改良Feeney自由落体法建立大鼠创伤性脑损伤模型

doi:10.12307/2024.451

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (26): 4164-4169.doi: 10.12307/2024.451

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

改良Feeney自由落体法建立大鼠创伤性脑损伤模型

高思淼1，2，吴晓光1，韩雪3，许士奇2，4，李葵花1，2，4，彭勇5，6

承德医学院，1河北省神经损伤与修复重点实验室，2生物医学工程系，4河北省医工结合国际研究中心，河北省承德市 067000；3承德医学院附属医院神经内科，河北省承德市 067000；燕山大学，5电气工程学院，6河北省智能康复及神经调控重点实验室，河北省秦皇岛市 066004

收稿日期:2023-07-17 接受日期:2023-08-09 出版日期:2024-09-18 发布日期:2023-09-28
通讯作者: 李葵花，硕士，副教授，硕士生导师，承德医学院，河北省神经损伤与修复重点实验室，生物医学工程系，河北省医工结合国际研究中心，河北省承德市 067000 彭勇，博士，教授，博士生导师，燕山大学，电气工程学院，河北省智能康复及神经调控重点实验室，河北省秦皇岛市 066004
作者简介:高思淼，女，1997年生，北京市人，承德医学院在读硕士，主要从事神经损伤修复研究。
基金资助:
河北省神经损伤与修复重点实验室开放课题(NJKF202305)，项目负责人：李葵花；河北省卫健委医学科学研究课题(20231558)，项目负责人：吴晓光；国家自然科学基金(81871029)

Establishment of a rat model of traumatic brain injury using the modified Feeney’s free-fall method

Gao Simiao1, 2, Wu Xiaoguang1, Han Xue3, Xu Shiqi2, 4, Li Kuihua1, 2, 4, Peng Yong5, 6

1Key Laboratory of Nerve Injury and Repair of Hebei Province, 2Department of Biomedical Engineering, 4International Research Center for Medical-Industrial Integration of Hebei Province, Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China; 3Department of Neurology, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China; 5School of Electrical Engineering, 6Key Laboratory of Intelligent Rehabilitation and Neuromodulation of Hebei Province, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, Hebei Province, China

Received:2023-07-17 Accepted:2023-08-09 Online:2024-09-18 Published:2023-09-28
Contact: Li Kuihua, Master, Associate professor, Master’s supervisor, Key Laboratory of Nerve Injury and Repair of Hebei Province, Department of Biomedical Engineering, International Research Center for Medical-Industrial Integration of Hebei Province, Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China Peng Yong, PhD, Professor, Doctoral supervisor, School of Electrical Engineering, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, Hebei Province, China; Key Laboratory of Intelligent Rehabilitation and Neuromodulation of Hebei Province, Yanshan University, Qinhuangdao 066004, Hebei Province, China
About author:Gao Simiao, Master candidate, Key Laboratory of Nerve Injury and Repair of Hebei Province, Department of Biomedical Engineering, Chengde Medical University, Chengde 067000, Hebei Province, China
Supported by:
the Open Project of Hebei Provincial Key Laboratory of Nerve Injury and Repair, No. NJKE202305 (to LKH); Medical Science Research Project of Hebei Provincial Health Commission, No. 20231558 (to WXG); National Natural Science Foundation of China, No. 81871029

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

Feeney自由落体法：通过开颅手术，将重锤自由下落的能量传递至硬脑膜引起皮质损伤。
创伤性脑损伤：由头部受到撞击、打击，或头部受到穿透性伤害，破坏了大脑的正常功能而造成的疾病。

背景：目前关于Feeney自由落体创伤性脑损伤模型，探讨减轻开颅过程中持续磨骨损伤因素的文献较少。

目的：通过改变开颅骨窗方式改良创伤性脑损伤大鼠模型。
方法：将36只SD大鼠随机平均分成假手术组、模型组和改良模型组。改良模型组造模过程中改良了开骨窗的方式，用小钻头磨骨钻低速2 m/s，在打击的损伤区域边缘打6-8个小孔，每圆孔直径为0.3-0.5 mm，感到空腔而不触及脑实质后立即抽出。改良模型组和假手术组采用改良后的方法开骨窗，模型组按常规开骨窗方法，实施的打击参数相同改良模型组；假手术组不实施打击。造模后第1天对大鼠进行mNSS评分；造模后第1，7天扫描T2WI磁共振成像，测量T2值；造模后第7天，苏木精-伊红染色病理切片观察脑组织形态学，并检测血液黏度和炎症因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平。

