2.1   标本数量分析   所有23个髌腱标本均完成实验。在应力松弛实验过程中，PBS对照组有2个标本发生轻微抖动，为了保持一致性，PBS对照组和弹性蛋白酶处理组(弹性蛋白酶组)各选择8个应力松弛实验数据进行应力-时间分析。
2.2   两组基线资料比较   两组猪髌腱的宽、厚、横截面积差异均无显著性意义，具有可比性，见表1。



2.3   髌腱弹性蛋白含量检测结果    处理后，髌腱中残留的弹性蛋白含量与弹性蛋白酶的浓度成反比，见图2A，随着酶浓度的增加，弹性蛋白含量表示一致的相对下降趋势。对于不同的处理时间，随着时间的增加，弹性蛋白含量也显示一致的下降趋势，但在4-6 h后基本趋于平稳，见图2B。用于测试的2个髌腱具有不同的总弹性蛋白含量，因此用于评估不同浓度及不同时间的弹性蛋白含量会有略微差异。由于弹性蛋白酶的成本高，且弹性蛋白酶浓度在5 U/mL时的含量最低，酶浓度从5-20 U/mL增加时，弹性蛋白含量波动幅度不大，统计学分析没有显著性意义，因此选择5 U/mL弹性蛋白酶孵育8 h作为弹性蛋白酶处理方案。



2.4   组织学染色观察结果   组织学染色分析弹性蛋白酶对髌腱中弹性蛋白纤维和胶原蛋白纤维的影响。VVG染色将弹性蛋白纤维染成深黑色，将胶原纤维染成红色，与PBS处理组相比，弹性蛋白酶处理的组织清楚显示弹性蛋白降解效果，见图3A，B。Masson染色将胶原蛋白纤维染成蓝色，显示弹性蛋白酶处理前后的胶原纤维方向不受酶处理的影响，显示了弹性蛋白沿着胶原纤维分布，胶原纤维呈波浪状，卷曲清晰可见，见图3C，D。在弹性蛋白酶处理之前，组织中的胶原纤维和弹性纤维排列整齐紧凑；弹性蛋白酶处理后，组织变得疏松，弹性蛋白在组织中零碎存在，胶原纤维波浪状的卷曲度减少。除此之外，还可见弹性蛋白酶从外表面开始向内降解弹性蛋白。



2.5   弹性蛋白对力学性能的影响   
2.5.1   两组髌腱处理前后拉伸柯西应力变化结果   PBS组和弹性蛋白酶组都显示了处理前的柯西应力要比处理后的大，差异有显著性意义，两组应力降低百分比约40%(PBS对照组P=0.000 3，见图4A；弹性蛋白酶组P=0.001 3，见图4B)。但是PBS处理前后的柯西应力差值与弹性蛋白酶处理前后柯西应力差值比较，差异无显著性意义(P=0.595)。




2.5.2   两组髌腱处理前后应力松弛   图5显示了PBS对照组和弹性蛋白酶组处理前后的峰值应力、平衡应力、松弛百分比。PBS对照组处理后的峰值应力和平衡应力比处理前的小，峰值应力降低约37%，平衡应力降低约43%，差异有显著性意义(P=0.001，P < 0.000 1)，应力下降幅度差异无显著性意义(P=0.241)，见图5A。弹性蛋白酶组处理后的峰值应力和平衡应力比处理前的小，峰值应力降低约41%，平衡应力降低约61%，差异有显著性意义(P < 0.000 1)，应力下降幅度增加约12%，差异有显著性意义(P=0.007)，见图5B。两组应力随时间的变化趋势显示，与处理前相比，组织经过处理后表现出明显下降趋势，应力值差异有显著性意义(P值均< 0.000 1)，见图6A，B。通过对相应组内所有样品的归一化应力取平均值绘制平均归一化应力-时间曲线，见图6C，显示了弹性蛋白酶组比PBS对照组引起的应力降低值更大(P < 0.000 1)。

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髌腱病变是一种常见的过度使用损伤，在篮球和排球等跳跃运动中最常见，数据显示，在优秀篮球运动员中患病率高达32%，在高水平排球运动员中患病率高达50%[1-3]。力学载荷是肌腱病免疫病理学中一个明确的因素，随着力学荷载的增加，髌腱的生物力学特性(包括材料和结构)都发生了显著变化，因此越来越多的研究开始从生物力学的角度去分析髌腱的材料特性，将此作为一个指标用来监测髌腱病变的风险[4-7]。

