数字化技术构建SD大鼠颞下颌关节骨关节炎动物模型

doi:10.12307/2024.573

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (35): 5642-5648.doi: 10.12307/2024.573

• 口腔组织构建 oral tissue construction • 上一篇下一篇

数字化技术构建SD大鼠颞下颌关节骨关节炎动物模型

刘鹏慧，吴凡，王泽杰，吴高义，周立波

佳木斯大学附属口腔医院，佳木斯大学口腔医学工程实验中心，黑龙江省口腔生物医学材料与临床应用重点实验室，黑龙江省佳木斯市 154000

收稿日期:2023-10-30 接受日期:2023-11-22 出版日期:2024-12-18 发布日期:2024-03-15
通讯作者: 周立波，博士，副主任医师，佳木斯大学附属口腔医院，佳木斯大学口腔医学工程实验中心，黑龙江省口腔生物医学材料与临床应用重点实验室，黑龙江省佳木斯市 154000
作者简介:刘鹏慧，女，1997年生，汉族，硕士，主要从事颞下颌关节疾病的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(61771290，61871393)，项目负责人：吴高义；黑龙江省自然科学基金项目(LH2021H108)，项目负责人：周立波；黑龙江省教育厅青年人才创新计划项目(UNPYSCT-2020057)，项目负责人：周立波；佳木斯大学青年创新人才培养计划项目(JMSUQP2020020)，项目负责人：周立波

Constructing an animal model of temporomandibular joint osteoarthritis in Sprague-Dawley rats by digital technology

Liu Penghui, Wu Fan, Wang Zejie, Wu Gaoyi, Zhou Libo

Experimental Center for Stomatology Engineering & Heilongjiang Key Lab of Oral Biomedicine Materials and Clinical Application, Jiamusi University Affiliated Stomatological Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China

Received:2023-10-30 Accepted:2023-11-22 Online:2024-12-18 Published:2024-03-15
Contact: Zhou Libo, MD, Associate chief physician, Experimental Center for Stomatology Engineering & Heilongjiang Key Lab of Oral Biomedicine Materials and Clinical Application, Jiamusi University Affiliated Stomatological Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China
About author:Liu Penghui, Master, Experimental Center for Stomatology Engineering & Heilongjiang Key Lab of Oral Biomedicine Materials and Clinical Application, Jiamusi University Affiliated Stomatological Hospital, Jiamusi University, Jiamusi 154000, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, Nos. 61771290 and 61871393 (both to WGY); Natural Science Foundation of Heilongjiang Province, No. LH2021H108 (to ZLB); Young Talent Innovation Program of Heilongjiang Provincial Department of Education, No. UNPYSCT-2020057 (to ZLB); Young Innovative Talent Training Program of Jiamusi University, No. JMSUQP2020020 (to ZLB)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

数字化3D打印技术：简称3D打印技术，又称为快速成型技术、快速原型技术或增材制造技术，可根据选择的材料、特定的计算机辅助设计(CAD)和精确的制造工艺来生产个性化三维物体。
精度：表示观测值与真值的接近程度，与误差的大小相对应，因此可用误差大小来表示精度的高低，误差小则精度高，误差大则精度低。

背景：颞下颌关节骨关节炎是一种发病率很高的口腔常见病，而颞下颌关节骨关节炎早期隐匿不易被发现，临床上病理标本获取难度较高，难以开展相关研究。将数字化3D打印技术应用到颞下颌关节骨关节炎动物模型上来增加动物模型的一致性，从而促进颞下颌关节骨关节炎疾病的研究。

目的：利用新型数字技术建立标准化的颞下颌关节骨关节炎大鼠模型。
方法：将30只SD雌性大鼠根据单侧前牙反牙合建模方法的不同，随机分为3组，传统模型组、数字化模型组和对照组，每组10只。于建模后4，8周采集髁突软骨标本，体式显微镜观察表观形态，苏木精-伊红染色、番红O/固绿染色观察病理形态，ELISA观察白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α 的表达变化，免疫组织化学染色观察蛋白多糖、Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13的表达变化。

结果与结论：①数字化模型组和传统模型组观察到不同程度的退行性病变。干预后第1周，模型组大鼠体质量均呈下降趋势，随后呈增长趋势，且显著低于对照组。②体式显微镜观察结果显示，建模后4，8周，数字化模型组表面的变形及缺损程度明显高于传统模型组。③两个时间点，数字化模型组和传统模型组的国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分均高于对照组，数字化模型组高于传统模型组(P < 0.05)。④组织病理学观察显示，建模后4，8周，两个模型组的改良Mankin评分和OARSI评分均显著高于同龄对照组(P < 0.05)。⑤免疫组织化学染色结果显示，建模后4，8周，与同龄对照组相比，蛋白多糖及Ⅱ型胶原在传统模型组与数字化模型组两个时间点表达降低，基质金属蛋白酶13表达增强(P < 0.05)。⑥ELISA结果显示，传统和数字化模型组大鼠8周时炎性因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的表达水平均高于同龄对照组，数字化模型组高于传统模型组 (P < 0.05)。⑦采用3D打印技术设计制作的个性化金属管，无需反复试戴调整即能快速引导颞下颌关节发生骨关节炎样病变，可重复性好，适合推广应用。

https://orcid.org/0009-0006-1748-8059(刘鹏慧)；https://orcid.org/0009-0000-9663-3088(周立波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 颞下颌关节, 骨关节炎, 数字化技术, 3D打印, 动物模型, 单侧前牙反牙合, 咬合, 髁突软骨, 退行性病变, 高精度

