川芎嗪对脊髓损伤大鼠铁死亡的调控作用及机制

doi:10.12307/2024.432

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (26): 4158-4163.doi: 10.12307/2024.432

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川芎嗪对脊髓损伤大鼠铁死亡的调控作用及机制

陶经纬1，周婧雅1，赵毅1，任敬佩1，胡传宇1，徐林1，穆晓红1，范筱1，2

1北京中医药大学东直门医院，北京市 100700；2青岛市市立医院，山东省青岛市 266011

收稿日期:2023-06-10 接受日期:2023-07-24 出版日期:2024-09-18 发布日期:2023-09-28
通讯作者: 穆晓红，博士，主任医师，北京中医药大学东直门医院，北京市 100700 范筱，博士，主治医师，北京中医药大学东直门医院，北京市 100700；青岛市市立医院，山东省青岛市 266011
作者简介:陶经纬，男，1994年生，北京市人，汉族，北京中医药大学在读博士，主要从事中西医结合治疗脊柱脊髓损伤及脑性瘫痪方面研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82205149)，项目负责人：范筱；中国博士后基金(2022M710472)，项目负责人：范筱

Effect and mechanism of tetramethylpyrazine regulating ferroptosis in rats with spinal cord injury

Tao Jingwei1, Zhou Jingya1, Zhao Yi1, Ren Jingpei1, Hu Chuanyu1, Xu Lin1, Mu Xiaohong1, Fan Xiao1, 2

1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China

Received:2023-06-10 Accepted:2023-07-24 Online:2024-09-18 Published:2023-09-28
Contact: Mu Xiaohong, MD, Chief physician, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China Fan Xiao, MD, Attending physician, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266011, Shandong Province, China
About author:Tao Jingwei, MD candidate, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82205149 (to FX); China Postdoctoral Science Fund, No. 2022M710472 (to FX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

川芎嗪：是中药川芎的有效成分，能够发挥抗氧化、抗炎等作用，被广泛应用于多种心脑血管疾病的治疗中。
铁死亡：是一种不同于凋亡、焦亡的细胞程序性死亡。铁死亡以铁代谢失衡及脂质过氧化反应为主要病理表现。

背景：研究表明脊髓损伤与铁死亡存在密切联系，而川芎嗪具有调控氧化还原反应的功能。

目的：探究川芎嗪对脊髓损伤大鼠铁死亡的调控作用及机制。
方法：将36只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组及川芎嗪组，每组12只。模型组、川芎嗪组大鼠采用改良Allen’s法建立脊髓损伤模型，造模后分别腹腔注射生理盐水、川芎嗪注射液，1次/d，连续治疗28 d；假手术组不建模也不进行治疗。

结果与结论：①川芎嗪组治疗14，21，28 d的运动功能BBB评分低于假手术组(P < 0.05)、高于模型组(P < 0.05)；②治疗28 d的苏木精-伊红染色显示，模型组大鼠脊髓组织可见空洞形成，局部见坏死组织及炎性浸润，并伴有纤维组织形成；川芎嗪组大鼠脊髓组织缺损面积较小，炎性浸润及纤维组织形成少于模型组；③治疗28 d的普鲁士蓝染色显示，模型组大鼠脊髓组织内可见大量铁沉积，川芎嗪组大鼠脊髓组织内铁沉积少于模型组；④治疗28 d，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织内谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶水平降低(P < 0.05)，丙二醛水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，川芎嗪组大鼠脊髓组织内谷胱甘肽、超氧化物歧化酶水平升高(P < 0.05)，丙二醛水平降低(P < 0.05)；⑤治疗28 d，qRT-PCR与Western blot检测显示，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织内谷胱甘肽过氧化物酶4、铁蛋白重链、铁输出蛋白的mRNA与蛋白表达水平均降低(P < 0.05)；与模型组比较，川芎嗪组大鼠脊髓组织内谷胱甘肽过氧化物酶4、铁蛋白重链、铁输出蛋白的mRNA与蛋白表达水平均升高(P < 0.05)；⑥治疗28 d的免疫荧光染色显示，假手术组大鼠脊髓组织神经元特异性核蛋白表达最多，模型组大鼠脊髓组织神经元特异性核蛋白表达最少；⑦结果表明，川芎嗪可通过调控铁死亡改善脊髓损伤大鼠的运动功能并起到神经保护作用。

https://orcid.org/0000-0003-1114-2437(陶经纬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 川芎嗪, 脊髓损伤, 铁死亡, 神经保护作用, 氧化应激

