静态拉伸对大鼠椎间盘髓核和纤维环的影响

doi:10.12307/2023.995

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

髓核含水量：未发生退变的椎间盘中，髓核由蛋白多糖、Ⅱ型胶原和水分有机结合在一起，在MRI T2加权像上表现为高信号，文中以此表示髓核含水量的多少，而髓核的结构因为生理或应力等原因破坏后，其蛋白多糖及Ⅱ型胶原的结构会发生改变，进而影响髓核结合水的能力，其含水量下降。
基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制剂：基质金属蛋白酶作用是降解细胞外基质，在退变椎间盘中，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13是升高的，基质金属蛋白酶3主要是降解非胶原基质蛋白包括蛋白多糖等，基质金属蛋白酶13主要是降解胶原基质蛋白如Ⅰ型胶原等，而基质金属蛋白酶抑制剂与基质金属蛋白酶相互拮抗，文中所用的基质金属蛋白酶抑制剂1就是针对基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的拮抗基因。

背景：牵引在临床上用于椎间盘退变早期的治疗，但其对正常椎间盘的影响仍未可知，是直接造成椎间盘退变还是正向作用即是此次实验的观察要点。

目的：建立大鼠尾椎椎间盘静态拉伸模型，观察静态拉伸对椎间盘髓核和纤维环的影响。
方法：选用20只3月龄SD大鼠，采用外固定装置静态拉伸大鼠尾椎7/8、8/9、9/10椎间隙1 mm，6/7、10/11椎间盘作为对照；拉伸2，4，6，8周随机抽取5只大鼠进行尾椎椎间盘MRI T2加权扫描、组织切片染色、合成分解代谢RT-PCR基因检测，观察静态拉伸对椎间盘髓核和纤维环的影响。

结果与结论：①大鼠尾椎椎间盘经过短期静态拉伸后，椎间盘髓核区的T2加权像信号增强；②整个拉伸期间，髓核区域髓核细胞生长状态良好，细胞间基质含量丰富，纤维环排布整齐；③RT-PCR结果显示，拉伸之后蛋白多糖基因表达升高，基质金属蛋白酶3表达降低，Ⅰ、Ⅱ型胶原基因表达降低，基质金属蛋白酶13表达升高，基质金属蛋白酶抑制剂1表达升高，这些基因结果也进一步表明拉伸使得蛋白多糖更趋向合成代谢状态，Ⅰ、Ⅱ型胶原更趋向于分解代谢状态；④结果提示静态拉伸有助于促进髓核区域蛋白多糖的合成代谢，使得水分得以维持。

https://orcid.org/0000-0001-7559-0613(莫骏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 静态拉伸, 髓核, 纤维环, T2高信号, 蛋白多糖

Abstract: BACKGROUND: Traction is clinically used for the early treatment of intervertebral disc degeneration, but its effect on the normal intervertebral disc remains unknown. Whether it directly causes intervertebral disc degeneration or has a positive effect is the key point of this study.
OBJECTIVE: To design a static traction model and observe the effect of static traction on the nucleus pulposus and annulus fibrosus of the intervertebral disc
METHODS: Twenty Sprague-Dawley rats, 3 months of age, were included in the study. The intervertebral disc spaces between 7/8, 8/9 and 9/10 were stretched by 1 mm, and the intervertebral disc spaces between 6/7 and 10/11 were used as control. Five rats were randomly selected at 2, 4, 6, and 8 weeks of traction to perform MRI T2-weighted scans of the caudal vertebra, tissue section staining, and RT-PCR gene assays for anabolic metabolism to observe the effects of static traction on the nucleus pulposus and annulus fibrosus of the intervertebral disc.
RESULTS AND CONCLUSION: After short-term static traction of the rat caudal vertebra, the T2-weighted image signal in the nucleus pulposus region was enhanced. During the traction period, nucleus pulposus cells grew well, the intercellular matrix was abundant, and the annulus fibrosus arranged regularly. The RT-PCR results showed that after traction, the mRNA expression of proteoglycan increased, the expression of matrix metalloproteinase-3 decreased, the expression of type I and II collagen decreased, and the expression of matrix metalloproteinase-13 increased and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1 increased. These gene results also indicated that traction made proteoglycan more inclined to an anabolic state, and type I and II collagen more inclined to a catabolic state. To conclude, static traction promotes proteoglycan anabolism making the nucleus pulposus moist.