Abstract: BACKGROUND: Temporomandibular joint osteoarthritis is a common oral disease with a high incidence. However, temporomandibular joint osteoarthritis is not easy to be detected in the early stage, and it is difficult to obtain clinical pathological specimens, so it is difficult to carry out related research. The application of digital 3D printing technology to animal models of Temporomandibular joint osteoarthritis increases the consistency of the animal models, thus promoting the study of temporomandibular joint osteoarthritis.
OBJECTIVE: To establish a standardized animal model of temporomandibular joint osteoarthritis using novel digital technology.
METHODS: According to the different modeling methods of unilateral anterior crossbite, 30 female Sprague-Dawley rats were randomly divided into traditional model group, digital model group, and control group (n=10 per group). Cartilage specimens of the condyles were collected at 4 and 8 weeks after modeling. The apparent morphology was observed by stereoscopic microscope. The pathological morphology was observed by hematoxylin-eosin staining and Safranin O/fast green staining. Changes in the expression of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were observed by ELISA, and changes in the expression of aggrecan, type II collagen and matrix metalloproteinase-13 were observed by immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Different degrees of degeneration were observed in the digital and traditional model groups. The body mass of rats in both the model groups decreased during the 1st week after intervention and subsequently demonstrated growth trend and were significantly lower than that in the control group. The results of stereoscopic microscope showed that at 4 and 8 weeks after modeling, the deformation and defect degree of the digital model group was significantly higher than that of the traditional model group. At these two time points, the Osteoarthritis Research Society International scores of the digital model group and the traditional model group were higher than those of the control group, and the Osteoarthritis Research Society International score of the digital model group was higher than that of the traditional model group (P < 0.05). Histopathological observation showed that the modified Mankin score and Osteoarthritis Research Society International score of the two model groups were significantly higher than those of the control group of the same age at 4 and 8 weeks after modeling (P < 0.05). Immunohistochemical staining results showed that at two time points, compared with the control group of the same age, the expression of aggrecan and type II collagen decreased in the traditional model group and the digital model group, while the expression of matrix metalloproteinase 13 increased (P < 0.05). ELISA results showed that the expression levels of inflammatory factors interleukin-1β and tumor necrosis factor-α in the traditional and digital model groups were higher than those in the control group at 8 weeks, and the expression levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α in the digital model group were higher than those in the traditional model group (P < 0.05). To conclude, the personalized metal tube designed and produced by 3D printing technology can quickly guide the osteoarthritis-like lesions of the temporomandibular joint without repeated trial and adjustment, which is reproducible and suitable for promotion and application.

Key words: temporomandibular joint, osteoarthritis, digital technology, 3D printing, animal model, unilateral anterior crossbite, occlusion, condylar cartilage, degenerative changes, high precision

中图分类号:

刘鹏慧, 吴凡, 王泽杰, 吴高义, 周立波. 数字化技术构建SD大鼠颞下颌关节骨关节炎动物模型[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5642-5648.

Liu Penghui, Wu Fan, Wang Zejie, Wu Gaoyi, Zhou Libo. Constructing an animal model of temporomandibular joint osteoarthritis in Sprague-Dawley rats by digital technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(35): 5642-5648.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析建模过程中无大鼠死亡，30只大鼠全部进入结果分析。数字化模型组平均手术时间为(134.5±2.68) s，传统模型组平均手术时间为(233.47±4.98) s，显著高于数字模型组(P < 0.05)。建模后，传统模型组和数字模型组大鼠的体质量在第1周内下降，随后呈正常增长趋势。模型组大鼠体质量均明显低于对照组同龄大鼠，见图3。

2.2 各组大鼠造模后体式显微镜观察结果对照组大鼠的髁突软骨外观，在2个时间点，髁突表面完整、光滑连续，呈丰满的梭形。在2个模型组中，建模后第4周髁突表面变为瘦长的梭形，变红；第8周髁突的表面出现轻微的变形，并伴有不规则凹陷、缺损，见图4A。在建模后第4周和第8周，数字化模型组损伤程度明显高于传统模型组。数字化模型组和传统模型组的OARIS评分均高于对照组，数字化模型组高于传统模型组(P < 0.05)，见图4B。