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that there is a close association between spinal cord injury and ferroptosis, and that tetramethylpyrazine has the function of regulating redox reactions.
OBJECTIVE: To investigate the regulatory effect of tetramethylpyrazine on ferroptosis in rats with spinal cord injury and its mechanism.
METHODS: Thirty-six female specific pathogen-free Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group, model group and tetramethylpyrazine group, with 12 rats in each group. Animal models of spinal cord injury were established using the modified Allen’s method in the latter two groups. No treatment was given in the sham-operated group, while rats in the model and tetramethylpyrazine groups were given intraperitoneal injection of normal saline and tetramethylpyrazine solution, once a day, for 28 days.
RESULTS AND CONCLUSION: The Basso, Beattie & Bresnahan Locomotor Rating Scale score in the tetramethylpyrazine group was lower than that in the sham-operated group but higher than that in the model group after 14, 21, and 28 days of treatment (P < 0.05). After 28 days of treatment, hematoxylin-eosin staining showed that in the model group, the spinal cord tissue of rats showed cavity formation, necrotic tissue and inflammatory infiltration with fibrous tissue formation; in the tetramethylpyrazine group, the area of spinal cord tissue defects was smaller, and inflammatory infiltration and fibrous tissue formation were less than those in the model group. After 28 days of treatment, Prussian blue staining showed that a large amount of iron deposition was seen in the spinal cord tissue of rats in the model group, and less iron deposition was seen in the spinal cord tissue of rats in the tetramethylpyrazine group than in the model group. After 28 days of treatment, the levels of glutathione and superoxide dismutase in the rat spinal cord tissue were decreased (P < 0.05) and the level of malondialdehyde was increased in the model group compared with the sham-operated group (P < 0.05); the levels of glutathione and superoxide dismutase in the rat spinal cord tissue were increased (P < 0.05) and the level of malondialdehyde was decreased in the tetramethylpyrazine group compared with the model group (P < 0.05). After 28 days of treatment, qRT-PCR and western blot assay showed that the mRNA and protein levels of glutathione peroxidase 4, ferritin heavy chain, and ferroportin in the rat spinal cord tissue in the model group were decreased compared with those in the sham-operated group (P < 0.05), while the mRNA and protein levels of glutathione peroxidase 4, ferritin heavy chain, and ferroportin in the rat spinal cord tissue in the tetramethylpyrazine group were increased compared with those in the model group (P < 0.05). Immunofluorescence staining showed that after 28 days of treatment, the neuronal nuclei positive staining in the spinal cord of rats was the most in the sham-operated group and the least in the model group. To conclude, tetramethylpyrazine can improve motor function and play a neuroprotective role in rats with spinal cord injury by regulating ferroptosis.

Key words: tetramethylpyrazine, spinal cord injury, ferroptosis, neuroprotective effect, oxidative stress

中图分类号:

陶经纬, 周婧雅, 赵毅, 任敬佩, 胡传宇, 徐林, 穆晓红, 范筱. 川芎嗪对脊髓损伤大鼠铁死亡的调控作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4158-4163.