结果与结论：①造模后第1天，模型组、改良模型组大鼠mNSS评分均高于假手术组(P < 0.000 1)，改良模型组评分低于模型组(P < 0.000 1)；②造模后第1，7天，模型组、改良模型组T2值均高于假手术组(P < 0.05)，改良模型组T2值低于模型组(P < 0.05)；③造模后第7天，模型组和改良模型组的血液黏度值、白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平均高于假手术组(P < 0.05)，改良模型组白细胞介素6水平低于模型组(P < 0.05)；④基于Feeney自由落体法的创伤性脑损伤大鼠改良模型较好地控制了创伤性脑损伤大鼠造模中开颅骨的损伤因素。

https://orcid.org/0009-0004-3628-8533(高思淼)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 创伤性脑损伤, 动物模型改良, 行为学, 炎症因子, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: There is less report about mitigating sustained bone grinding injuries during craniotomy based on a model of traumatic brain injury established using the modified Feeney’s free-fall method.
OBJECTIVE: To modify a modified traumatic brain injury model by altering the opening of the skull window.
METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats were equally randomized into sham group, model group and modified model group. The modified procedure of opening the bone window was used in the modified model group. Six to eight small holes of 0.3-0.5 mm in diameter were punched at the edge of the impact area and the drill was immediately withdrawn without touching the cortex. In the modified model group, the skull window was opened by using the modified method, while the skull window in the model group was opened using the conventional method. The modified model group and model group were established using the Feeney’s free-fall method. In the sham group, only the skull window was opened without impact. The modified neurological severity scoring was performed at 1 day after modeling. T2 weighted imaging was performed and T2 values were measured at 1 and 7 days after modeling. Hematoxylin-eosin staining of the brain section was made for histopathological observation at 7 days after modeling. The level of blood viscosity, interleukin-6, interleukin-1β, and tumor necrosis factor-α were determined at 7 days after modeling.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the sham group, the modified neurological severity scores in the model group and modified model group were significantly increased at 1 day after modeling (P < 0.000 1). Meanwhile, the modified neurological severity scores in the modified model group were lower than those in the model group (P < 0.000 1). Compared with the sham group, the T2 values were significantly increased in the model group and modified model group at 1 and 7 days after modeling (P < 0.05), while the T2 values in the modified model group were lower than those in the model group (P < 0.05). Compared with the sham group, the level of blood viscosity, interleukin-6, interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were increased in the model group and modified model group at 7 days after modeling (P < 0.05), while the level of interleukin-6 in the modified model group was lower than that in the model group (P < 0.05). To conclude, establishing a modified traumatic brain injury model based on the Feeney’s free-fall method provides better controls of injury factors during cranial opening.

Key words: traumatic brain injury, animal model modification, behavioristics, inflammatory factor, rat

中图分类号:

高思淼, 吴晓光, 韩雪, 许士奇, 李葵花, 彭勇. 改良Feeney自由落体法建立大鼠创伤性脑损伤模型[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4164-4169.

Gao Simiao, Wu Xiaoguang, Han Xue, Xu Shiqi, Li Kuihua, Peng Yong. Establishment of a rat model of traumatic brain injury using the modified Feeney’s free-fall method[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(26): 4164-4169.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠造模后死亡率及体征
2.1.1 死亡率模型组造模过程中观察到1只大鼠硬膜下出血，假手术组、改良模型组造模过程中无出血情况。模型组造模后4 h有1只死亡；第1天有1只大鼠持续未苏醒，从实验中排除；第3天再有1只大鼠死亡，故模型组最终纳入实验动物数为9只(死亡率17%)；假手术组、改良模型组造模后无死亡情况(死亡率0)。
2.1.2 体质量及体征造模前各组大鼠体质量基线一致，差异无显著性意义[假手术组(225.97±5.61) g，模型组(223.00±4.50) g，
改良模型组(221.61±6.94) g]。造模后假手术组大鼠短时间内苏醒，恢复行走、饮食饮水等正常生理活动，协调性较好，恢复状态较快，第3天体质量稳定(227.83±6.46) g。模型组从昏迷到苏醒时间较长，苏醒后伴随步态紊乱、反应迟钝等现象，第3天饮食饮水频率低，与假手术组比较体质量下降[(215.65±7.88) g，P < 0.05]。与模型组相比，改良模型组苏醒时间短，苏醒后行走较稳定、反应较敏捷，第3天饮食饮水正常，体质量略有上升(217.71±7.60) g，差异无显著性意义。造模第7天取材中发现模型组大鼠2只脑组织中有血块聚集，其中1只大鼠顶叶损伤处有明显的出血现象，改良模型组无出血情况。
2.2 mNSS评分造模后第1天改良模型组和模型组大鼠mNSS评分均显著高于假手术组(P < 0.000 1)；改良模型组大鼠的评分显著低于模型组(P < 0.000 1)，见表1。

