机器学习鉴定KDELR3作为骨关节炎缺氧特征基因的实验验证

doi:10.12307/2024.078

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (21): 3431-3437.doi: 10.12307/2024.078

• 植入物相关大数据分析 Implant related big data analysis • 上一篇下一篇

机器学习鉴定KDELR3作为骨关节炎缺氧特征基因的实验验证

徐文飞1，明春玉2，梅其杰1，袁长深1，郭锦荣1，曾超1，段戡1

1广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023；2广西中医药大学附属瑞康医院老年病科，广西壮族自治区南宁市 530011

收稿日期:2023-05-05 接受日期:2023-06-25 出版日期:2024-07-28 发布日期:2023-09-28
通讯作者: 段戡，博士，主任医师，广西中医药大学第一附属医院四肢骨伤科，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:徐文飞，男，1995年生，安徽省安庆市人，汉族， 2021年广西中医药大学毕业，硕士，主要从事骨与关节疾病的基础及临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82160912)，项目负责人：段戡；国家自然科学基金(82060875)，项目负责人：袁长深；2018年广西一流学科建设项目重点课题(2018xk074)，项目负责人：段戡

Experimental validation of machine learning identification of KDELR3 as a signature gene for osteoarthritis hypoxia

Xu Wenfei1, Ming Chunyu2, Mei Qijie1, Yuan Changshen1, Guo Jinrong1, Zeng Chao1, Duan Kan1

1Orthopedic Department of the Limbs, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Department of Geriatrics, Ruikang Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530011, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2023-05-05 Accepted:2023-06-25 Online:2024-07-28 Published:2023-09-28
Contact: Duan Kan, MD, Chief physician, Orthopedic Department of the Limbs, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Xu Wenfei, Master, Orthopedic Department of the Limbs, First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82160912 (to DK); National Natural Science Foundation of China, No. 82060875 (to YCS); Key Topic of 2018 Guangxi First Class Discipline Construction Project, No. 2018xk074 (to DK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨关节炎：是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性关节疾病，目前仍无根治方法，随着老龄化不断加剧，其患病率同样在不断增加。
细胞缺氧：是细胞由于氧气供应不足或用氧障碍，而引起组织代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程，与人类疾病息息相关。

背景：缺氧与骨关节炎软骨细胞损伤的发生、发展密切相关，但具体作用靶点及调控机制尚不清楚。

目的：运用机器学习方法鉴定KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)受体3(KDELR3)作为骨关节炎缺氧的特征基因及免疫浸润分析，以期为骨关节炎的治疗提供新的思路与方法。
方法：从GEO数据库下载骨关节炎相关的数据集和GSEA网站中获取缺氧相关基因；采用R语言对骨关节炎数据集进行批次校正及免疫浸润分析，并提取骨关节炎缺氧基因进行差异分析，对差异表达基因进行GO功能及KEGG信号通路分析；同时运用加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis，WGCNA)及机器学习筛选骨关节炎缺氧的特征基因，并进行体外细胞实验，运用数据集及qPCR验证表达并行相关免疫浸润分析。

结果与结论：①经批次校正及主成分分析获得骨关节炎基因8 492个，主要与Macrophages M2和Mast cells resting等免疫细胞密切相关；同时获得缺氧基因200个，进而得到41个骨关节炎缺氧差异表达基因。②GO分析主要涉及对营养水平、糖皮质激素反应等生物过程；涉及溶酶体腔、高尔基内腔等细胞组分；涉及14-3-3蛋白结合、DNA结合转录激活剂活性等分子功能。③KEGG分析骨关节炎缺氧差异表达基因与PI3K-Akt、FoxO及癌症中的微小RNA等信号通路有关。④运用WGCNA分析及机器学习筛选后获得特征基因KDELR3。⑤通过基因芯片验证后发现KDELR3基因在滑膜中实验组基因表达高于对照组(P=0.014)，而半月板中实验组基因的表达却低于对照组(P=0.024)。⑥体外软骨细胞实验显示KDELR3基因在软骨中实验组表达高于对照组(P=0.005)，同时KDELR3基因与Macrophages M0(P=0.014)，T cells follicular helper(P=0.014)等密切相关。运用机器学习方法证实KDELR3可作为骨关节炎缺氧特征基因，可能通过改善缺氧来干预骨关节炎发病，期待能为更好地治疗骨关节炎提供新方向。

https://orcid.org/0000-0001-5279-2252 (徐文飞)；https://orcid.org/0009-0006-1006-7374 (段戡)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 骨关节炎, 机器学习, 缺氧, 特征基因, 软骨细胞, 生物标志物, 免疫浸润分析