Tao Jingwei, Zhou Jingya, Zhao Yi, Ren Jingpei, Hu Chuanyu, Xu Lin, Mu Xiaohong, Fan Xiao. Effect and mechanism of tetramethylpyrazine regulating ferroptosis in rats with spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(26): 4158-4163.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 36只大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠后肢运动能比较治疗前，各组大鼠BBB评分均为21分，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。治疗1，3，7 d，川芎嗪组大鼠BBB评分低于假手术组(P < 0.05)，与模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)；治疗14，21，28 d，川芎嗪组大鼠BBB评分低于假手术组(P < 0.05)，高于模型组(P < 0.05)，见图1。

2.3 各组大鼠脊髓形态观察结果苏木精-伊红染色显示，假手术组大鼠脊髓组织结构完整，未见缺损；模型组大鼠脊髓组织可见空洞形成，局部见坏死组织及炎性浸润，并伴有成纤维细胞形成；川芎嗪组大鼠脊髓组织缺损面积较小，炎性浸润及纤维组织形成少于模型组，见图2。

2.4 各组大鼠脊髓组织内铁离子沉积情况普鲁士蓝染色显示，假手术组大鼠脊髓组织内铁离子含量较少，未见阳性染色区域；模型组大鼠脊髓组织内可见较多阳性染色区域，脊髓组织结构欠完整；川芎嗪组大鼠脊髓组织内铁离子阳性染色区域少于模型组，见图3。

2.5 各组大鼠脊髓组织内氧化应激反应与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织内谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶水平降低(P < 0.05)，丙二醛水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，川芎嗪组大鼠脊髓组织内谷胱甘肽、超氧化物歧化酶水平升高(P < 0.05)，丙二醛水平降低(P < 0.05)，见图4。

2.6 各组大鼠组织内铁死亡相关蛋白的表达 Western blot检测显示，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织内GPX4、铁蛋白重链、铁输出蛋白的蛋白表达水平均降低(P < 0.05)；与模型组比较，川芎嗪组大鼠脊髓组织内GPX4、铁蛋白重链、铁输出蛋白的蛋白表达水平均升高(P < 0.05)，见图5。

2.7 各组大鼠脊髓组织内铁死亡相关蛋白的mRNA表达 qRT-PCR检测显示，与假手术组比较，模型组大鼠脊髓组织内GPX4、铁蛋白重链、铁输出蛋白的mRNA表达水平均降低(P < 0.05)；与模型组比较，川芎嗪组大鼠脊髓组织内GPX4、铁蛋白重链、铁输出蛋白的mRNA表达水平均升高(P < 0.05)，见图6。

2.8 各组大鼠脊髓神经元活性的比较免疫荧光染色显示，假手术组大鼠脊髓组织内NeuN+/DAPI+阳性染色最多，模型组大鼠脊髓组织内NeuN+/DAPI+阳性染色最少，见图7。