Key words: static traction, nucleus pulposus, annulus fibrosus, T2 high signal, proteoglycan

中图分类号:

莫骏, 罗宗平. 静态拉伸对大鼠椎间盘髓核和纤维环的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1180-1185.

Mo Jun, Luo Zongping. Effects of static traction on the nucleus pulposus and annulus fibrosus of the rat intervertebral disc[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(8): 1180-1185.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验总共纳入20只大鼠，分为4组，全部进入结果分析。整个实验过程未发生动物脱失。
2.2 被静态拉伸的椎间盘其髓核信号增高通过直接观察不同拉伸时间点髓核区的T2加权像结果可知，被拉伸的椎间盘髓核区信号未发生明显降低甚至消失。将这些信号转换为灰度值进一步分析后可见，髓核区域T2加权像信号随拉伸时间有增加的趋势，且随着时间的延长这种趋势越来越明显见图4。

2.3 各时间点静态拉伸的椎间盘结构从开始静态拉伸到拉伸8周为止，髓核区域髓核细胞生长状态良好，细胞间基质含量丰富，纤维环排布整齐，椎间盘的结构完整，无被破坏的表现，且组织内无水肿及炎症反应样改变，见图5。

2.4 基因检测结果基因检测显示，静态拉伸使得椎间盘中蛋白多糖的表达增加。与未被静态拉伸的椎间盘相比，拉伸2周时，Ⅰ型胶原和MMP-3表达下降(P < 0.001)，Ⅱ型胶原和TIMP-1表达上升(P < 0.001)，蛋白多糖和MMP-13略有下降但差异无显著性学意义；拉伸4周时，Ⅰ型胶原和MMP-3表达下降(P < 0.001)，TIMP-1、Ⅱ型胶原表达下降(P < 0.001)，MMP-13、蛋白多糖表达上升(P < 0.001)；拉伸6周时，Ⅰ型胶原和MMP-3表达下降(P < 0.001)，Ⅱ型胶原和TIMP-1表达下降(P < 0.001)，蛋白多糖和MMP-13表达上升(P < 0.001)；拉伸8周时，Ⅰ型胶原和MMP-3表达下降(P < 0.001)，Ⅱ型胶原和TIMP-1表达下降(P < 0.001)，蛋白多糖和MMP-13表达上升(P < 0.001)(图6)。总结上面的结果可知，短期拉伸之后，蛋白多糖基因表达升高，MMP-3表达降低，Ⅰ、Ⅱ型胶原基因表达降低，MMP-13、TIMP-1表达升高，这些基因结果也进一步表明拉伸使得蛋白多糖更趋向合成代谢状态，Ⅰ、Ⅱ型胶原更趋向于分解代谢状态。

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引言

材料方法

1.1 设计随机抽样动物实验，采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2016年8月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 20只3月龄雄性SD大鼠，体质量约500 g，由苏州大学实验动物中心提供，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，许可证号SCXK(苏)2013-0003。
实验方案经苏州大学动物实验伦理委员会批准，批准号：ECSU-201700035。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 试剂及仪器石蜡、中性树胶、烤片机、摊片机、组织切片机、冷冻台、组织包埋机由德国Leica公司提供；倒置相差显微镜及成像系统由Olympus公司提供；反转录扩增仪由Ambion life technologies公司提供；PCR扩增仪、SYBR-green由Bio-Rad公司提供；番红O固绿染液、氯仿、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、乙醇、氯仿、异丙醇由美国Sigma公司提供；反转录试剂盒由Thermo公司提供；乙二胺四乙酸二钠由美国Biosharp公司提供；体积分数30%过氧化氢、无水甲醇、无水乙醇、氢氧化钠由国药集团化学试剂有限公司提供；氨水、乙酸、二甲苯由凌峰化学试剂有限公司提供。
1.4 方法