Abstract: BACKGROUND: Hypoxia is strongly associated with the development and progression of osteoarthritic chondrocyte injury, but the specific targets and regulatory mechanisms are unclear.
OBJECTIVE: A machine learning approach was used to identify KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) receptor 3 (KDELR3) as a characteristic gene for osteoarthritis hypoxia and immune infiltration analysis, to provide new ideas and methods for the treatment of osteoarthritis.
METHODS: The osteoarthritis-related datasets were downloaded from the GEO database and the GSEA website to obtain hypoxia-related genes. The osteoarthritis datasets were batch-corrected and immune infiltration analyzed using R language, and osteoarthritis hypoxia genes were extracted for differential analysis. Differentially expressed genes were analyzed for GO function and KEGG signaling pathway. Weighted correlation network analysis (WGCNA) and machine learning were also used to screen osteoarthritis hypoxia signature genes, and in vitro cellular experiments were performed to validate expression and correlate immune infiltration analysis using the datasets and qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) 8 492 osteoarthritis genes were obtained by batch correction and principal component analysis, mainly strongly associated with immune cells such as Macrophages M2 and Mast cells resting; 200 hypoxia genes were also obtained, resulting in 41 osteoarthritis hypoxia differentially expressed genes. (2) GO analysis involved mainly biological processes such as response to nutrient levels and glucocorticoids; cellular components such as lysosomal lumen and Golgi lumen; and molecular functions such as 14-3-3 protein binding and DNA-binding transcriptional activator activity. (3) KEGG analysis of osteoarthritis hypoxia differentially expressed genes was associated with signaling pathways such as PI3K-Akt, FoxO, and microRNAs in cancer. (4) The characteristic gene KDELR3 was obtained after using WGCNA analysis and machine learning screening. (5) The gene expression of KDELR3 was found to be higher in the test group than in the control group in the synovium (P=0.014) but lower in the meniscus (P=0.024) after validation by gene microarray. (6) In vitro chondrocyte assay showed that the expression of KDELR3 was higher in cartilage than in the control group (P=0.005), while KDELR3 was closely associated with Macrophages M0 (P=0.014) and T cells follicular helper (P=0.014). Using a machine learning approach, we confirmed that KDELR3 can be used as a hypoxic signature gene for osteoarthritis and may intervene in osteoarthritis pathogenesis by improving hypoxia, expecting to provide a new direction for better treatment of osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, machine learning, hypoxia, signature gene, chondrocyte, biomarker, immune infiltration analysis

中图分类号:

徐文飞, 明春玉, 梅其杰, 袁长深, 郭锦荣, 曾超, 段戡. 机器学习鉴定KDELR3作为骨关节炎缺氧特征基因的实验验证[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(21): 3431-3437.

Xu Wenfei, Ming Chunyu, Mei Qijie, Yuan Changshen, Guo Jinrong, Zeng Chao, Duan Kan. Experimental validation of machine learning identification of KDELR3 as a signature gene for osteoarthritis hypoxia[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(21): 3431-3437.

图/表（结果） 8

2.1 数据处理及免疫浸润分析结果通过GEO数据库下载骨关节炎基因芯片数据集GSE55235，GSE1919，GSE82107和GSE98918，共获得37个骨关节炎样品和 34个正常样品的数据；将GSE55235和GSE1919合并、批次校正及PCA分析后得到基因8 492个，见图1A，B。运用GSEA网站hallmark基因集共获取缺氧相关基因200个。
使用CIBERSORT反卷积算法获得骨关节炎相关实验样本的免疫细胞表达情况，研究发现实验组及对照组样本主要与Macrophages M2及Mast cells resting等免疫细胞密切相关，且实验组的表达高于对照组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，见图1C，D。运用R语言中的“corrplot”包分析免疫细胞之间的相关性，发现其中Dendritic cells activated与Mast cells activated密切相关(相关系数=0.9)，见图1E。