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引言

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，在世界范围内具有较高的发病率和死亡率[1-2]，研究表明全世界每年的脊髓损伤发病率从每百万人10.4例到83例不等[3]。临床治疗脊髓损伤主要包括手术减压、激素冲击疗法等[4]，但是脊髓损伤的病理生理机制较为复杂，目前的治疗方法难以取得理想的临床疗效[5]。药物干预主要针对炎症、自由基形成和细胞程序性死亡等继发性损伤阶段。最近的研究表明，铁离子超载、脂质过氧化和谷氨酸积累与脊髓损伤密切相关[6]。神经细胞铁死亡可能参与脊髓继发性损伤的病理生理过程，因此，调控神经细胞铁死亡对于脊髓损伤的治疗具有一定的指导意义。
铁死亡是一种新的细胞程序性死亡方式，铁死亡的作用机制主要为：细胞中的游离铁离子在脂氧合酶的催化下与细胞膜结构上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，破坏细胞的膜结构，从而导致细胞死亡[7]。铁死亡以过氧化物积累为重要的生物学标志[8]，研究发现中枢神经系统疾病与铁代谢紊乱存在密切联系[9]，如脑卒中、创伤性脑损伤等[10]。脊髓损伤后局部微血管被破坏、红细胞破裂，游离铁离子被释放到神经细胞微环境中造成铁代谢失调。过多的亚铁离子在神经细胞内引起芬顿反应，产生一定量的羟基自由基，羟基自由基进一步引起过氧化损伤，从而导致细胞铁死亡。谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)是一种铁死亡的关键调节因子，有学者研究认为GPX4的缺失会导致细胞抵抗脂质过氧化的修复能力减弱、铁离子的氧化性增强、多不饱和脂肪酸参与的氧化反应增强，最终导致细胞发生铁死亡现象[11]。同时GPX4也是一种谷胱甘肽依赖性酶，细胞内的氧化还原物如谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶的水平影响着GPX4的表达水平，直接影响细胞铁死亡。细胞内铁代谢系统包括铁储存蛋白-铁蛋白重链、铁输出蛋白，它们通过结合细胞内游离铁并将铁离子转运至细胞外，共同发挥铁代谢功能。因此，调控铁代谢及细胞脂质过氧化反应抑制铁死亡可能是脊髓损伤治疗的新靶点。
川芎是一种伞科植物，原产于中国四川省，《神农本草经》中最早记载其干燥根茎具有活血化瘀止痛的功效[12]。川芎嗪又名四甲基吡嗪，是中药川芎的有效成分[13]。研究表明，川芎嗪能够调控脂质代谢、炎症、血管新生等病理机制，川芎嗪还与调控血小板聚集及清除氧自由基有关，对多种心脑血管疾病具有治疗作用[14]。CHEN等[15]研究表明，川芎嗪能够通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ途径抑制活性氧、增强超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性来改善动脉粥样硬化。LIN等[16]研究表明，川芎嗪通过提高突触素水平和改善突触超微结构重塑来改善大脑中动脉闭塞大鼠的神经功能，从而起到神经保护作用。脊髓损伤后同样存在脂质过氧化反应所导致的神经细胞铁死亡现象[15]。川芎嗪对铁离子及脂质过氧化反应的调控作用可能是其神经保护作用的机制之一，并具有一定的研究价值。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。符合正态分布的数据采用单因素方差分析比较；方差齐则采用LSD检验事后比较，方差不齐采用Games-Howell检验。不符合正态分布的数据采用非参秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年3月在北京中医药大学逸夫科研楼完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物与分组雌性SD大鼠36只，SPF级，8周龄，体质量(220±20) g，购买于北京斯贝福生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0010，使用许可证号：SYXK (京)2020-0033。饲养于北京中医药大学动物房：22-24 ℃恒温饲养，湿度为50%，给予12 h明暗交替循环，食水充足获取。运用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组及川芎嗪组，每组12只，适应性喂养1周后进行实验。研究方案已经北京中医药大学伦理委员会批准，审批号为BUCM-2022042104-2098。
1.3.2 主要试剂及仪器盐酸川芎嗪注射液(哈尔滨三联药业股份有限公司，国药准字：H20030553)；苏木精-伊红染色液(索莱宝生物技术有限公司，北京，G1120)；普鲁士染色试剂盒(索莱宝生物技术有限公司，北京，G1422)；戊巴比妥钠(普博斯生物科技有限公司，北京，P3761)；丙二醛试剂盒(索莱宝生物科技有限公司，北京，BC0020)；超氧化物歧化酶试剂盒(索莱宝生物科技有限公司，北京，BC0170)；谷胱甘肽试剂盒(睿信生物科技有限公司，泉州，RX101420H)；总RNA提取试剂盒(索莱宝生物科技有限公司，北京，R1200)；通用反转录试剂盒(索莱宝生物科技有限公司，北京，RP1105)；Realtime PCR荧光定量试剂盒(索莱宝生物科技有限公司，北京，RP1110)；GPX4抗体(abcam公司，美国，ab125066)；铁输出蛋白抗体(abcam公司，美国，ab239511)；铁蛋白重链抗体(abcam公司，美国，ab183781)；普通PCR仪
(天隆生物技术有限公司，西安，Genesy 98T)；实时荧光定量PCR仪(雅瑞生物技术有限公司，苏州，MA-6000)；PVDF膜(Millipore，美国，IPV00010H)；电泳仪(Bio-rad，美国，1645070)；激光扫描共聚焦显微镜(Leica 公司，德国，TCS SP8)；NYU 脊髓打击器(WM.Keck 神经科学协作中心，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 脊髓损伤模型制备与分组干预按照课题组前期脊髓损伤打击模型制备方法，运用改良Allen’s法制备脊髓损伤大鼠模型[9]：腹腔注射1%戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉3组大鼠，麻醉完成后，通过骨性标志定位大鼠背部T9-T10棘突，备皮后用碘伏消毒局部皮肤。切开背部皮肤，钝性分离皮下筋膜层及肌肉组织，切除T10棘突及椎板，暴露脊髓组织，模型组、川芎嗪组使用NYU脊髓打击器在脊髓背侧正中2.5 cm的高度以10 g的砝码自由坠落，造成脊髓钝挫损伤。大鼠后肢痉挛、尾巴不自主扭动提示造模成功。假手术组仅暴露脊髓组织后立即逐层缝合。术后连续3 d给予青霉素20×104 U皮下注射，预防感染。每日按摩膀胱，辅助排尿3次，直至大鼠恢复自主排尿。
假手术组每日腹腔注射1.5 mL生理盐水；造模后，模型组大鼠每日腹腔注射1.5 mL生理盐水，川芎嗪组大鼠每日腹腔注射盐酸川芎嗪注射液(200 mg/kg)[17]，连续注射28 d。
1.4.2 取材治疗28 d后，将大鼠麻醉后从腹部白线处打开腹腔至横膈膜，剪开肋骨，暴露胸腔，钝性剥离心包膜。从心尖部灌注预冷的生理盐水300 mL，再灌注预冷的40 g/L多聚甲醛300 mL。以损伤中心为中点，分离长度约2 cm的脊髓组织，部分包埋在石蜡中，制成蜡块保存；部分放入冻存管内，于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 后肢运动功能Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分治疗前及治疗1，3，7，14，21，28 d，由2名实验人员独立运用BBB评分评估各组大鼠后肢运动功能，满分21分，显示后肢运动功能正常；0分，显示后肢无运动功能。评估后统计2人评估得分的平均值，作为最终统计数值。