髌腱将髌骨连接到胫骨转子，是膝关节部分重要的组成成分，在稳定和控制膝关节运动方面起到重要作用[8]。髌腱的结构-功能特征在病理条件下会受到影响，但髌腱病变的发病机制尚不完全了解，研究表明与组织结构变化有关[9-10]。膝关节韧带、肌腱的整体健康在很大程度上取决于它们的化学成分和结构[11]，所以为了理解髌腱结构-功能关系，并解释疾病或损伤导致的细胞外基质组成部分和力学反应的改变，就必须先确定它们对正常组织力学的贡献。

肌腱是一种结缔组织，主要由水、Ⅰ型胶原蛋白(占组织干质量70%-80%)、弹性蛋白(占组织干质量1%-2%)、蛋白多糖和成纤维细胞等组成[12]。现有研究使用特异性酶降解方法结合生物力学测试来评估不同组织中弹性蛋白纤维在力学中的作用[13-16]，例如HENNINGER等[17]发现弹性蛋白主要在应力-应变曲线的趾部区域发挥作用，但在线性区域提供负荷支撑。弹性蛋白是成熟弹性纤维的主要成分(约占90%)，它赋予了组织弹性[18]。弹性蛋白纤维存储的弹性能量能使组织免受伤害[19]，这与髌腱等柔性结构特别相关。胶原纤维是髌腱中含量最丰富和最重要的成分，它的力学响应已被广泛研究[20-23]，但是弹性蛋白如何在准静态拉伸下对正常髌腱力学行为产生影响尚不完全清楚。

因此，该研究将通过弹性蛋白纤维的靶向酶处理，并与生化分析、组织学染色分析、生物力学测试相结合，同时使用光学非接触测量应变技术以量化弹性蛋白纤维对髌腱生物力学性能的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

1.1   设计   完全随机对照试验，生物力学分析，配对t检验和两样本t检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年9月至2022年4月在南方医科大学基础医学院人体解剖教研室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验标本及处理   获取成年猪的新鲜髌腱23个(雌性11只，体质量35-50 kg，12月龄左右)，用浸泡过磷酸盐缓冲液(PBS)的纱布平展包裹，-20 ℃冷冻保存[24-25]，隔天进行测试。动物实验获得深圳湾实验室伦理委员会批准，伦理决议编号：AETWC202101，批准时间：2021-09-01。             
1.3.2   主要试剂耗材   弹性蛋白酶(Elastin Products Company，EC134)，大豆胰蛋白酶抑制剂(Elastin Products Company，SB903)，弹性蛋白检测试剂盒(Biocolor，F2000)，1×PBS (Biosharp，BL302A)，Masson三色试剂盒(雷根，DC0032)，Verhoeff弹力纤维染色试剂盒(Sbjbio，BP-DL201)。
1.3.3   主要仪器设备   Bose 万能材料试验机( 3220-AT Series Ⅱ，美国沃特世公司)，索尼摄像机( FDR-AXP55，上海索广电子有限公司)，Multiskan GO全波长酶标仪(5111930，Thermo Scientific，美国)，多功能离心机(FC5718R，OHAUS，美国)，pH计(S210-K，梅特勒，美国)，正置显微镜(Primo star，Zeiss，德国)，全封闭式自动脱水机(Asp 300S，Leica，德国)。
1.4   实验方法  
1.4.1   弹性蛋白酶孵育的浓度及时间探索性实验    

(1)溶液配制：使用pH计将1×PBS调节为pH 8.3，然后配置4种不同浓度的弹性蛋白酶溶液(含0.1 g/L大豆胰蛋白酶抑制剂)，分别为1，5，10，20 U/mL；配置0.1 g/L大豆胰蛋白酶抑制剂溶液(SBTI)。