2.2 骨关节炎缺氧潜在作用靶点采用R语言共提取骨关节炎缺氧基因170个，同时运用“limma”软件包分析获得41个骨关节炎缺氧的差异表达基因，其中上调基因4个，下调基因37个；同时采用“ggplot2”工具包对差异表达基因进行火山图绘制，以“pheatmap”包对差异表达基因进行聚类分析，见图2A，B。

2.3 GO分析、KEGG信号通路分析结果为了更好地展示富集分析结果，采用R语言对24个差异表达基因进行GO功能富集分析及KEGG信号通路分析，差异表达基因主要涉及对营养水平的反应、糖皮质激素反应、皮质类固醇反应等生物过程；涉及溶酶体腔、高尔基内腔、液泡腔等细胞组分；涉及14-3-3蛋白结合、DNA结合转录激活剂活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性、DNA结合转录激活剂活性等分子功能，见图3A。KEGG信号通路分析：主要与PI3K-Akt信号通路及FoxO信号通路等信号通路有关，见图3B。

2.4 骨关节炎缺氧校正基因的WGCNA分析结果实验运用R语言对骨关节炎缺氧校正基因进行WGCNA分析，通过计算样本间的相关性，绘制样本的分层聚类图，见图4A，同时使用动态剪切树的算法筛选获得一种基因模块(Grey模块)，包含有23种特征基因，分别为ADM，VEGFA，JUN，MAFF，DDIT4，SLC2A3，NFIL3，STC1，PLIN2和PNRC1等，见图4B。

2.5 骨关节炎缺氧基因的随机森林及人工神经网络分析结果运用R语言对骨关节炎缺氧基因进行随机森林分析，以重要性得分大于0.5共获得10种基因，包括KDELR3，NFIL3，PPP1R15A，PIM1，DDIT4，FOSL2，VEGFA，BTG1，PLIN2和GPC3，其中KDELR3是最重要的基因，见图5A，B。同时运用R语言“heatmap” 包对获得的基因表达绘制热图，发现NFIL3，PPP1R15A，PIM1，DDIT4，FOSL2，VEGFA，BTG1，PLIN2和GPC3在对照组中呈高表达，而KDELR3在实验组中呈高表达，见图5C。同时再次采用R语言对骨关节炎缺氧基因进行人工神经网络分析，根据基因的重要性评分来构建人工神经网络模型，发现实验组与对照组样本选择准确性高，见图5D。

2.6 LASSO回归分析及SVM-RFE分析结果运用R语言对骨关节炎的缺氧基因进行LASSO回归分析及SVM-RFE分析。LASSO回归分析筛选出10个特征基因(DDIT4，MAFF，NFIL3，KDELR3，ADM，VEGFA，STC1，GLRX，GBE1及GPC3)，见图6A；SVM-RFE分析筛选出6个特征基因(KDELR3，MAFF，PLIN2，PPP1R15A，FOSL2及ATF3)，见图6B；再采用R语言veen包对WGCNA分析、人工神经网络分析、LASSO回归分析及SVM-RFE分析进行交集，共获得1个骨关节炎缺氧的特征基因KDELR3，见图6C；将KDELR3与GSE82107，GSE98918基因芯片数据进行验证，发现在滑膜组织中实验组KDELR3的表达高于对照组(P=0.014)，见图6D；在半月板组织中实验组KDELR3的表达低于对照组(P=0.024)，见图6E。同时，运用ROC曲线及验证组ROC曲线能更好地判断KDELR3作为疾病特征基因的准确性，该研究显示：ROC曲线的AUC=1.00，验证组ROC曲线的AUC (GSE82107)=0.857，AUC (GSE98918)=0.771，两者均大于0.5，见图6F-G，说明KDELR3作为疾病特征基因的准确性较高。