1.4.1 尾椎拉伸模型的建立选取3月龄雄性大鼠20只，以大鼠尾椎的第7椎体中点为起点，每隔12 mm打入直径1.2 mm、长度40 mm的克氏针，共打入4枚，两侧的针头对称且保持平齐。在总长度为50 mm的铝板上每隔13 mm钻直径为1.2 mm的4个孔，成对的铝板固定在大鼠尾巴两侧。大鼠按随机编号法随机分为4组，每组5只，分别被静态拉伸2，4，6，8周(图1)。

1.4.2 X射线片和MRI 在拉伸2，4，6，8周时，分别对大鼠摄取尾椎X射线片，拆除外支架后给予1.5T MRI扫描。MRI成像为T2加权冠状图像，基本参数：饱和时间为3 000 ms，回声时间为80 ms，视野200 mm×200 mm，单层厚度为1.4 mm(图2)。所得的MRI图像髓核区T2加权像结果用photoshop 6.0分析：打开图片，将图像放大10倍，调整为1 000%。调出包含目的椎间盘的视野，按“F8”，打开直方图面板，该面板上可把选定区域所有像素的灰度平均值、标准差、像素数等直接显示出来。使用套索工具将髓核高信号区选出来：标准可自拟如根据局部像素点的值等，这里以紧贴髓核的暗区线为界圈地，该法方便快捷，而且结果可靠。最后读出数据并记录(图3)。

1.4.3 组织切片及染色在各个时间点大鼠过量注射戊巴比妥安乐死，尾椎椎间盘取下后放入体积分数4%的甲醛固定36 h。标本在EDTA(EDTA 200 g，PBS 2 000 mL，NaOH 22 g)中脱钙6周。将标本放入包埋盒，依次经过体积分数70%，80%，90%的梯度乙醇各1 h，再经正丁醇透明3 h。将包埋盒放入两道石蜡各3 h，并用纯蜡包埋冷却后，用切片机按5 μm厚度切片，依次展片、捞片和烤片。烤干的切片二甲苯15 min×2次，梯度乙醇脱去二甲苯，洗过后进行苏木精-伊红染色、Mallory染色和番红O固绿染色[14-15]，中性树脂封固[16]。

1.4.4 RT-PCR 从未被拉伸的椎间盘内随机抽取4个作为对照，其余4个实验组每组中均随机抽取4个椎间盘。标本剪碎成1 mm3大小，用2 mg/mL的Ⅱ型胶原酶和Ⅰ型胶原酶按1∶1的比例混合消化过夜。收集到的细胞悬液各加入1 mL Trizol，室温放置5 min，使其充分裂解。1 mL Trizol加入200 μL氯仿，震荡混匀后室温放置15 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min，吸取上层水相约400 μL至另一离心管中。1 mL Trizol加入0.5 mL异丙醇混匀，室温放置8 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min，弃上清，RNA沉于管底。1 mL Trizol加入1 mL体积分数75%的乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀。4 ℃，8 000×g离心5 min，尽量弃上清。室温晾干，倒置放在EP手套上。用去RNA酶的水20 μL溶解样品，58 ℃金属浴8 min。用吸光度(A)测量RNA浓度，取2 μL RNA溶液稀释到20 μL，用酶标仪测量260，280 nm波长的峰值，A260 nm/A280 nm值在1.6-2.1之间。RNA浓度=A值×2 μg/μL。取2 μg的RNA用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，Lithuania)进行反转录。最后以10 μL SYBR-green、0.5 μL的前置引物、0.5 μL的后置引物、1 μL的cDNA、8 μL的水体系进行荧光定量，获得循环数CT值。各拉伸椎间盘相对于正常椎间盘的表达量用2-ΔΔCt进行比较(表1)[17-18]。