(2)弹性蛋白水解：切取来自同一个新鲜髌腱的小组织片段(n=15)，质量为40-50 mg(规格约为5 mm×5 mm×1 mm)[26]。为了防止弹性蛋白酶杂质引起组织蛋白水解，所有组织在3 mL的0.1 g/L大豆胰蛋白酶抑制剂溶液中室温下平衡15 min。这些组织随机分成5组(每组n=3)，在用PBS配置的0，1，5，10，20 U/mL弹性蛋白酶溶液中室温下孵育6 h，以评估弹性蛋白酶浓度对组织的影响。从另一个髌腱获取同样的小组织片段(n=15)进行上述大豆胰蛋白酶抑制剂处理，随机分成5组(每组n=3)，在3 mL的5 U/mL 弹性蛋白酶溶液中室温下孵育0，1，4，6，12 h，以评估孵育时间对组织的影响。弹性蛋白酶处理后，所有组织在PBS中洗涤3遍，共30 min，用下述生化分析测量弹性蛋白含量。结果表明弹性蛋白酶处理方案为在0.1 g/L的SBTI溶液中平衡15 min，然后在5 U/mL弹性蛋白酶溶液中孵育8 h。
1.4.2   生化分析   使用Fastin弹性蛋白检测试剂盒对髌腱的弹性蛋白含量进行定量分析。将孵育后的组织置于1.5 mL 微量离心管中，用剪刀剪成碎片，每管加入0.25 mol/L草酸溶液750 μL，混匀，在100 ℃下加热1 h；恢复常温后，13 000×g离心10 min，获取上清液并记录提取的液体体积。此过程重复2次以完全溶解组织样本，将不溶性弹性蛋白转化为可溶性α-弹性蛋白，合并提取的液体。根据制造商的说明，对提取的液体使用酶标仪测定A值，通过绘制标准曲线定量组织中弹性蛋白的含量，弹性蛋白含量通过湿质量进行归一化。
1.4.3   组织学分析

(1)髌腱处理：对获取的组织片段在PBS溶液或5 U/mL弹性蛋白酶溶液中室温下孵育8 h(每组n=3，来自同一个髌腱)，洗涤3遍后，用体积分数4%甲醛固定液固定48 h，进行脱水-透明-浸蜡-包埋-切片步骤处理，切片厚度为5 μm，染色完成后选取3张具有代表性的切片进行镜下观察。

(2) Verhoeff Van Gieson(VVG)染色：组织石蜡切片脱蜡至水，切片用配制好的Verhoeff 染色液浸染15-30 min，至颜色呈深黑色；流水冲洗，除去多余的染液；用Verhoeff 分化液分化至弹力纤维清晰为止(镜下观察)，流水充分冲洗；用体积分数95%乙醇处理数秒，快速脱碘，流水冲洗2.0-3.0 min；将切片放入5%硫代硫酸钠溶液中3 min，流水充分冲洗，蒸馏水冲洗；VG 染色液复染1 min，体积分数95%乙醇快速分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

(3) Masson染色：组织石蜡切片脱蜡至水，进入0.5%冰醋酸1 s，入复红染色液内10 min，入磷钼酸内5 min，入苯胺蓝染色液中3 min，冰醋酸洗涤3次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明中性树胶封固。
1.4.4   生物力学测试

(1)制样：获取20个新鲜髌腱，使用游标卡尺准确测量样品尺寸(长、宽、厚)3次，取平均值。将制备好的样品放入PBS中，直到进行力学测试，测试过程中用生理盐水喷洒，保持样本湿润。

(2)处理前后力学测试：使用万能材料试验机在室温下进行纵向拉伸实验，上下夹具之间的初始长度为25 mm[27]。在髌腱表面标记9个黑点，见图1，测试过程中使用摄像机拍摄测件在拉伸过程中的长度变化，用于后续应变分析。夹紧测件后，进行5次2%形变的循环加载，然后拉伸到12%的形变，最后做300 s应力松弛，测件以1%/s的应变率进行加载，并记录测试过程中的载荷及位移[28-29]。选取12%的形变是因为肌腱处在弹性范围内[30]，能使测件进行力学测试后恢复回原来的状态，以至于再次测试时具有可比性。测试完成后，将测件连同夹具一起从测试系统中取下来，在PBS中恢复30 min。所有测件先在0.1 g/L大豆胰蛋白酶抑制剂溶液中孵育15 min，然后随机选取10例测件分别在对照组PBS或5 U/mL弹性蛋白酶溶液中孵育8 h。孵育完成后，用PBS溶液清洗3遍，将测件连同夹具一起重新放回测试系统中，再次进行同样的力学测试。