2.3 各组大鼠组织病理学观察结果根据前期文献报道，将髁突软骨由表面至深层大致分为5层，分别为纤维软骨层、增殖软骨层、前肥大软骨层、肥大软骨层和钙化软骨层。正常对照组的髁突软骨组织形态正常，呈连续完整的弧形；软骨中髁突软骨细胞分界清晰，各层排列有序紧密，间隙很小，5层软骨细胞形态典型。UAC干预后传统模型组和数字化模型组的颞下颌关节组织均出现不同程度的骨关节炎样表现，2个模型组在UAC干预4周后，软骨细胞排列明显紊乱；在干预8周后，软骨厚度逐渐变薄，2个模型组从UAC干预4周后起，髁突软骨全层厚度变薄，软骨细胞密度下降，见图5A。两个模型组的改良Mankin评分在2个时间点均显著高于同龄对照组，见图5C。番红O/固绿染色下观察对照组软骨着色均匀，软骨基质中蛋白多糖(红色区域)主要集中在软骨深层的前肥大层和肥大软骨层。在UAC干预4周后软骨着色明显减退，2个模型组蛋白多糖丢失，软骨基质出现丧失。2个模型组的软骨着色程度明显低于同龄对照组，见图5B。2个模型组的OARIS评分在2个时间点均显著高于与同龄对照组，见图5D。数字化模型组在建模后4周时出现蛋白多糖丢失。

2.4 各组大鼠炎性因子表达水平 ELISA结果显示，传统模型组和数字化模型组大鼠建模后8周时炎性因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的表达水平均高于同龄对照组，数字化模型组高于传统模型组(P < 0.05)，见图6A。 2.5 各组大鼠免疫组织化学染色结果蛋白多糖、Ⅱ型胶原是用来鉴定软骨基质蛋白的主要标记物，免疫组织化学染色显示，与同龄对照组相比，蛋白多糖、Ⅱ型胶原在传统模型组与数字化模型组2个时间点表达降低，见图6B-D，在2个时间点基质金属蛋白酶13表达增强并伴随阳性细胞率增多，说明模型组软骨基质出现降解。

