) mm(深度)×(4-8) mm(直径) [23，32-33]。纳入文献中，有3篇文献对动物实验过程中的不良反应进行了报道[31，35，39]，包括感染、应力性骨折；4篇文献报道了分别因麻醉过量及其他原因导致的动物死亡[31，35，39，43]，整体安全性尚可。基于上述不良反应，在达到手术造模目的的同时，及时止血，减少创伤，特别是骨缺损制备使用器械的过程中更应该精细操作；同时根据不同麻醉剂的特点，精确计算麻醉剂量，尽量避免由于人为因素导致的实验动物的死亡。
2.3 实验目的 文献中股骨骨缺损动物模型多用于骨修复材料、药物、物理疗法等治疗骨缺损的疗效评价，同时也用于骨缺损愈合机制的相关研究，对于骨缺损形状的选择标准未作特殊说明。圆柱形、节段性截骨及楔形骨缺损动物模型均可评估上述治疗方法的有效性与安全性。对于评估特殊类型骨缺损而言则需要相对特殊的骨缺损模型，例如文献中评估松质骨或骨质疏松骨缺损愈合机制多选用股骨远端圆柱形骨缺损模型；同时，如果实验需要，股骨远端缺损可以同时造成骨与软骨损伤，在有限的实验时间内同时观察骨与软骨损伤的修复过程。而对皮质骨缺损及髓腔再通机制的研究则多选用股骨中段截骨骨缺损，且节段性截骨骨缺损也适用于大段骨缺损愈合机制及生理状态下载荷能力的研究，根据实验目的选择合适的骨缺损模型可以更加客观评估不同治疗方法对骨缺损干预的有效性。颅骨骨缺损从第一例临床报道至今已有百年历史，而颅骨骨缺损动物模型也以其标准化的骨缺损模型、组织学和放射学易于评估，在骨缺损动物模型中占据了相当高的比例。但是作为非负重区域，无法在生理状态下评估力学载荷实验，也无法同时评估骨与软骨修复过程，在一定程度上限制了该模型的应用。因此在上述方面股骨骨缺损可能是更好的骨缺损模型。
2.4 骨缺损范围的选择 动物实验过程中，良好的空白对照对实验结果的观察具有重要作用，不同实验对象本身具备不同的自我修复能力，因此骨缺损模型制备过程中骨缺损大小如何限定是需要考虑的问题。若缺损过小的骨缺损自行愈合会影响实验结果，对骨缺损修复材料的治疗效果、是否具有促成骨作用以及促成骨作用机制的评估产生误判，进而失去研究的意义。因此在1986年有学者提出临界性骨缺损(bone size defect，CSD)的概念，SCHMITZ等[53]提出动物一生中不会自动愈合的最小尺寸的骨缺损即为CSD，将CSD定义为周径的1.5-2.5倍或缺损长度为模型对象的1/10以上，超过此范围就会出现缺损不愈合；1990年HOLLINGER等[54]进一步定义了CSD，他认为在动物生命周期内愈合率小于10%的骨缺损即可定义为CSD。CSD超出了机体自然状态下的再生极限，需要借助材料才能促进骨缺损的愈合。若实验目的用于骨组织材料促成骨性能的评估，则设置大于CSD的骨缺损动物模型对于实验的指导就具有至关重要的意义，缺损范围小于临界性骨缺损值，在观察期内自行愈合，进而影响最终的实验结果。不同动物模型、不同模型制备方法及不同动物自我愈合能力不同，CSD值也不同，甚至部分文献并未叙述CSD的取值范围。作者认为CSD与动物模型、模型制备方法以及实验目的密切相关，而是否需要设定临界性骨缺损的实验动物模型在很大程度上取决于实验目的。