1.4.4 脊髓组织形态观察取包埋有脊髓组织的蜡块，放入切片机，切片厚度为5 μm。将梯度脱蜡脱水的切片放入苏木精染液中，染色3-8 min；放入酸水及氨水中分色数秒，冲洗1 h，梯度乙醇脱水10 min；放入伊红染液中染色2.0-3.0 min；乙醇脱水二甲苯透明，滴加封固树脂，盖玻片封固，显微镜下观察脊髓组织形态。
1.4.5 脊髓组织内铁沉积情况取包埋有脊髓组织的蜡块，放入切片机，切片厚度为5 μm。将切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗后放入普鲁士蓝染液染色30 min；蒸馏水冲洗2遍，将切片放入核固红染液中染色5 min；将切片梯度脱水透明，中性树胶封固，显微镜下观察。使用Image J软件对蓝色阳性染色区域进行半定量分析，并对数据进行统计分析。
1.4.6 脊髓组织内氧化应激反应取冻存的大鼠脊髓组织，采用Elisa法检测谷胱甘肽、丙二醛、超氧化物歧化酶表达情况。取出所需反应板，加入100 µL标准品、100 µL样本于相应反应板孔中，37 ℃温育 60 min；用洗涤液洗涤反应板，反复洗涤5次；每孔分别加入100 µL×Biotin、1×HRP、TMB显色液分别孵育；每孔加入100 µL终止液，轻轻混匀30 s；30 min内在450 nm处读吸光度值，计算质量浓度。
1.4.7 Western blot检测铁死亡相关蛋白表达将大鼠脊髓组织从-80 ℃冰箱中取出，裂解20 min，4 ℃下12 000 r/min离心20 min，取上清。测定蛋白浓度，将样本以每孔10 μL上样，以每块胶80 V浓缩胶、120 V分离胶恒压电源电泳。将与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，浸泡于电转液中，4 ℃条件下转模，转模条件为200 mA 90 min。用含5%牛奶的TBST对PVDF膜封闭。分别滴加GPX4(1∶1 000)、铁蛋白重链(1∶1 000)、铁输出蛋白(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。将ECL试剂按比例混合，滴加于PVDF膜上显色并曝光。使用Image J软件分析灰度值。