2.7 体外细胞基因表达验证结果实时荧光定量PCR结果表明，实验组KDELR3 mRNA的表达高于对照组(P=0.005)，见图7。

2.8 特征基因免疫浸润分析结果在骨关节炎免疫浸润分析结果的基础上，进一步运用R语言筛选骨关节炎缺氧特征基因KDELR3相关的免疫细胞，见图8A。以P < 0.05为检验标准，结果提示，KDELR3与Macrophages M0 (P=0.014)、T cells follicular helper(P=0.014)、Eosinophils (P=0.032)、Mast cells activated (P=0.029)、T cells CD4 memory resting (P=0.011)密切相关，见图8B-F。

参考文献

[1] TANG X, WANG S, ZHAN S, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in china: results from the china health and retirement longitu dinal study. Arthritis Rheumatol. 2016;68(3):648-653.
[2] CHARLIER E, DEROYER C, CIREGIA F, et al. Chondrocyte dedifferentiation and osteoarthritis (OA). Bioc hem Pharmacol. 2019;165:49-65.
[3] LEE JW, KO J, JU C, et al. Hypoxia signaling in human diseases and therapeutic targets. Exp Mol Med. 2019;51(6):1-13.
[4] HENROTIN Y, KURZ B, AIGNER T. Oxygen and reactive oxygen species in cartilage degradation: friends or foes? Osteoarthritis Cartilage. 2005;13(8): 643-654.
[5] CAMACHO DM, COLLINS KM, POWERS RK, et al. Next-Generation Machine Learning for Biological Networks. Cell. 2018;173(7):1581-1592.
[6] JAMSHIDI A, PELLETIER JP, MARTEL-PELLETIER J. Machine-learning-based patient-specific prediction models for knee osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2019;15(1):49-60.
[7] LU K, WEI S, WANG Z, et al. Identification of novel biomarkers in Hunner’s interstitial cystitis using the CIBERSORT, an algorithm based on machine learning. BMC Urol. 2021;21(1):109.
[8] CHEN L, ZHANG YH, WANG S, et al. Prediction and analysis of essential genes using the enrichments of gene ontology and KEGG pathways. PLoS One. 2017;12(9):e0184129.
[9] KANEHISA M, FURUMICHI M, TANABE M, et al. KEGG: new perspectives on genomes, pathways, diseases and drugs. Nucleic Acids Res. 2017;45(1): 353-361.
[10] LANGFELDER P, HORVATH S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 2008;9:559.
[11] CHEN X, ISHWARAN H. Random forests for genomic data analysis. Genomics. 2012;99(6):323-329.
[12] ZOU J, HAN Y, SO SS. Overview of artificial neural networks. Methods Mol Biol. 2008;458:15-23.
[13] LI Z, SILLANPAA MJ. Overview of LASSO-related penalized regression methods for quantitative trait mapping and genomic selection. Theor Appl Genet. 2012;125(3):419-435.
[14] GAO J, KWAN PW, SHI D. Sparse kernel learning with LASSO and Bayesian inference algorithm. Neural Netw. 2010;23(2):257-264.
[15] CHEN D, SHEN J, ZHAO W, et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Res. 2017;5:16044.
[16] OO WM. Prospects of disease-modifying osteoarthritis drugs. Clin Geriatr Med. 2022;38(2):397-432.
[17] WONG BW, MARSCH E, TREPS L, et al. Endothelial cell metabolism in health and disease: impact of hypoxia. EMBO J. 2017;36(15):2187-2203.
[18] PFANDER D, CRAMER T, SWOBODA B. Hypoxia and HIF-1alpha in osteoarthritis. Int Orthop. 2005;29(1):6-9.