骨缺损特别是大段骨缺损是临床工作中的重点和难点，不同动物自我修复能力不同，故CSD值也有所差异。文献中大鼠股骨节段性骨缺损模型制备范围在3-8 mm之间。T?LLI等[55]、SKALICZKI等[56]学者通过股骨节段性截骨、钢板螺钉固定构建骨缺损模型，结果发现给予活性物质治疗后，8 mm和6 mm并未出现骨重建，产生了稳定的临界性骨缺损，因此认为6-8 mm可以作为大鼠节段性截骨临界性骨缺损值。ZWINGENBERGER等[43]分别制备了长度1，2，3 mm的小鼠节段性骨缺损模型，治疗后发现，3 mm骨缺损组最终产生了稳定的骨缺损不愈合；TAZAWA等[57]和ALAEE等[58]发现2 mm的小鼠节段性截骨不给予活性物质干预的情况下没有表现出愈合趋势，国内学者靳慧勇等[59]分别制备了长度1，2及2.5 mm的股骨干中段骨缺损模型，3个月后经过影像学发现2 mm及2.5 mm的骨缺损没有发生愈合。通过上述研究可以发现，小鼠2 mm节段性骨缺损应该可以作为临界性骨缺损值，在实验设计过程中可以作为参考。圆柱形骨缺损动物模型较少用于节段骨缺损愈合机制的研究，多用于评估材料的成骨性及骨诱导能力或其他研究目的，有报道称10 mm(深度)×6/7 mm(直径)兔股骨髁圆柱骨缺损模型，可以作为临界性骨缺损模型进行实验研究[60-61]。羊是大型动物的代表，有研究认为其根据部位的不同CSD值也不尽相同，约等于相对应骨干直径的3倍[62]，但仍需进一步考证。同时受困于动物体型、实验场地、实验经费以及管理所存在的不便性，选择大型动物作为实验观察对象较少。综上，临界性骨缺损需要综合考虑实验对象及实验目的的不同，同时结合既往报道进行设定。与此同时，可视化软件的应用也为骨缺损值的量化提供了一定的可行性。参照SCHMITZ等[53]及HOLLINGER等[54]的论述，结合可视化软件的应用，对不同性别、不同月龄动物的股骨进行量化，做好术前规划，选取合适的骨缺损部位及大小，既可以避免动物资源的浪费，又可以为临床提供可靠的数据支持。可视化软件应用于动物手术过程中已有报道，ABO，STAMM等[63-64]通过将放射学数据对骨骼模型进行重建，模拟手术过程进行精确截骨；SINGH，LOHRE等[65-66]通过显微CT重建模拟大鼠肝叶精确切除手术。因此在后期的发展过程中，完好的术前规划、精细化管理也是发展的方向所在，但是此种方法的不足之处在于会增加实验成本。
2.5 骨缺损与骨骺损伤 既往文献较少论述骨缺损制备过程中如何避免骨骺损伤，对骨损伤与骨骺损伤如何划分也未作过多说明。SUN等 [67]以成年大鼠为研究对象，通过3D解剖和虚拟手术，将大鼠股骨分为Ⅰ-Ⅲ共6个区域，其中认为当缺损部位靠近Ⅲ区特别是Ⅲb区时所形成的损伤更接近骨骺损伤而非骨缺损或损伤，继而影响骨的生长；同时Ⅲ区操作有可能出现骨折，进而造成关节、韧带以及滑膜损伤，以至于出现关节的早期退化与不稳定，对骨愈合造成不良影响[68]。对于其他动物模型，有关骨损伤和骨骺损伤的描述较少。同时啮齿类动物的生长过程似乎终生留有生长软骨板，因此在实验过程中，需要综合考虑，可以结合既往研究，尽可能远离骨骺与关节区域。
2.6 缺损部位的干预及固定方式的选择 圆柱形骨缺损模型通常以填充的方式填充缺损处，而节段性、楔形骨缺损模型的固定方式包括钢板螺钉、钢丝困扎及外固定架等。
骨缺损特别是节段性骨缺损和楔形骨缺损的修复，必须在稳定状态下才能实现，因此在股骨骨缺损模型制备过程中，必须重建稳定性，才能客观全面观察骨缺损的愈合，对愈合时间及愈合机制做出合理、客观的评价。常用的固定方式包括外固定(如外固定架)和内固定(如钢板螺钉) [69-71]。外固定架在一定程度上保留骨膜和软组织，对局部血液供应影响较小，且外固定对植骨材料影响较小，可最大程度避免外在因素对骨愈合的干扰；但是钉道易感染，外固定术后动物如何护理是实验设计者需要考虑的问题，如动物是否会撕咬固定器进而对实验结果造成影响。钢板内固定易实现缺损部位的刚性固定，可以较好地重建骨缺损区域的稳定性，但是钢板固定会在一定程度上破坏了骨组织的血液供应，由此是否会影响自然状态下骨的修复及对骨材料是否造成影响文献中并未提及[72-74]。一项大型动物骨缺损固定方式回顾性分析显示[75]，认为外固定较内固定而言更具有优势。由于重建缺损部位稳定性的干扰因素较多，因此有学者选择非负重长骨进行骨缺损动物实验，动物实验中大多认为新西兰兔的前肢骨和鼠的胫骨属于非负重骨，缺损后不需要额外固定，一定程度上解决了固定方式不同给研究者造成的困扰。但是实验中仍存在因过度运动或其他原因导致骨折的发生。似乎没有哪一种固定方式是完美的，可以结合实验目的及实验条件对骨缺损进行合适的固定。