参考文献

[1] WANG XD, ZHANG JN, GAN YH, et al. Current understanding of pathogenesis and treatment of TMJ osteoarthritis. J Dent Res. 2015;94(5):666-673.
[2] 孟娟红,甘业华,马绪臣.颞下颌关节骨关节炎发病的分子机制及相关治疗的实验研究[J].北京大学学报(医学版),2013,45(1):4.
[3] HE D, AN Y, LI Y, et al. RNA sequencing reveals target genes of temporomandibular joint osteoarthritis in rats after the treatment of low-intensity pulsed ultrasound. Gene. 2018;672:126-136.
[4] ZHANG M, YANG H, LU L, et al. Matrix replenishing by BMSCs is beneficial for osteoarthritic temporomandibular joint cartilage. Osteoarthritis Cartilage. 2017;25(9):1551-1562.
[5] LONG HQ, TIAN PF, GUAN YX, et al. Expression of Ihh signaling pathway in condylar cartilage after bite-raising in adult rats. J Mol Histol. 2019; 50(5):459-470.
[6] ZHANG M, WANG H, ZHANG J, et al. Unilateral anterior crossbite induces aberrant mineral deposition in degenerative temporomandibular cartilage in rats. Osteoarthritis Cartilage. 2016; 24(5):921-931.
[7] ZHANG HY, XIE MJ, YANG HX, et al. Catabolic changes of rat temporomandibular joint discs induced by unilateral anterior crossbite. J Oral Rehabil. 2019;46(4):340-348.
[8] WANG D, YANG H, ZHANG M, et al. Insulin-like growth factor-1 engaged in the mandibular condylar cartilage degeneration induced by experimental unilateral anterior crossbite. Arch Oral Biol. 2019;98: 17-25.
[9] LIU J, YANG H, ZHANG H, et al. Biomechanically reduced expression of Derlin-3 is linked to the apoptosis of chondrocytes in the mandibular condylar cartilage via the endoplasmic reticulum stress pathway. Arch Oral Biol. 2020;118:104843.
[10] ROBINSON NB, KRIEGER K, KHAN FM, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
[11] NESIC D, SCHAEFER BM, SUN Y, et al. 3D printing approach in dentistry: the future for personalized oral soft tissue regeneration. J Clin Med. 2020;9(7):2238.
[12] ZHENG J, CHEN X, JIANG W, et al. An innovative total temporomandibular joint prosthesis with customized design and 3D printing additive fabrication: a prospective clinical study. J Transl Med. 2019;17(1):4.
[13] LIU YD, LIAO LF, ZHANG HY, et al. Reducing dietary loading decreases mouse temporomandibular joint degradation induced by anterior crossbite prosthesis. Osteoarthritis Cartilage. 2014;22(2):302-312.
[14] ZHANG J, LIAO L, ZHU J, et al. Osteochondral interface stiffening in mandibular condylar osteoarthritis. J Dent Res. 2018;97(5):563-570.
[15] WANG Y L, ZHANG J, ZHANG M, et al. Cartilage degradation in temporomandibular joint induced by unilateral anterior crossbite prosthesis. Oral Dis. 2014;20(3):301-306.
[16] PRITZKER KP, GAY S, JIMENEZ SA, et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 2006; 14(1):13-29.
[17] VAN DER SLUIJS JA, GEESINK RG, VAN DER LINDEN AJ, et al. The reliability of the Mankin score for osteoarthritis. J Orthop Res. 1992; 10(1):58-61.
[18] YUAN W, WU Y, ZHOU X, et al. Comparison and applicability of three induction methods of temporomandibular joint osteoarthritis in murine models. J Oral Rehabil. 2022;49(4):430-441.
[19] 叶程心月,汤颖,刘超,等.SD大鼠牙列的显微CT观测 [J].实用口腔医学杂志,2019,35(6):794-799.
[20] LIU X, CAI HX, CAO PY, et al. TLR4 contributes to the damage of cartilage and subchondral bone in discectomy-induced TMJOA mice. J Cell Mol Med. 2020;24(19):11489-11499.
[21] BI R, CHEN K, WANG Y, et al. Regulating fibrocartilage stem cells via TNF-alpha/Nf-kappaB in TMJ osteoarthritis. J Dent Res. 2022;101(3):312-322.
[22] JIANG H, XU L, LIU W, et al. Chronic pain causes peripheral and central responses in MIA-induced TMJOA rats. Cell Mol Neurobiol. 2022;42(5):1441-1451.
[23] ZHANG C, ZHU M, WANG H, et al. LOXL2 attenuates osteoarthritis through inactivating Integrin/FAK signaling. Sci Rep. 2021;11(1):17020.
[24] LIANG C, YANG T, WU G, et al. Therapeutic effect of low-intensity pulsed ultrasound on temporomandibular joint injury induced by chronic sleep deprivation in rats. Am J Transl Res. 2019;11(6):3328-3340.
[25] CHEN G, ZHAO H, MA S, et al. Circadian rhythm protein bmal1 modulates cartilage gene expression in temporomandibular joint osteoarthritis via the MAPK/ERK pathway. Front Pharmacol. 2020;11: 527744.
[26] DU J, JIANG Q, MEI L, et al. Effect of high fat diet and excessive compressive mechanical force on pathologic changes of temporomandibular joint. Sci Rep. 2020;10(1):17457.
[27] ROGERS-DECOTES AW, PORTO SC, DUPUIS LE, et al. ADAMTS5 is required for normal trabeculated bone development in the mandibular condyle. Osteoarthritis Cartilage. 2021;29(4):547-557.
[28] ZHANG J, ZHANG S, QI WJ, et al. Mechanism and potential contributing factors to temporomandibular joint osteoarthritis. Oral Dis. 2023;29(3): 1060-1069.
[29] ZHANG Y, XU X, ZHOU P, et al. Elder mice exhibit more severe degeneration and milder regeneration in temporomandibular joints subjected to bilateral anterior crossbite. Front Physiol. 2021;12:750468.
[30] ZHANG Y, LIU Q, XU X, et al. Long-term effect of bilateral anterior elevation of occlusion on the temporomandibular joints. Oral Dis. 2022;28(7):1911-1920.
[31] MA S, ZHANG A, LI X, et al. MiR-21-5p regulates extracellular matrix degradation and angiogenesis in TMJOA by targeting Spry1. Arthritis Res Ther. 2020;22(1):99.
[32] SPERRY MM, KARTHA S, WINKELSTEIN BA, et al. Experimental methods to inform diagnostic approaches for painful TMJ osteoarthritis. J Dent Res. 2019;98(4):388-397.