[19] YUDOH K, NAKAMURA H, MASUKO-HONGO K, et al. Catabolic stress induces expression of hypoxia-inducible factor (HIF)-1 alpha in articular chondrocytes: involvement of HIF-1 alpha in the pathogenesis of osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2005;7(4):904-914.
[20] MARKWAY BD, CHO H, JOHNSTONE B. Hypoxia promotes redifferentiation and suppresses markers of hypertrophy and degeneration in both healthy and osteoarthritic chondrocytes. Arthritis Res Ther. 2013;15(4):92.
[21] WU CL, HARASYMOWICZ NS, KLIMAK MA, et al. The role of macrophages in osteoarthritis and cartilage repair. Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(5): 544-554.
[22] ZHANG H, CAI D, BAI X. Macrophages regulate the progression of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(5):555-561.
[23] CARDAMONE C, PARENTE R, FEO GD, et al. Mast cells as effector cells of innate immunity and regulators of adaptive immunity. Immunol Lett. 2016;178:10-14.
[24] SAVVIDOU O, MILONAKI M, GOUMENOS S, et al. Glucocorticoid signaling and osteoarthritis. Mol Cell Endocrinol. 2019;480:153-166.
[25] MATSUZAKI T, ALVAREZ-GARCIA O, MOKUDA S, et al. FoxO transcription factors modulate autophagy and proteoglycan 4 in cartilage homeostasis and osteoarthritis. Sci Transl Med. 2018;10(428):eaan0746.
[26] LIN C, SHAO Y, ZENG C, et al. Blocking PI3K/AKT signaling inhibits bone sclerosis in subchondral bone and attenuates post-traumatic osteoarthritis. J Cell Physiol. 2018;233(8):6135-6147.
[27] TRYCHTA KA, BACK S, HENDERSON MJ, et al. KDEL receptors are differentially regulated to maintain the er proteome under calcium deficiency. Cell Rep. 2018;25(7):1829-1840.
[28] SCHWARZ DS, BLOWER MD. The endoplasmic reticulum: structure, function and response to cellular signaling. Cell Mol Life Sci. 2016;73(1):79-94.
[29] OAKES SA, PAPA FR. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 2015;10:173-194.
[30] TAKADA K, HIROSE J, SENBA K, et al. Enhanced apoptotic and reduced protective response in chondrocytes following endoplasmic reticulum stress in osteoarthritic cartilage. Int J Exp Pathol. 2011;92(4):232-242.
[31] RELLMANN Y, EIDHOF E, DREIER R. Review: ER stress-induced cell death in osteoarthritic cartilage. Cell Signal. 2021;78:109880.
[32] KANG M, HUANG CC, LU Y, et al. Bone regeneration is mediated by macrophage extracellular vesicles. Bone. 2020;141:115627.
[33] SHAN Y, QI C, LIU Y, et al. Increased frequency of peripheral blood follicular helper T cells and elevated serum IL21 levels in patients with knee osteoarthritis. Mol Med Rep. 2017;15(3):1095-1102.
[34] RAGIPOGLU D, DUDECK A, HAFFNER-LUNTZER M, et al. The role of mast cells in bone metabolism and bone disorders. Front Immunol. 2020;11:163.