2.7 评价指标 骨缺损动物模型主要为临床骨组织工程、生物活性支架以及基于此所构建的复合材料的临床应用提供支持，评价指标主要集中在影像学、生物力学、骨组织形态及组织学[76-80]。
X射线片可以从成骨、连接及髓腔改建各方面对新生骨组织进行评估。双能X射线还可以对骨密度进行评估，骨密度主要作为骨质疏松模型的常用指标，用来观察对骨质疏松模型干预效果的评估，对于常规动物模型骨密度检测并不作为常规指标使用。骨小梁的微观结构较小，X射线片并不能得到清晰可辨的骨小梁结构图。随着医学影像技术的发展，骨形态计量学在骨科领域的应用逐渐增加。Micro-CT除了能对骨密度进行评估外，还可以客观反映骨缺损在填充不同修复材料后，新生骨小梁的生长变化特点，通过三维模式直观反映填充材料的吸收降解状况，对骨小梁面积百分比、骨小梁厚度、骨小梁密度及骨小梁的分离度等进行量化，从多个方面评估新生骨的生成情况[81-83]。由于治疗骨缺损材料需要植入承重部位，对未缺损的骨骼起到连接和支撑等作用，故需要一定的力学强度。临床中可以通过多种方式对植入材料的力学性能进行评估，比如压缩试验、三点弯曲试验及复合载荷加载试验等，可以根据不同的实验设计及现有条件，选择合适的检测方法，系统评估植入材料的生物力学性能[84-85]；除此之外用于骨缺损修复的材料大都具备一定的生物活性，因此材料植入后观察其成骨活性及相关骨代谢指标也有一定的必要性，如碱性磷酸酶、Ⅰ型原胶原羧基端前肽等，用于评估骨材料的成骨情况[86-87]。总之，临床现有检测手段可以对骨缺损植入后材料的转归及骨组织的再生情况进行观察，从静态到动态，从宏观到微观，通过检测手段可以做到良好的追踪，进而全面评估治疗手段的有效性与安全性。
2.8 存在的不足 无论是圆柱形骨缺损还是节段性骨缺损动物模型，文献中尚存在一定不足。第一、文献中并未提及圆柱形骨缺损模型制备过程中如何区别骨缺损与骨骺损伤，也未说明不同骨缺损模型及不同的固定方式对最终的实验结果是否存在影响；第二、骨缺损范围的大小并未进行规范的量化；第三、未说明内植物位置是否需要评估，是否需要影像学的监测及监测时间点如何选择；第四、文中未说明动物性别及月龄选择标准，这两种因素对实验结果存在一定影响[88-89]。除非特别需要(如绝经后骨质疏松骨缺损)，建议在实验过程中对不同性别及月龄同时进行评估，避免由此造成的差异；第五、纳入文献中动物样本量参差不齐；第六、文献中仅涉及正常动物模型，未评价炎性、病理性骨缺损等其他情况。
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创伤、感染、肿瘤及骨质疏松等疾病均可引起骨缺损，导致肢体功能障碍及长时间的临床恢复。骨缺损的临床报道最早见于1895年，EASTMAN[1]通过自体骨移植治疗2例颅骨骨缺损的患者，其中1例获得随访并取得了满意的临床效果。时至今日，骨缺损的修复及后期临床转归仍是临床研究中的热点和难点，是困扰临床医师的常见问题[2]。由于自体骨和同种异体骨众所周知的缺陷，各国学者一直致力于临床骨缺损的治疗及人工骨修复材料的研发，而建立理想的骨缺损动物模型可以有效评估临床疗效及骨修复材料的生物相容性和骨修复效果[3-4]，为临床研究提供可靠的参考。最早的骨缺损动物模型可以追溯到1973年，FREEMAN和TURNBULL[5]构建直径2 mm的大鼠颅骨骨缺损模型，用于骨填充修复材料的评估。