1.4.8 qRT-PCR检测铁死亡相关基因表达将脊髓组织在trizol中匀浆，加入氯仿，4 ℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清液；加入200 μL无水乙醇，4 ℃下12 000 r/min离心2 min；加入600 μL漂洗液，4 ℃下12 000 r/min离心2 min；加入5 μL RNas Freedd H2O，室温下12 000 r/min离心2 min，测量RNA浓度。使用反转录试剂盒和qPCR试剂盒进行qRT-PCR检测。采用 2-ΔΔCt 法计算mRNA的相对含量。引物设计与合成由北京擎科生物科技股份有限公司完成。引物序列见表1。

1.4.9 免疫荧光检测脊髓神经元存活情况 60 ℃烤石蜡切片2 h，石蜡切片脱蜡至水；使用水浴锅沸热修复，使用0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=6.0)；体积分数3%H2O2室温孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性后，用PBS冲洗3次；5%-10%正常血清封闭30 min，除去封闭液；按1∶200比例滴加神经元特异性核蛋白(neuronal nuclei，NeuN)一抗，4 ℃孵育过夜，用PBS冲洗3次；加入荧光二抗，摇床缓慢孵育1 h，用PBS清洗3次，PBS清洗3次；DAPI复染核，PBS清洗3次；将切片干燥，用抗荧光淬灭封固剂封固，用共聚焦显微镜采集图像。使用Image J软件对阳性染色区域荧光强度进行半定量分析，并对数据进行统计分析。
1.5 主要观察指标各组大鼠BBB运动功能评分、脊髓组织形态、脊髓组织铁离子沉积、脂质过氧化物的表达、铁代谢及脊髓神经元存活情况。
1.6 统计学分析使用SPSS 20.0及GraphPad Prism 9.0进行统计分析。符合正态分布的数据采用单因素方差分析比较；方差齐则采用LSD检验事后比较，方差不齐采用Games-Howell检验。不符合正态分布的数据采用非参秩和检验。P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经北京中医药大学东直门医院生物统计学专家审核。