引言

颞下颌关节骨关节炎是颞下颌关节紊乱病最严重的亚型，主要特征是颞下颌关节发生进行性软骨退变，关节软骨损伤同时伴有软骨下骨硬化、骨赘形成和滑膜炎[1-2]。有多种因素参与调控软骨退变的过程，在早期软骨病变，细胞外基质的动态平衡被破坏。细胞外基质主要由Ⅱ型胶原、蛋白多糖等组成。基质金属蛋白酶13是一种胶原酶，通过裂解靶蛋白的肽键来调节细胞外基质的降解，通过降解软骨基质参与软骨破坏、退变，在骨关节炎发生发展过程中主要负责降解关节软骨中的Ⅱ型胶原，在早期降解过程中发挥了重要作用，被认为与软骨的早期病变有关，也是众多骨关节炎致病因子作用的重要环节，对骨关节炎的诊断与评估有一定的价值。
相关研究指出，颞下颌关节紊乱病相关动物实验研究滞后于临床研究，构建颞下颌关节紊乱病动物模型的方法各式各样，可供选择的动物种类繁多，如何设计出可靠的、稳定的实验动物模型也是每位学者都应着重解决的问题。异常咬合产生的异常生物力学刺激在颞下颌关节骨关节炎发展中起着重要作用，通过改变咬合创建颞下颌关节骨关节炎模型是一个特有的建模方法。大鼠颞下颌关节髁突和关节盘损伤的病理变化与人类较为相似，因此，可以作为研究颞下颌关节系统疾病较为理想的实验动物。同时有大量学者利用牛通乳针、方弓丝及光固化树脂等材料制作模型在鼠类体内进行直接粘接[3-4]，还可以通过嵌体蜡3/4钴铬金属冠或取牙列石膏模型，在此基础上通过铝板进行制作，从而模拟咬合异常[5]。
此外，一些研究表明，单侧前牙反牙合(unilateral anterior crossbite，UAC)可导致颞下颌关节髁突软骨发生严重的退行性病变[6]。这种通过改变动物切牙的咬合关系建模的方法，大量用于颞下颌关节相关研究[7-9]，目前UAC模型是经历不断优化后的优选模型，适用于SD大鼠及C57BL/6J 小鼠，因此，被用来建立颞下颌关节骨关节炎疾病动物模型模拟颞下颌关节骨关节炎的病理过程。
然而颞下颌关节骨关节炎的确切发病机制仍不清楚。事实上，几乎没有任何针对病因的治疗，目前对颞下颌关节骨关节炎的治疗只是缓解疼痛和炎症的对症治疗。标准化动物模型的应用在疾病探索中发挥着不可替代的作用[10]。众所周知，该病早期隐匿不易被发现，临床上病理标本获取难度较高，在时间及空间上均存在一定局限性。动物模型是用于研究颞下颌关节骨关节炎发病过程、机制及治疗方法的最常见、最有效的手段，鉴于对颞下颌关节骨关节炎机制认识的局限、对生活质量的负面影响和巨大的经济负担，迫切需要充分利用动物颞下颌关节骨关节炎模型克服这些问题，因此精准的动物模型是研究颞下颌关节骨关节炎的重要实验载体。高精度的动物模型是目前的发展趋势，可以实现术前精确测量，改善操作细节，减少人为误差，使其更加准确实用，具有良好的一致性。
UAC模型现已成为颞下颌关节领域研究的重要动物模型，主要用于研究颞下颌关节骨关节炎的病理变化机制，相关的研究均采取自由手制作固定参数金属管，没有考虑到大鼠的个体差异。数字化3D打印技术(简称3D打印技术)又称为快速成型技术、快速原型技术或增材制造技术，可根据选择的材料、特定的计算机辅助设计(CAD)和精确的制造工艺来生产个性化三维物体[11]。3D数字技术已广泛应用于口腔科，并在精度和后期制作效果方面取得了重大进展。3D 打印技术作为一种强大的工具，具有高精准及高效便捷等特点，被应用于颞下颌关节退行性疾病中[12]，优化了临床治疗效果，实现了诊治的可预测性，克服了传统方法的局限性，为口腔疾病精准诊疗的实现提供更具个性化和多元化的新方案。因此，课题组试图研究利用数字技术，根据每只大鼠牙齿的形态进行设计并制造实验的UAC金属管。啮齿类动物的切牙比其他牙齿的功能更强，因为当啮齿动物捕捉或切割食物时，它们习惯在切牙的引导下将下颌骨向矢状方向移动。实验制备的UAC会严重干扰这一功能，并提供和正常切牙完全相反的引导，而颞下颌关节在同一时间只能支持其中一种模式[13]。
实验基于数字化技术建立UAC大鼠模型，目的是将数字化技术构建的UAC模型与传统的UAC建模方法进行比较，希望该研究结果为颞下颌关节骨关节炎相关动物模型的选择提供有效依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，双因素方差分析， LSD-t 检验。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2023年6月在佳木斯大学口腔医学工程实验中心完成。
1.3 材料 30只6周龄雌性SD大鼠，体质量160-180 g，由佳木斯大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(吉)-2020-0002。雌鼠和雄鼠在发育上存在一定差异包括牙齿结构，为了避免性别差异带来的影响，实验统一了动物的性别。因此正如之前的报告中所做的那样，目前只使用雌性动物来减少性别的影响[14]。在研究期间，所有动物分笼饲养(5只/笼)，所有大鼠均接受标准化食物喂养，实验期间保证充足的水和食物，且饮水进食均自由。用于实验的大鼠牙列完整，均无明显口颌系统及全身性疾病。实验者在实验操作及动物处置过程中均承诺不虐待大鼠，动作操作轻柔。实验涉及动物研究的所有程序均符合“实验室动物护理和使用的道德标准”，并经佳木斯大学附属口腔医院医学伦理委员会批准，批准号：JMSU-KQ-2021-010，批准时间：2021年10月。
1.4 实验方法