引言

材料方法

1.1 设计机器学习、加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis，WGCNA)、体外人软骨细胞分组实验验证。
1.2 时间及地点 2022年9-12月在广西中医药大学实验室和江西中洪博元生物技术有限公司完成。

1.3 资料通过GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 下载骨关节炎基因芯片数据集GSE55235，GSE1919，GSE82107，GSE98918，所采用的平台分别为GPL96(Affymetrix Human Genome U133A Array)、GPL91(Affymetrix Human Genome U95A Array)、GPL570(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)和GPL20844(Agilent-072363 SurePrint G3 Human GE v3 8x60K Microarray 039494)。上述基因芯片数据共包括37个骨关节炎样品(实验组)和 34个非骨关节炎样品(对照组)，同时运用GSEA网站hallmark基因集(http://www.gsea-msigdb.org)共获取缺氧相关基因200个，见表1。

1.4 方法
1.4.1 批次校正及免疫浸润分析运用R语言“sva”软件包对GSE55235及GSE1919数据集进行合并、批次校正及主成分分析(principal component analysis，PCA)。为了评估骨关节炎中免疫细胞的浸润情况、获得免疫细胞之间的相关性及差异性，分析免疫细胞与特征基因的关系。该研究采用CIBERSORT反卷积算法计算免疫数据库中所有骨关节炎样本组织的表达谱[7]，对其进行1 000次模拟计算，从而得到骨关节炎样本组织中22种免疫细胞浸润及分布情况，基于P < 0.05筛选，计算样本中的每个免疫细胞的百分比，获得基因与免疫细胞的相关性。
1.4.2 骨关节炎缺氧潜在作用靶点为更好地阐述骨关节炎与缺氧之间的相关性，采用R语言中“limma”软件包提取骨关节炎的缺氧基因及输出同时满足P < 0.05且｜log2 fold change(log2FC)|>1的差异表达基因(DEGs)，使用“pheatmap”包进行热图及“ggplot2”包进行火山图绘制来更好地展示差异表达基因的分布。
1.4.3 GO分析、KEGG信号通路分析基因本体论(gene ontology，GO)是一组大量的基因注释术语，可用于识别高通量基因组或转录组数据的特征生物学属性[8]；而KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析可获得差异表达基因相关的通路[9]。该研究采用R语言对差异表达基因进行GO分析，其中包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)与分子功能(MF)，KEGG通路富集分析，并使用“GOplot”进行结果可视化，其中显著性基因富集的临界值设定为P < 0.05。
1.4.4 WGCNA分析是一种常用的模块化分析技术，已被用于识别和筛选复杂疾病的生物标志物或药物靶点，鉴定高度协同变化的基因表达矩阵[10]。通过R语言中的“WGCNA”包对校正基因进行共表达网络分析，根据基因表达模式的不同，挖掘出相似表达模式的基因，获得骨关节炎缺氧相关程度最高的模块及其中所包含的所有特征基因。
1.4.5 随机森林及人工神经网络分析随机森林(Random Forest)是建立于决策树算法基础之上发展而来的算法[11]，通过R语言“randomForest”包对骨关节炎缺氧基因进行分析，首先将参数“ntree”设置为500，找到最佳树数。通过计算交叉验证的误差，选择12棵作为代表交叉验证的最小误差的最佳树数。然后，利用参数12重建随机森林图，得出基因的重要性评分。重要性评分大于0.5的基因被视为骨关节炎缺氧显著相关基因，同时利用R语言 “heatmap ”包对显著基因绘制热图。人工神经网络分析(ANN)是一种从模拟人脑的想法演变而来的机器学习方法[12]；基于Random Forest鉴定的10个重要基因，通过R包“neuralnet”构建骨关节炎缺氧的人工神经网络模型。
1.4.6 LASSO回归及SVM-RFE分析 LASSO回归分析可以同时进行变量选择和正则化，以提高统计模型的预测准确性和可解释性[13]；而SVM-RFE分析是一个基于SVM最大间隔原理的序列后向选择算法[14]。运用R语言“glmnet，e1071，kernlab，caret”包对骨关节炎缺氧基因进行LASSO回归分析及SVM-RFE分析，且采用“veen”包对WGCNA分析、人工神经网络分析、LASSO回归分析及SVM-RFE分析结果进行交集，获得骨关节炎缺氧的特征基因，绘制受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve，ROC)判断其准确性，并将结果与GSE82107和GSE98918基因芯片数据验证其表达情况。
1.4.7 体外细胞实验和荧光定量PCR检测将人膝关节软骨细胞(CP-H107，普诺赛)分为对照组(正常人软骨细胞)、实验组(细胞骨关节炎模型)，对照组不作处理，实验组采用去细胞培养上清干预，用1×PBS洗2遍，加入体积分数0.25%胰酶(体积分数0.02% EDTA)消化，待细胞变圆加入培养基终止消化并收集细胞悬液至10 mL离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃去上清液加入培养基重悬细胞，制备细胞悬液浓度为2×108 L-1，进行铺板处理。次日待细胞状态良好，加入白细胞介素1β(10 μg/L)处理24 h模拟骨关节炎软骨细胞造模，使用实时荧光定量PCR检测Ⅱ型胶原蛋白的表达情况进行模型验证，造模成功后实时荧光定量PCR检测KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)受体3(KDELR3)mRNA的表达。

使用Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO公司)从软骨细胞中提取总RNA，在50 ℃条件下保持15 min，然后转到85 ℃条件下保持5 s进行反转录，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme公司) 95 ℃ 10 min ，进行1个循环，95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环反应程序下进行qPCR。使用β-actin作为内参，分别计算对照组及实验组ΔCt值，使用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。引物序列见表2。