2.3 核磁成像模型评估结果造模后第1，7天对各组大鼠进行T2WI成像(见图2)，观察大鼠损伤部位磁共振图像并计算T2值，判别造模是否成功，结果显示右侧脑皮质均存在损伤现象。与假手术组相比，模型组、改良模型组大鼠脑皮质撞击边缘均出现结构异常并伴随高亮信号；第7天模型组、改良模型组影像与第1天相比皮质边缘信号亮度稍低，但仍出现损伤、周边组织结构异常；与改良模型组相比，模型组大鼠第1天可明显观察到撞击的大脑皮质部位出现异常结构和高亮信号，且周围的脑皮质部位出现条片状高亮信号。由表2可以看出，造模后第1，7天模型组和改良模型组大鼠T2值显著高于假手术组(P < 0.05)，改良模型组大鼠T2值低于模型组(P < 0.05)。

2.4 苏木精-伊红染色于造模后第7天取材，对各组大鼠脑组织切片进行苏木精-伊红染色(见图3)。造模后第7天，假手术组脑皮质细胞形态较为完整，胞质均匀。模型组、改良模型组均出现胞核深染现象，有神经元缺失、细胞核裂解和核固缩现象，细胞数量较少。模型组出现组织疏松现象，与改良组相比噬伊红现象、核固缩更为明显，还可看到脑组织有红细胞淤积现象。

2.5 血液黏度结果造模后第7天模型组和改良模型组的低、中、高切变率下全血黏度均高于假手术组(P < 0.05)，改良模型组的全血黏度与模型组相比差异无显著性意义；与假手术组相比，模型组血浆黏度显著升高(P < 0.05)；改良组血浆黏度与假手术组相比差异无显著性意义，但明显低于模型组(P < 0.05)，见表3。

2.6 ELISA炎症因子白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平检测于造模后第7天取材，ELISA法检测各组大鼠血浆炎症因子水平(见表4)。模型组与改良模型组的白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平显著高于假手术组(P < 0.05)。改良模型组白细胞介素6水平显著低于模型组(P < 0.05)，但未恢复到假手术组相应水平。