1.4.1 实验动物及分组将大鼠30只随机分为3组，每组10只，传统模型组(用牛通乳针制作固定大小的UAC金属管，用磷酸锌水门汀将金属管粘接固定于大鼠的左侧上颌切牙和下颌切牙上)、数字化模型组(用数字技术根据大鼠牙齿的位置和结构设计没有固定尺寸的个性化UAC金属管，用磷酸锌水门汀将金属管粘接固定于大鼠的左侧上颌切牙和下颌切牙上)、对照组。对照组大鼠采用与模型组中相同的操作过程进行模拟手术，但不涉及金属管的永久粘接。

1.4.2 颞下颌关节骨关节炎大鼠模型的构建在数字化模型组中，使用3D激光数字扫描设备采集牙列咬合关系、黏膜等数字化信息，见图1A，B，并将数据导入inLab SW 19.0软件 (Dentsply Sirona，Sirona Dental Systems GmbH) 中进行金属管的设计，上颌金属管按照左侧上颌切牙形态设计相应长度及宽度的短管，下颌金属管按照左侧下颌切牙形态，在覆盖下颌切牙的同时在金属直管末端弯至形成135°唇向倾斜的短斜面，作为咬合导板。金属管的牙龈边缘延伸至牙龈，保证切端面与邻牙牙合面一致，以造成左侧上下颌切牙形成反咬合关系，至此完成了金属管的CAD模型设计。下一步将设计得到的CAD数据导入到 AuotFab MLab软件(Materialise，Belgium)中设计加支撑结构及切片导出，见图1C，D。最后将生成的STL格式文件导入Concept Laser Mlab金属3D打印机中进行排版，对TC4粉末进行逐层激光烧结3D打印增材制造出个性化钛金属管，见图1E，F。3D打印激光烧结完成的个性化钛金属管如图 1G所示。

在传统模型组中，采用牛通乳针制作，将直径为2.5 mm的针头统一切割为长度2.5 mm的直管作为上颌金属管；将直径为2 mm的针头统一切割为长度8 mm的直管，在4.5 mm处弯至135°并压平，形成一端为4.5 mm的直管另一端为3.5 mm的平面，将平面作为咬合导板。

金属管制作完成后，利用磷酸锌粘接固定于大鼠左侧上下切牙表面，见图2。每只大鼠的操作时间均不超过5 min，张口度不超过1.5 cm。粘接后，将大鼠单独置于箱中密切观察。在实验期间每天检查粘接及就位情况，确保金属管无脱落。在同等条件下喂养，于每周固定时间称量3组大鼠的体质量并记录直至实验结束。