讨论

细胞程序性死亡是一种严格受到细胞信号调控的死亡过程，涉及到一系列基因的激活、表达、调控等生物学过程[18]。DIXON等[19]在2012年提出的一种全新的不同于凋亡、焦亡的细胞程序性死亡——铁死亡。铁死亡是以铁离子超载和脂质过氧化反应为主要病理表现的细胞死亡形式[20-21]。脊髓损伤后，损伤局部出现微环境改变，脊髓大量出血、红细胞积聚、细胞破裂，发生溶血现象，导致局部铁超载，应激还会激活一系列脂质过氧化反应，这些因素均可在脊髓损伤后诱发铁死亡。CHEN等[22]研究发现脊髓损伤与铁死亡密切相关。YAO等[10]研究发现脊髓损伤后存在铁死亡标志物的改变，给予去铁胺能够抑制铁死亡促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。以上研究结果提示，铁死亡现象广泛存在于脊髓损伤的病理过程中。
川芎是一种具有活血化瘀功效的中草药，其有效成分川芎嗪被广泛应用于多种心血管疾病及中枢神经系统疾病中。MENG等[23]研究发现川芎嗪具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗脂质过氧化等作用，在多种中枢神经系统疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等神经退行性疾病中均能发挥治疗作用。HUANG等[24]研究发现川芎嗪能够调控FasL、程序性细胞凋亡因子 4和磷酸酶和张力蛋白同源物等分子的表达，从而抑制神经细胞凋亡。CHEN等[22]研究发现川芎嗪能够通过调控抗氧化作用治疗脊髓损伤。据此推断川芎嗪能够通过调控脂质过氧化反应及铁离子代谢抑制神经细胞铁死亡，从而起到神经保护作用。
GPX4是一种含半胱氨酸的谷胱甘肽依赖性酶，它能够通过清除活性氧物质、保护线粒体结构，从而起到细胞保护作用[25]，是铁死亡的关键调节因子，其将谷胱甘肽转化为氧化谷胱甘肽，从而减少脂质过氧化和氧化应激损伤。在应激状态下，细胞膜的转运结构会抑制半胱氨酸进入细胞，从而使GPX4失活，升高活性氧物质的合成、减少谷胱甘肽的合成，导致铁死亡的发生[26]。因此，促进GPX4的合成能够促进谷胱甘肽及相关抗氧化物的合成，抵抗铁死亡引起的细胞膜结构破坏[27]。在此次研究中，脊髓损伤大鼠给予川芎嗪后，GPX4及抗氧化物谷胱甘肽、超氧化物歧化酶的水平相较于模型组升高，氧化物丙二醛水平相较于模型组降低，这说明了川芎嗪能够调控神经细胞的氧化还原反应，从而减少细胞因脂质过氧化反应而产生的铁死亡，起到神经保护作用，这与CHEN等[22]的研究结论一致。ZHOU等[28]研究发现，与川芎嗪相似，原花青素同样能够通过调节脊髓损伤后谷胱甘肽、GPX4等的表达，调控氧化还原作用，同时下调铁离子的水平，抑制神经细胞凋亡。
细胞内游离铁的水平(即不稳定铁池的水平)驱动着铁死亡的关键环节——芬顿反应的发生。芬顿反应的脂质过氧化底物与铁死亡的脂质过氧化反应密切相关。脊髓损伤后的局部微环境变化会导致铁离子蓄积，不稳定铁池失衡，铁离子的增加涉及谷胱甘肽系统和辅酶Q系统的抗氧化功能失衡，打破了细胞膜损伤和修复之间的平衡[29]，最终导致细胞铁死亡。铁输出蛋白和铁蛋白重链作为细胞内调节铁离子的重要分子[30]，分别调控了铁离子的蓄积和铁离子的输出，是调控应激状态下细胞内可变铁池的重要分子结构，同样作为生物标记物标志着铁死亡的发生。此次研究普鲁士蓝染色发现，川芎嗪能够改善脊髓损伤后脊髓组织的铁沉积，同时川芎嗪组大鼠的铁代谢相关蛋白铁输出蛋白、铁蛋白重链的表达高于模型组，提示川芎嗪能够调控脊髓损伤后的铁代谢水平。免疫荧光染色发现，川芎嗪组脊髓神经元数量高于模型组，且在苏木精-伊红染色中川芎嗪组大鼠脊髓灰质前角结构较模型组完整，脊髓空洞小于模型组，说明川芎嗪具有一定的抑制神经细胞死亡的作用。目前，已有研究发现多种化合物能够通过调控铁代谢调控脊髓损伤后的铁死亡现象。GONG等[31]研究发现，海藻糖能够通过调控铁代谢相关蛋白的表达抑制脊髓损伤后神经细胞死亡及炎症反应。GE等[32]运用铁抑素1治疗脊髓损伤大鼠，发现铁抑素1能够改善脊髓损伤后的铁沉积现象，这与川芎嗪调控铁代谢抑制脊髓损伤铁死亡的作用机制相似，间接说明了通过调控铁代谢能够抑制脊髓损伤后神经细胞的铁死亡现象。结合BBB运动功能评分可知，川芎嗪能够通过抑制铁死亡促进脊髓损伤后神经功能及运动功能的恢复。
综上所述，川芎嗪能够调控脊髓损伤大鼠铁代谢及脂质过氧化反应、调节细胞内铁离子平衡及抗氧化功能、抑制神经细胞铁死亡，从而发挥神经保护作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

川芎嗪对脊髓损伤大鼠铁死亡的调控作用及机制

Effect and mechanism of tetramethylpyrazine regulating ferroptosis in rats with spinal cord injury

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