(3)数据分析：采用Mathworks编程的自制程序来实时跟踪摄像机拍摄的9个标记点的位移，计算局部拉伸比的变化，即拉伸比=拉伸前的长度/拉伸后的长度，从而得到试样平均的拉伸比，并代入柯西应力公式计算应力变化，此部分方法已在前期力学测试中得到验证[31]。此次实验分析测试的应力松弛部分，以研究髌腱的时间依赖性行为，应力为初始应力归一化。峰值应力为拉伸到12%形变后紧随斜坡后的最大值，平衡应力为完成300 s应力松弛期时的稳态值，松弛百分比为应力松弛期间发生的相对变化，即(峰值应力-平衡应力)/峰值应力×100，归一化平均应力为重新测试的数据除以第1次测试(处理前)中相应样品的总体峰值
应力[32]。
1.5   主要观察指标   PBS或弹性蛋白酶处理后髌腱弹性蛋白含量的变化、组织结构的变化，及处理前后应力应变曲线、峰值应力、平衡应力、松弛百分比及归一化应力的变化。
1.6   统计学分析   所有结果表示为x±s，使用GraphPad Prism 6.01软件进行图标绘制及统计学分析。使用单因素方差分析评估不同浓度弹性蛋白酶或不同处理时间的弹性蛋白含量的变化，事后比较采用Bonferroni法。处理前后的力学性能差异采用配对t检验，两个处理组之间采用独立样本t检验。设定P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经南方医科大学统计学专家审核。

此次实验通过比较同一样品经过弹性蛋白酶处理前后的力学参数来评估弹性蛋白对髌腱的力学影响。髌腱经过弹性蛋白酶处理后，拉伸应力降低，应力松弛中的应力降低值更大，松弛百分比显著增加，这意味着弹性蛋白在髌腱的拉伸力学特性及黏弹性特性中起到重要作用。

HIRANO等[33]的研究结果显示当总弹性蛋白水平低于野生型30%时，动物的生存能力会受到影响，因此弹性蛋白的选择性降解或许可以用来研究已经历正常发育的组织。在此次研究中，弹性蛋白酶从组织中去除了37%-45%弹性蛋白，研究发现弹性蛋白含量降低约35%时，酶处理后的应力显著降低[17]，从而也表明了此次研究靶向酶处理方案的可行性。弹性蛋白酶可降解组织中胶原蛋白、层粘连蛋白、硫酸化糖胺聚糖等[34]，HENNINGER等[35]与GODINHO等[36]的研究使用与此次研究一样的弹性蛋白酶及相似的处理方案，发现不会对韧带或肌腱中的胶原蛋白含量造成影响，但硫酸化糖胺聚糖含量的降低对力学没有显著影响，这说明了组织力学的改变都源于弹性蛋白的损失。另外，从此次研究中的组织学染色分析也可以看出弹性蛋白酶主要是降解弹性蛋白。

PBS存在于弹性蛋白酶组，浸泡在PBS中的组织含水量会增加，从而导致组织肿胀，降低拉伸模量和应力[35]，与此次研究的结果表现一致(图4A，5A，6A)。因此需要将酶处理后的组织力学性能和PBS处理后的力学性能进行比较[37]，从而确定是目标蛋白的去除影响了力学性能。研究数据表明，弹性蛋白酶处理后的拉伸应力降低为处理前50%，虽然弹性蛋白含量占组织湿质量的1%-2%，但它能够提供约1 MPa的载荷支撑，从而确定了弹性蛋白在髌腱中的力学贡献。此次研究中弹性蛋白酶与PBS组处理前后的拉伸应力差值差异没有显著性意义，这与HENNINGER等[17]研究显著不同，但与FANG等[26]研究发现一致。这可能有3点原因：其一是研究对象不同，组织之间存在差异性；其二是孵育时间不同，有显著性差异的研究使用6 h，比此次研究时间短，所以额外影响少；其三是测试方案及使用的力学设备不同，存在一定的误差。