1.4.8 特征基因的免疫浸润分析为更好地展示骨关节炎缺氧特征基因的免疫细胞浸润情况；该研究在骨关节炎免疫细胞浸润结果的基础上，再次运用R语言对骨关节炎缺氧特征基因进行免疫细胞分析，找出特征基因的相关免疫细胞。
1.5 主要观察指标骨关节炎缺氧特征基因在软骨细胞的表达差异。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计分析，所有实验重复3次，数据采用x±s表示，用独立样本t检验进行组间差异比较，P < 0.05代表差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是一种由多种因素引起的慢性退行性疾病，以关节软骨退行性变、继发骨质增生为主要特征[15]，然而目前骨关节炎发病机制却未阐明，仍将缓解症状，改善生活质量作为首选目标，虽治疗方案较多，但却无根治方法，且疗效参差不齐[16]。因此，有效阐明骨关节炎发病机制就显得尤为重要。而缺氧是由于氧气供应不足或用氧障碍，而引起组织代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程，与骨关节炎发病息息相关[17]。目前研究发现，在正常情况下，软骨细胞依赖缺氧诱导因子1α的适应性功能来维持ATP水平，促进骨关节炎中能量的产生及软骨基质的形成[18-19]。在缺氧状态下，可促进软骨细胞再分化及抑制软骨细胞肥大与变性，从而有效延缓骨关节炎发展进程[20]。然而当前对于骨关节炎与缺氧相关作用机制仍尚未清晰，因此，该研究运用机器学习和WGCNA分析并结合体外细胞实验进一步阐述骨关节炎与缺氧作用机制，以期从缺氧角度为治疗骨关节炎提供新方向。
该研究通过骨关节炎芯片数据集经批次校正及PCA分析后共获得骨关节炎基因8 492个，主要与Macrophages M2、Mast cells resting免疫细胞密切相关，其中Macrophages M2可通过分泌炎性细胞因子、生长因子、基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)来调节关节炎症，诱导软骨的降解与破坏[21-22]。而Mast cells resting作为一种粒细胞，可通过延迟释放多种细胞因子与趋化因子，诱导适应性免疫细胞调节及组织损伤来缓解炎症的发展，从而对骨关节炎产生着重要的作用[23]，说明可通过调节免疫细胞状态来改善关节炎症，从而起到延缓关节软骨退变，改善症状的作用。
文章采用GSEA网站共获得缺氧相关基因200个，差异分析后共得到41个骨关节炎缺氧差异表达基因，为更好地分析差异表达基因与骨关节炎联系，故采用GO分析、KEGG信号通路分析结果显示，差异表达基因主要涉及对营养水平反应及糖皮质激素反应等生物过程，涉及溶酶体腔和高尔基内腔等细胞组分，涉及14-3-3蛋白结合、DNA结合转录激活剂活性等分子功能；其中营养水平主要与软骨细胞分化具有密切联系，而糖皮质激素反应主要通过各种信号通路来维持细胞稳态，从而起着缓解骨关节炎炎症与疼痛的作用[24]。同时，差异表达基因与PI3K-Akt、FoxO等信号通路有关，PI3K-Akt信号通路与FoxO信号通路均能减少炎症递质和软骨降解酶的释放，调节软骨细胞稳态，从而对骨关节炎起着重要的作用[25-26]。
该研究运用机器学习、WGCNA分析最终获得骨关节炎缺氧特征基因KDELR3，并采用基因芯片及体外细胞实验验证其表达，发现KDELR3在骨关节炎滑膜及软骨组织内呈高表达，而在骨关节炎半月板组织内呈低表达。然而目前却尚未发现KDELR3与骨关节炎的相关研究。KDELR3作为KDELR内质网家族的重要成员，可调节内质网腔中蛋白质的合成和分泌[27]；内质网不仅影响钙的储存及脂质、类固醇合成和运输，而且对激素和葡萄糖代谢的活性同样起着重要的作用[28]。内质网应激则是由于各种因素阻碍细胞正确折叠和翻译后修饰内质网中分泌蛋白和跨膜蛋白能力，导致细胞器中错误折叠蛋白积聚而形成，故KDELR3能够对内质网应激反应产生重要的影响[29]。另有研究发现，内质网应激可干扰软骨细胞稳态并启动未折叠蛋白反应及上调基质金属蛋白酶表达，诱导骨关节炎软骨细胞死亡[30-31]，因此，文章推测KDELR3可通过内质网应激途径干预骨关节炎缺氧表达来影响病情发展。
进一步免疫浸润分析发现KDELR3与Macrophages M0，T cells follicular helper和Mast cells activated等免疫细胞密切相关。其中Macrophages M0可影响成骨细胞进而促进骨修复及再生[32]；T cells follicular helper在骨关节炎血清中呈高表达状态，与骨关节炎疾病活动度、C-反应蛋白水平和WOMAC呈正相关[33]。Mast cells activated作为免疫系统的重要传感器和效应细胞，可分泌多种介质在黏膜或结缔组织中分化，从而受到自身的激活而释放，起到促进破骨细胞形成及抑制成骨细胞活性的作用，进而诱导骨分解代谢[34]；故KDELR3可能会通过免疫细胞途径参与骨关节炎发展。
综上所述，该研究通过运用机器学习及体外细胞实验，发现KDELR3作为骨关节炎缺氧特征基因。虽然该研究可能会为治疗骨关节炎提供新的见解，但文章仍存在不足之处，如仅运用体外细胞实验证实KDELR3在骨关节炎软骨细胞的表达，然而尚缺体内动物实验及临床试验进行验证，同时由于KDELR3与骨关节炎的研究尚未阐明，因此期待后续研究不断完善，为KDELR3与骨关节炎缺氧的关系提供坚实基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