颅骨解剖结构易于通过影像学和组织学对实验进行评估，但与其他部位骨相比，颅骨血运较差，靠近中枢神经系统，不利于复杂骨缺损模型的构建[6-8]。同时颅骨骨缺损模型无法评估大段骨缺损及髓腔是否再通的修复效果，因此长骨骨缺损模型逐渐出现。1993年HILTUNEN等[9]首次报道了小鼠胫骨骨缺损模型，但胫骨呈三角形且靠近腓骨，在一定程度会影响骨修复过程[10]。股骨作为管状骨，内外径相对一致，与胫骨和颅骨相比可以提供如骨质疏松、感染性以及其他更复杂的骨缺损模型，且股骨作为负重骨，可以更加客观地评价骨修复过程中生理状态下的力学载荷 [11-12]。近年来，骨组织工程、生物活性支架以及基于此所构建的复合材料对骨缺损的治疗起到了积极作用[13-14]。
因此构建合适、可重复性及无限接近临床的动物实验模型对临床应用前的评估至关重要[15-18]。故作者阅读并总结了相关文献，目的在于为学者提供稳定的、可以客观评估骨缺损修复过程的股骨骨缺损动物模型，为相关研究者选择合适的股骨骨缺损动物模型提供参考。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
因此构建合适、可重复性及无限接近临床的动物实验模型对临床应用前的评估至关重要[15-18]。故作者阅读并总结了相关文献，目的在于为学者提供稳定的、可以客观评估骨缺损修复过程的股骨骨缺损动物模型，为相关研究者选择合适的股骨骨缺损动物模型提供参考。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
1.1 资料来源
1.1.1 检索人及检索时间 第一作者在2022年8月进行检索。
1.1.2 检索文献时限 2000-01-01/2022-08-01。
1.1.3 检索数据库 检索Pubmed、Web of Science、Medline数据库及CNKI数据库。
1.1.4 检索途径 全文检索。
1.1.5 检索词 英文检索词：bone defect，bone，bones，defect，defects，defective，animal model，animal，model，Laboratory，Laboratory animal，animal Laboratory；检索范围为“All fields”；中文检索词：骨缺损，动物模型，实验。
1.1.6 检索文献类型 研究原著，动物实验。
1.2.1 纳入标准 ①随机对照动物实验；②骨缺损模型；③造模部位为股骨。
1.2.2 排除标准 ①软骨缺损模型；②股骨头坏死模型；③骨关节炎模型；④非原创性研究；⑤多节段骨缺损；⑥数据重复或不完整；⑦体外动物实验；⑧基因变异动物模型；⑨综述；⑩单纯骨折，非骨缺损动物模型。
1.1.1 检索人及检索时间 第一作者在2022年8月进行检索。
1.1.2 检索文献时限 2000-01-01/2022-08-01。
1.1.3 检索数据库 检索Pubmed、Web of Science、Medline数据库及CNKI数据库。
1.1.4 检索途径 全文检索。
1.1.5 检索词 英文检索词：bone defect，bone，bones，defect，defects，defective，animal model，animal，model，Laboratory，Laboratory animal，animal Laboratory；检索范围为“All fields”；中文检索词：骨缺损，动物模型，实验。
1.1.6 检索文献类型 研究原著，动物实验。
1.1.7 检索策略 检索策略以图片形式展现，以英文检索为例，详见图1。
1.2.1 纳入标准 ①随机对照动物实验；②骨缺损模型；③造模部位为股骨。