1.5 主要观察指标 ①模型建立成功的X射线片；②拉伸2，4，6和8周时MRI T2加权像影像学结果及趋势图；③拉伸2，4，6和8周时椎间盘、髓核和纤维环的苏木精-伊红染色、Mallory染色和番红O固绿染色结果；④拉伸2，4，6和8周时椎间盘组织的Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、蛋白多糖、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP-3)、MMP-13和基质金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，TIMP-1)的RT-PCR结果。
1.6 统计学分析 RT-PCR结果使用SPSS 19.0软件进行统计分析，采用t检验。文章统计学方法已经苏州大学统计学专家审核。

讨论

椎间盘退变是下腰痛主要的病理生理过程，也是椎间盘突出的前提，其在MRI T2加权像上主要表现为髓核区域信号变暗。到目前为止，临床上仍然没有有效的治疗手段来逆转椎间盘的这种信号改变。功能锻炼或者说力学刺激在某种程度上可以延缓椎间盘的退变，改善腰痛患者的生活质量[22]。临床将牵引疗法作为椎间盘退变早期的治疗手段之一[23-24]，动物实验表明牵引可以恢复塌陷的椎间隙高度[25]，但是拉伸对正常椎间盘的影响存在分歧。CHANG等[26]的研究表明过度拉伸会引起纤维环的炎症反应及破坏，某些糖蛋白表达会升高。TERAHATA等[27]认为拉伸会降低椎间盘中的水合成分，增加固体成分体积和组织渗透压力，抑制蛋白多糖的合成。如果能证明适度甚至略大的拉伸，对正常椎间盘不会发生过大的破坏，甚至在某些方面会产生正面的影响，那这个结果将可以进一步指导牵引在椎间盘退变疾病中的运用。
目前，已经有学者设计了一些大鼠尾椎椎间盘的体外拉伸模型来观察拉伸对退变椎间盘的影响。其模型主要有3种：①LAI等[28]设计的外支架模型；②HAN等[29]使用的大鼠尾椎椎间盘的悬吊模型；③由苏州大学附属第一医院骨科研究所设计的外支架拉伸模型[25]。HAN等[29]的体外实验结果表明低幅的拉伸不会使椎间盘炎症因子白细胞介素17表达水平升高，对椎间盘的结构影响不大。HUTTON等[30]认为，悬吊模型只能模拟微重力对椎间盘的影响，作为拉伸模型并不典型，在悬吊条件下，椎间盘细胞的合成代谢下降，撤除悬吊后，椎间盘的代谢恢复到了正常水平。LAI等[28]于2010年设计的大鼠尾椎椎间盘的外支架拉伸模型比较经典，该模型通过调整两块铝板之间的距离，调整椎间盘的拉伸幅度，动态和静态拉力都有助于恢复压力导致的椎间盘压缩，但是由于压力造成的椎间盘退变较严重，拉力作用并没有使压力导致的椎间盘退变有所改善，且该实验没有单独观察拉伸对椎间盘的影响。作者所在实验室设计的新的体外模型表明，拉伸确实可以修复退变的椎间盘[25]，同时还将该模型运用于原位固定[31-32]、压缩-拉伸模型[33-34]、弯曲压缩模型[35]。
此次实验的目的是利用自己设计的模型观察静态拉伸对正常椎间盘的影响。通过图2的标尺可知，正常大鼠椎间隙的高度约为1 mm，为了达到有效的甚至略大、可观测的拉伸幅度，同时考虑到铝板孔径1.2 mm、鼠尾椎置入克氏针的距离为12 mm等因素导致的系统误差，作者使用了拉伸幅度为椎间隙高度一倍的1 mm。而且在实际实验中，作者发现过小的拉伸幅度下，克氏针易滑出。此次实验之所以不选择1.5 mm甚至更大的拉伸幅度，是因为在更高拉伸幅度的情况下，大于1 mm拉伸幅度时鼠尾韧带由于拉伸也会开始产生张力，且拉伸幅度越大，韧带产生的张力越大，会部分抵消支具给予椎间盘的牵引力[25，36-37]。