1.4.3 组织标本的处理在UAC干预后的第4，8周给予过量戊巴比妥纳处死大鼠(每组每个时间点5只大鼠)，并迅速取出其双侧颞下颌关节。颞下颌关节是双侧联动关节，在实验大鼠中左侧和右侧样本间组织形态学或分子性质无显著差异[15]。因此，随机选取髁突软骨进行体式显微镜观察，并采用ELISA检测炎症因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α的表达。取样包括关节囊及其周围 3.0-4.0 mm的组织块进行苏木精-伊红染色、番红O/固绿染色及免疫组织化学染色。
1.4.4 体式显微镜观察将大鼠髁突头从颞下颌关节关节囊中脱出，剥离周围软组织，用冠剪从其髁突颈部剪下髁突头后立即浸泡到生理盐水中，随后用体式显微镜对髁突进行大体观察及拍照。然后参照国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分对髁突表面的形态进行评分[16]，0分为髁突表面光滑，无明显发红；1分为髁突表面光滑，但有较明显发红；2分为髁突表面出现微小形变；3分为髁突表面出现局部凹陷；4分为髁突表面出现明显形变。
1.4.5 病理染色将大鼠颞下颌关节无菌解剖后，于40 g/L多聚甲醛中4 ℃固定 24 h，体积分数10%中性EDTA脱钙液常温脱钙6-8周，每2 d更换1次脱钙液。然后梯度乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。随后对每个包埋的蜡块中心部分进行5 μm 厚的矢向连续切片。随机选取切片进行染色，用苏木精-伊红染色来评价髁突组织学改变，番红O/固绿染色来评价软骨基质的丧失情况。根据Mankin评分和OARSI评分评估颞下颌关节关节软骨损伤程度[16-17]。Mankin评分：0分为结构正常，细胞正常；1分为表层软骨破坏，细胞过多紊乱；2分为血管翳及表层破坏，细胞成簇；3分为浅层裂隙形成达移行层，细胞少；4分为裂隙局限性深达骨质辐射层；5分为深达骨质钙化层。OARSI评分：0分为软骨面完整，形态正常，基质结构正常，细胞光滑，正常朝向；1分为软骨面完整，基质软骨浅层完整，或水肿或浅层纤维化、浅层基质固缩；2分为软骨面不连续；3分为软骨呈垂直裂隙状；4分为软骨侵蚀现象加重。
1.4.6 ELISA检测炎性因子采用ELISA试剂盒(Multisciences，杭州)检测建模后8周颞下颌关节骨关节炎大鼠髁突软骨炎症因子白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。研磨组织取上清，向标准孔中加入标准品100 μL，空白孔加标准品稀释液100 μL，剩余孔加待测样品100 μL，每孔加入50 μL检测抗体，室温孵育2 h，弃去液体，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，室温孵育 45 min，弃去液体，加显色底物100 μL，室温孵育30 min，每孔加终止液 100 μL，终止反应。酶标仪检测450 nm处吸光度值。计算标准品和样本的平均吸光度值，然后减去零浓度标准品的吸光度值。通过标准品浓度和吸光度值，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。通过吸光度值与标准曲线确定最终白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α浓度。
1.4.7 免疫组织化学染色将组织标本在脱蜡后的山羊血清中孵育30 min，然后与以下兔多克隆抗体4 ℃单独孵育过夜，抗体包括基质金属蛋白酶13抗体 (1∶200；GB11247；Servicebio公司)、蛋白多糖抗体(1∶500；GB11373；Servicebio公司)和Ⅱ型胶原抗体 (1∶200；GB11021；Servicebio公司)，冲洗后，切片用生物素标记山羊抗兔免疫球蛋白 IgG(碧云天生物技术有限公司，上海)孵育30 min，然后在DAB 显色1.0-2.0 min，苏木精染色15 s，盐酸乙醇分化1 s，常规脱水及透明，染色结果在显微镜下通过图像捕获进行分析。在软骨区域选取3个区域，取3个区域内软骨细胞阳性百分率或阳性面积为一个样本进行统计分析(n=3)，使用Image J软件(美国)进行量化，对比各组蛋白多糖、Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13的表达水平差异。
1.5 主要观察指标建模时间；各组大鼠体质量变化；髁突软骨表观形态、髁突软骨病理变化；白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、蛋白多糖、Ⅱ型胶原和基质金属蛋白酶13的表达。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 9.0 软件进行数据分析。所有数据在统计分析前均进行正态分布检验，使用Shapiro-Wilk test数据属于正态分布。符合正态分布的数据用均数和标准误表示(Mean±SEM)。通过双因素方差分析对各组不同时间点进行多重比较，组间两两的比较则通过 LSD-t 检验。P < 0.05 被认为差异有显著性意义。实验中的统计学方法已通过佳木斯大学附属口腔医院统计学专家审核。