机器学习鉴定KDELR3作为骨关节炎缺氧特征基因的实验验证

Experimental validation of machine learning identification of KDELR3 as a signature gene for osteoarthritis hypoxia

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李永杰, 付申宇, 夏渊, 张达宽, 刘洪举. 膝骨关节炎女性伸膝肌力、步态时空参数与峰值膝关节屈曲/内收力矩关系[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1354-1358.
[2]	齐浩东, 鲁超, 徐韩博, 王孟飞, 郝阳泉. 糖尿病对初次全膝关节置换围术期失血量和疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1383-1387.
[3]	余伟杰, 刘爱峰, 陈继鑫, 郭天赐, 贾易臻, 冯汇川, 杨家麟. 机器学习在腰椎间盘突出症诊治中的优势和应用策略[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1426-1435.
[4]	黄夏荣, 胡莉芝, 孙光华, 彭昕珂, 廖瑛, 廖源, 刘静, 尹林伟, 钟培瑞, 彭婷, 周君, 屈萌艰. 电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1174-1179.
[5]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[6]	李蕊, 张桂红, 王涛, 樊萍. 人参多糖干预创伤性骨关节炎模型大鼠前列腺素E2/6-酮-前列腺素F1α的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1235-1240.
[7]	张克凡, 石辉. 细胞因子治疗骨关节炎的研究现状及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(6): 961-967.
[8]	申飞燕, 姚吉祥, 苏珊珊, 赵忠民, 唐巍东. 敲低环状RNA WD重复含蛋白1抑制膝骨关节炎软骨细胞增殖并诱导凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 499-504.
[9]	买斯吐热木·黑力力, 张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔注射医用臭氧对早期颞下颌骨关节炎模型大鼠髁突组织学的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 505-509.
[10]	乔虎军, 王国祥. 白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 516-521.
[11]	陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.
[12]	刘宇涵, 樊渝江, 王启光. 早期创伤性膝骨关节炎动物模型构建方案的比较[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 542-549.
[13]	张亚茹, 陈焱君, 张晓东, 陈胜华, 黄文华. 谷胱甘肽过氧化物酶4介导铁死亡在膝骨关节炎滑膜炎发生发展中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 550-555.
[14]	刘潞兴, 狄鸣远, 杨强. 中药有效成分治疗骨关节炎机制中的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 609-614.
[15]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 中药单体靶向自噬治疗骨关节炎的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 627-632.