酶处理后对拉伸应力的影响，一个解释是关于弹性蛋白与胶原纤维的关系，胶原纤维在肌腱力学中起主要作用，此次研究的组织学结果显示弹性蛋白沿着胶原蛋白纤维排布，降解后会引起胶原纤维松散、弯曲度减少。FAZAELI 等[38]研究发现弹性蛋白纤维可以保护胶原纤维免受重复冲击载荷，所以随着弹性蛋白的去除，胶原纤维原有的预应力被消除，从而使它们处于放松状态。临床研究表明，弹性蛋白纤维在维持健康肌腱功能方面具有重要作用，弹性纤维在衰老过程中的降解可能是老年人肌腱损伤风险增加的原因，它的破坏可导致许多遗传性和获得性疾病[39-40]。

Ehlers-Danlos综合征、良性关节过度活动综合征等常出现弹性蛋白纤维的磨损、紊乱、钙化、碎片，弹性纤维疾病的患者也常出现关节活动异常，这突出了弹性蛋白纤维在关节周围结缔组织结构如肌腱的生物力学特性中发挥着不可或缺的作用[41]。

肌腱是一种黏弹性材料，表现出依赖于时间的力学响应，并耗散使其变形所需的一小部分能量，黏弹性的变化与疾病的进展有关[42]。在应力松弛测试中，弹性蛋白酶处理对髌腱黏弹性特性有显著影响(见图5B，6B)，应力降低的百分比显著增加(P < 0.05)；图6C中显示在应力松弛期间，弹性蛋白酶组比PBS对照组以更大的速率下降，更加体现了弹性蛋白对黏弹性特性的影响更大，这与ROSS等[43]对心脏瓣膜的研究一致，这一发现为了解组织的时间依赖性行为及如何受细胞外基质成分变化的影响提供了实验证据。弹性蛋白的这种黏弹性影响，其中一个解释可能是弹性蛋白能够储存弹性能量，但是弹性蛋白消耗之后，能量耗散增加，组织也不能完全回到初始状态[44]。

此次研究也有一定局限性：其一，因人体标本的限制，使用猪为研究对象，但是人与动物材料特性是有一定差异，因此下一步研究应该使用人体标本进行针对性实验；其二，实验弹性蛋白酶的渗透受到标本规格的限制，没有完全将弹性蛋白降解，下一步研究可以增大酶浓度及孵育时间。

综上所述，此次实验通过适度降解弹性蛋白从而改变了髌腱的力学性能，证明了弹性蛋白对髌腱的力学贡献，这为髌腱结构-功能之间的关系提供了新的见解，希望可以为髌腱炎在生物力学上的影响因素提供新的视角。通过获取的力学性能数据可用来建立包含弹性纤维的髌腱本构模型，并用于弹性纤维在正常、病理或损伤纤维结缔组织中的研究探讨。另外，髌腱是前交叉韧带重建的理想移植物，因此，此次实验的结果还可用来指导组织工程中髌腱材料的开发，模仿天然组织的微观结构，从而获得理想的性能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

文题释义：
准静态拉伸：在经典拉伸试验中，载荷稳定增加，且平稳施加称为准静态。准静态试验方法的上限大约为10-1 s-1的变形速度，因此最大增加量(例如应变)不能超过0.1%/s。
应力松弛：是高分子黏弹性特有的现象，指在一定温度和恒定应变的作用下，试样的应力随时间的增加而衰减的现象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

肌肉骨骼疾病是社会的一个重大负担，力学负荷是影响肌肉骨骼健康和疾病的重要因素，因此为肌肉骨骼组织损伤制定有效的治疗或预防措施，需要了解健康组织的功能和力学。确定特定蛋白质与力学性能之间的关系，可用于确定治疗的关键目标。弹性蛋白是一种特殊的蛋白质，是弹性纤维的主要成分，其最重要的生物学作用是赋予组织弹性和快速恢复的能力，使其能够持续承受载荷和变形，并执行指定的任务。研究表明弹性蛋白在能量储存肌腱中更丰富，而髌腱作为一种能量储存肌腱，弹性蛋白所具有的生物学作用可能使其具有更大的弹性和反冲能力，在膝关节的屈伸、跳跃等活动中发挥重要作用，从而使膝关节更加适应其在人体中的角色。该研究中弹性蛋白对髌腱力学性能影响的数据在基础研究中非常重要，补充了髌腱结构-功能关系的理解，为肌腱分层力学提供了新的见解；研究还可用于开发力学计算模型，并模拟各种疾病状态及确定治疗干预手段。

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