讨论

实验比较了传统模型组和数字化模型组在UAC干预下颞下颌关节的变化，2个模型组均出现软骨厚度和细胞数量减少等不同程度的退行性病变。数字化模型组髁突软骨的表观形态及病理学改变比传统模型组明显，炎性因子表达增多，提示在建模后8周内，数字化模型组可以更快地诱导疾病的发生。两个模型组蛋白多糖、Ⅱ型胶原表达的细胞也有所减少，基质金属蛋白酶13表达增强。观察到 UAC诱导的颞下颌关节骨关节炎样病变，这与之前的报道相吻合[18]。目前的数据表明，通过组织形态学和相关分子表达水平的变化评估，数字化技术变化方面的效果优于传统自由手制作的效果。
相关研究已证明大鼠上、下切牙高度弯曲，上切牙唇面轮廓线恰好与一段圆弧相拟合，下切牙对应的圆弧半径更大，弧长更长[19]。然而，传统模型组采用成品牛通乳针，通过自由手制作相同尺寸的金属管，由于大鼠切牙高度弯曲，在粘接之前，需要反复调改金属管，且无法确保制作要求的相同角度，制作相同尺寸的金属管精准度和密合度均不高。而数字化模型组通过扫描可获得更加精准的口腔内软组织与牙列形态，扫描时间短，计算机设计135°唇向倾斜的短斜面，可重复性好，制作出的金属管更加符合大鼠牙齿的形态，能保证每个金属管角度相同，实验过程中只需直接粘接即可，具有较高的固定性和边缘适应性，但需要对材料表面进行处理从而达到成品材料的光滑度。因此，规范并简化数字化工作流程、减少可能出现误差的环节、提高模型精确性，是未来数字化颞下颌关节的发展方向。
目前研究颞下颌关节骨关节炎建模方法有很多，分为动物自发及人工诱发。人工诱发主要包括外科手术[20-21]、关节腔药物注射[22]、机械负荷[23]、睡眠剥夺[24-25]、高脂饮食[26]、基因工程[27]、影响激素水平[28]、模拟咬合异常等[29-30]。然而，这些方法有一些缺点，即进展缓慢、造模时间长、成本高，间接增加了实验的干扰因素，与颞下颌关节骨关节炎的发病机制没有十分明确的关联性，并不能模拟人类的自然发病过程。咬合异常在于无关节损伤、方法简单、成功率高，以一种更加接近自然的方式通过颞下颌关节传递诱导疾病的发生，可有效模拟临床患者咬合不平衡的发病因素。诱导咬合异常是一种在颞下颌关节中诱发骨关节炎样病变的独特方式。近年来，UAC诱导的动物模型被认为是最接近模拟人类颞下颌关节骨关节炎发病机制的模型之一。很多研究已证明，UAC可导致颞下颌关节软骨出现严重骨关节炎样病变，并且严重程度随着年龄的增长而增加，符合人类疾病的发生发展过程，可以用来模拟颞下颌关节骨关节炎的病理过程，建立颞下颌关节骨关节炎动物模型，有大量的研究也应用了这种模型[31]。据作者所知，这是第一个将数字化技术应用于颞下颌关节骨关节炎动物模型领域。
造成颞下颌关节骨关节炎的咬合因素众多。在建立异常咬合动物模型时，包括前牙区及后牙区，由于开口有限，在非直视下进行后牙区手术具有挑战性，并且难以保证在有限的张口度下进行操作；前牙区在口腔前庭进行，对颞下颌关节创伤小。课题组在实验中利用数字化技术将电脑设计的精密金属管转化为实体金属管，以满足个性化定制需求，更大程度地保持大鼠牙齿的结构和功能。相较于传统制作，这种方法保证了更加个性化的设计方案，样本的均质性及精确性得到更好的保证，同时与传统的制备方法相比，制作流程简易，更加直观，具有可预期性。
实验仍有一些局限性：研究单一不良咬合因素对髁突的影响，仅选用雌性大鼠作为实验对象，没有排除雌激素水平对髁突退变的影响；主要呈现颞下颌关节骨关节炎大鼠年轻动物早期(< 8 周)的病理特征；此外，研究的持续时间很短；颞下颌关节骨关节炎是多种因素共同作用的结果，病理变化是许多细胞因子和趋化因子协同作用的结果[32]，过于强调了一方面的致病因素，而咬合异常仅是颞下颌关节疾病发生的生物学原因之一，只评估这一个潜在的机制对于探讨该病的病因学是不利的，并且目前的研究不等同于人类的前牙反牙合。尽管如此，该技术的应用为研究因咬合关系致口颌系统疾患的发病机制及其防治措施提供实验依据，更好预防咬合源性颞下颌关节问题的发生。
综上所述，传统技术与数字化技术两种方法均可以建立颞下颌关节骨关节炎动物模型，而采用3D打印技术设计制作的个性化金属管，无需反复试戴调整即能快速引导颞下颌关节发生骨关节炎样病变，可重复性好，适合推广应用。然而，需要使用年龄更大的动物和更长的观察期进行更多的研究来证实这项研究的结果。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

数字化技术构建SD大鼠颞下颌关节骨关节炎动物模型

Constructing an animal model of temporomandibular joint osteoarthritis in Sprague-Dawley rats by digital technology

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[2]	齐浩东, 鲁超, 徐韩博, 王孟飞, 郝阳泉. 糖尿病对初次全膝关节置换围术期失血量和疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1383-1387.
[3]	王梦晗, 齐涵, 张元, 陈言智. 3种3D打印模型辅助治疗Robinson ⅡB2型锁骨骨折[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1403-1408.
[4]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[5]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[6]	李蕊, 张桂红, 王涛, 樊萍. 人参多糖干预创伤性骨关节炎模型大鼠前列腺素E2/6-酮-前列腺素F1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1235-1240.
[7]	宁天亮, 王坤, 王领彪, 韩鹏飞. 基于三点力原理对足内翻矫形器矫正效果的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 891-899.
[8]	张之栋, 祁家龙, 裴少保, 马力, 王善松, 刘艺明. 3D打印导板技术联合多次去旋转治疗重度僵硬性脊柱侧凸[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 922-926.
[9]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[10]	胡智星, 李群, 杨超, 王潇潇, 方罗昌婷, 侯吴琼, 林娜, 陈卫衡, 刘春芳, 林雅. 不同因素影响激素性股骨头坏死家兔模型成模效果的网状Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 976-984.
[11]	代慧娟, 王钊鑫, 白布加甫·叶力思, 孙江伟, 古丽再努·依不拉音, 尼加提·吐尔逊. 三种咬合关系中树脂陶瓷冠和二氧化锆全瓷冠种植修复的生物力学差异[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 657-663.
[12]	沈子青, 夏天, 单一波, 朱睿君, 万昊鑫, 丁浩, 潘枢, 赵军. 负载外泌体水凝胶修饰3D打印支架构建血管化的气道替代物[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(5): 697-705.
[13]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[14]	买斯吐热木·黑力力, 张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔注射医用臭氧对早期颞下颌骨关节炎模型大鼠髁突组织学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 505-509.
[15]	刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.