1.2.2 排除标准 ①软骨缺损模型；②股骨头坏死模型；③骨关节炎模型；④非原创性研究；⑤多节段骨缺损；⑥数据重复或不完整；⑦体外动物实验；⑧基因变异动物模型；⑨综述；⑩单纯骨折，非骨缺损动物模型。
1.3 质量评估与数据提取 阅读文献及摘要后根据纳入与排除标准，剔除研究内容重复、设计不合理等文献。最终纳入89篇，其中中文2篇，英文87篇。文献检索流程见图2。
骨缺损是临床中常见的问题，骨组织工程的发展是骨缺损治疗中非常有前景的学科，而合适、标准化的骨缺损动物模型是评价各种治疗方案有效与否的必要条件，因此构建合适的骨缺损动物模型不可或缺。虽然动物实验能够提供一定的证据支持，但不可否认骨缺损愈合是一个长期的渐进过程，通过动物实验完全模仿临床骨缺损愈合的过程有一定难度，这就需要研究人员结合动物模型、干预措施以及实验目的等进行综合研判，选择最合适的动物模型，得出更客观的证据。目前的研究表明，股骨骨缺损模型以圆柱形及节段截骨骨缺损为主，主要是股骨远端及中段，手术方法及术后处理较为成熟，可操作性强，能够提供成熟的实验动物模型。就圆柱形骨缺损而言，大鼠及新西兰兔更适合，而节段性截骨则无特殊要求，各种动物均能满足实验要求。
总之，没有哪一种动物模型是完美契合临床的，研究者应根据实验目的及动物的自身特点，选择合适的动物类型、骨缺损部位，并确定缺损范围的大小，这样可以获得经济、重复性好、并且能够客观评价骨缺损修复过程的较为理想的实验动物模型。与此同时，目前存在的骨缺损动物模型不应该作为终点，为了进一步研究骨缺损，今后需要纳入更高质量的文献，逐步形成模型制备标准，更好地为临床服务。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
总之，没有哪一种动物模型是完美契合临床的，研究者应根据实验目的及动物的自身特点，选择合适的动物类型、骨缺损部位，并确定缺损范围的大小，这样可以获得经济、重复性好、并且能够客观评价骨缺损修复过程的较为理想的实验动物模型。与此同时，目前存在的骨缺损动物模型不应该作为终点，为了进一步研究骨缺损，今后需要纳入更高质量的文献，逐步形成模型制备标准，更好地为临床服务。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
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文题释义：
临界性骨缺损：骨发生缺损后，不经任何处理在自然状态下不能自行愈合的最小骨缺损的尺寸。动物模型：是基于实验动物建立的模拟人类疾病或满足研究的动物，是实验治疗方式走向临床的一个重要过程。
骨缺损的修复及后期临床转归仍是临床研究中的热点和难点，是困扰临床医师的常见问题。一种新治疗方式在应用临床之前往往需要通过动物实验进行验证，构建合适的动物模型是治疗方法从实验到临床、从动物到人体不可缺少的部分。#br#
最早的骨缺损动物模型可以追溯到1973年，FREEMAN和TURNBULL构建大鼠颅骨骨缺损模型，用于骨填充修复材料的评估。但颅骨骨缺损模型无法评估大段骨缺损及髓腔是否再通的修复效果。因此长骨骨缺损模型逐渐出现，1993年HILTUNEN等首次报道了小鼠胫骨骨缺损模型，但胫骨呈三角形且靠近腓骨，在一定程度会影响骨修复过程。股骨作为管状骨，内外径相对一致，与胫骨和颅骨相比可以提供如骨质疏松、感染性以及其他更复杂的骨缺损模型，且股骨作为负重骨，可以更加客观评价骨修复过程中生理状态下力学载荷的评估。构建合适、可重复性及无限接近临床的动物实验模型对临床应用前的评估至关重要。
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