在对鼠尾椎间盘进行核磁共振扫描时，大鼠必须处于深度麻醉状态下，其尾巴放置于同一水平面呈直线状态。即使在这种体位下，作者仍只能在唯一的一个平面同时扫到所有的椎间盘，这也使获得的图像更准确客观。在整个拉伸周期过程中，作者观察到所有被拉伸大鼠的7/8、8/9、9/10髓核区始终为高信号，这更确定了拉伸对椎间盘破坏有限甚至有某些益处的猜测。因此，作者试图通过RT-PCR的检测手段找到其中蕴藏的分子机制。此次实验在进行基因检测时，未将纤维环和髓核通过手工方式进行分开，因为手工法会导致纤维环及髓核分离不彻底，这会使得检测结果不准确。检测的基因是椎间盘结构的主要成分基因及相关代谢基因，包括Ⅰ、Ⅱ型胶原、蛋白多糖、MMP-3、MMP-13、TIMP-1。Ⅰ型胶原可以反映纤维环中的代谢情况；Ⅱ型胶原和蛋白多糖主要反映髓核的代谢情况；Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的蛋白酶主要为MMP-13
和MMP-3，其中MMP-3主要反映非胶原基质蛋白的分解代谢情况如蛋白多糖，而MMP-13主要反映胶原基质蛋白的分解代谢情况如胶原蛋白，这2种基质金属蛋白酶最后又与TIMP-1相互拮抗[38-39]。基因检测结果表明拉伸使得Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原的表达均下调，这说明静态拉伸致使髓核及纤维环中的胶原蛋白以分解代谢为主。组织染色结果显示，静态拉伸后的所有时间点的髓核及纤维环结构基本完整，细胞与基质分布均匀，未见炎症细胞浸润，局部也无水肿发生，可见静态拉伸虽然在基因水平对椎间盘中的胶原产生了促分解的作用，但并未对椎间盘的组织结构产生明显的破坏，其纤维环及髓核仍有序排布。
与髓核在T2加权像上信号增高相伴的是静态拉伸促进了蛋白多糖的表达。拉伸使得7/8、8/9、9/10椎间盘的髓核区在T2加权像上的信号呈现出逐渐上升的趋势，而蛋白多糖的基因表达也表现为升高，两者的走行虽然不完全一致，但趋势都呈现上升性；同时蛋白多糖的分解代谢基因MMP-3下降，这也反映出蛋白多糖此时合成确实大于分解。此次实验未从蛋白水平对蛋白多糖等基因进行检测，主要考虑到两方面的原因，首先要检测蛋白水平有2种方法，其一就是提取活性细胞，将这些细胞经培养后测定细胞蛋白多糖的表达量；其二就是将椎间盘组织整体裂解，然后测定组织中所有蛋白多糖的含量，但这两种方法都需要使用裂解酶例如Ⅱ型胶原、胰蛋白酶等[2，4，40]，这必然会影响后期蛋白水平的定量结果，因而此次实验并没有在蛋白水平进行定量分析。
综上结果可知，静态拉伸引起了大鼠椎间盘髓核在T2加权像上信号增高，表明局部水分增多，同时由于蛋白多糖的表达升高，作者推测这种改变是由于静态拉伸促进了蛋白多糖的合成造成的。拉伸期间髓核区髓核细胞生长状态良好，细胞外基质丰富。在每个时间点进行MRI检查的大鼠在检查完成后仍可用于取材，每组5只大鼠，实际每个时间点可获得15个拉伸的椎间盘，这个数量足够用于组织切片染色、基因检测并满足统计学所需。而实际操作中，仅随机处死并留取了每组4只大鼠的标本，每组可获得12个拉伸椎间盘；到8周标本采集结束时，仍有4只大鼠是存活的。经过观察，这4只留存大鼠的尾椎椎间盘在拉伸10周甚至更长时间后，其髓核T2加权像结果仍表现为高信号，这也说明此牵引力即使作用更长时间也并未对其椎间盘产生更大的破坏，但由于缺少组织学和基因学证据，这里不再论述。后续实验将观察更长时间拉伸对椎间盘的影响。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程