参考文献

[1] DE LUCA R, BONANNO M, RIFICI C, et al. Post-traumatic olfactory dysfunction: a scoping review of assessment and rehabilitation approaches. Front Neurol. 2023;14:1193406.
[2] 周建国,唐华民.创伤性脑损伤动物模型的研究进展[J].医学研究生学报,2019,32(5):546-551.
[3] ACKERMANS NL, VARGHESE M, WICINSKI B, et al. Unconventional animal models for traumatic brain injury and chronic traumatic encephalopathy. J Neurosci Res. 2021;99(10):2463-2477.
[4] PENG Y, ZHAO Y, HUANG Y, et al. Neuroprotective effects of low-intensity transcranial ultrasound stimulation combined with Baicalin intervention on traumatic brain injury in animals.Brain Res Bull. 2021; 175:246-253.
[5] HARRIS JP, MIETUS CJ, BROWNE K, et al. Neuronal Somatic Plasmalemmal Permeability and Dendritic Beading Caused By Head Rotational Traumatic Brain Injury in Pigs-An Exploratory Study. ront Cell Neurosci. 2023;17:1055455.
[6] FEENEY DM, BOYESON MG, LINN RT, et al. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 1981;211(1):67-77.
[7] 万佳.创伤性脑损伤动物模型的研究进展[J].系统医学,2022,7(10): 179-182.
[8] 刘媛, 王莉, 曾琳, 等. 一种改良的创伤性脑损伤模型的建立[J].中国临床神经外科杂志,2008,13(7):416-419.
[9] 李娜, 王瑞辉, 郭婕, 等. 电针对创伤性颅脑损伤大鼠炎症因子表达及神经功能的影响[J].陕西中医,2021,42(10):1358-1362.
[10] WANG Y, ZHAO W, JIANG ZL, et al. Intervention effects of miR-125b-5p on cognitive dysfunction induced by traumatic brain injury in rats and its mechanisms. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi. 2022;38(5):424-429.
[11] CHEN J, SANBERG PR, LI Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke. 2001;32(11):2682-2688.
[12] HARRIS JP, MIETUS CJ, BROWNE K, et al. Neuronal somatic plasmalemmal permeability and dendritic beading caused by head rotational traumatic brain injury in pigs-An exploratory study. Front Cell Neurosci. 2023;17:1055455.
[13] DUHAIME AC. Large animal models of traumatic injury to the immature brain. Developmental neuroscience. 2006;28(4-5):380-387.
[14] KAWON K, SETKOWICZ Z, DROZDZ A, et al. The methods of vibrational microspectroscopy reveals long-term biochemical anomalies within the region of mechanical injury within the rat brain. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 2021;263:120214.
[15] ODDO M, CRIPPA IA, MEHTA S, et al. Optimizing sedation in patients with acute brain injury. Crit Care. 2016;20(1):128.
[16] 马建军,何新泽,王浩琪,等.不同位置脑损伤模型大鼠坐骨神经的再生[J].中国组织工程研究,2017,21(36):5806-5811.
[17] FLIERL MA, STAHEL PF, BEAUCHAMP KM, et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 2009;4(9): 1328-1337.
[18] FODA MAAE, MARMAROU A. A new model of diffuse brain injury in rats: Part II: Morphological characterization.J Neurosurg. 1994;80(2): 301-313.
[19] ALBERT-WEIßENBERGER C, VÁRRALLYAY C, RASLAN F, et al. An experimental protocol for mimicking pathomechanisms of traumatic brain injury in mice. Exp Transl Stroke Med. 2012;4:1.
[20] KUNDU S, SINGH S. What happens in TBI? A wide talk on animal models and future perspective. Curr Neuropharmacol. 2023;21(5):1139-1164.
[21] STATEMENTS Q. VA/DoD clinical practice guideline for management of concussion/mild traumatic brain injury. J Rehabil Res Dev. 2009; 46(6):CP1-68.
[22] JIANG J, BU X, LIU M, et al. Transplantation of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells for traumatic brain injury. Neural Regen Res. 2012;7(1):46-53.
[23] ZHAO J, CHEN N, SHEN N, et al. Transplantation of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells to treat a rat model of traumatic brain injury. Neural Regen Res. 2012;7(10):741-748.
[24] 陈林, 杨翊, 刘经星, 等. 颅脑外伤实验动物运动方式的选择及神经功能评估研究进展[J]. 中华物理医学与康复杂志,2019,41(1): 76-78.
[25] 刘若尘, 吴涛, 王瑞辉, 等. 电针对创伤性颅脑损伤大鼠神经功能及损伤区脑组织p-JNK和Beclin-1表达的影响[J].针刺研究,2023, 48(5):475-480.
[26] ZHENG T, DU J, YUAN Y, et al. Effect of low intensity transcranial ultrasound (LITUS) on post-traumatic brain edema in Rats: evaluation by isotropic 3-dimensional T2 and multi-TE T2 weighted MRI. Front Neurol. 2020;11:578638.
[27] NAUMENKO Y, YURYSHINETZ I, ZABENKO Y, et al. Mild traumatic brain injury as a pathological process. Heliyon. 2023;9(7):e18342.
[28] 刘港, 邓博文, 蒋昇源, 等. 川芎嗪改善脊髓完全横断大鼠血液流变学指标的动态观察[J].中国组织工程研究,2023,27(2):282-286.
[29] 陈春富, 郭述苏, 樊红, 等. 高粘血症患者血液流变性与脑血流的相关研究[J].中国血液流变学杂志,1995,5(2):38-39.
[30] EKMARK‐LEWÉN S, FLYGT J, FRIDGEIRSDOTTIR GA, et al. Diffuse traumatic axonal injury in mice induces complex behavioural alterations that are normalized by neutralization of interleukin‐1β. Eur J Neurosci. 2016;43(8):1016-1033.
[31] TUTTOLOMONDO A, PECORARO R, PINTO A. Studies of selective TNF inhibitors in the treatment of brain injury from stroke and trauma: a review of the evidence to date. Drug Des Devel Ther. 2014;8: 2221-2238.
[32] BOURAS M, ASEHNOUNE K, ROQUILLY A. Immune modulation after traumatic brain injury. Front Med (Lausanne). 2022;9:995044.
[33] LIU YY, LI Y, WANG L, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes regulate microglia phenotypes: a promising treatment for acute central nervous system injury. Neural Regen Res. 2023;18(8):1657-1665.
[34] 尹洁. 脑外伤致大鼠血液黏度、脑细胞NGB表达变化及其相关性的研究[D].兰州:兰州大学,2008.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，单因素方差分析和事后检验。
1.2 时间及地点实验于2023年3-6月在承德医学院基础研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 36只6周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量201-225 g，购自北京维通利华实验动物有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0011。实验室内环境温度(25±2) ℃，湿度(54±2)% ，昼夜周期标准12 h 交替。动物实验方案由承德医学院动物实验伦理委员会审批通过(审批号：CDMULAC- 20230310-002)。实验期间严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》并严格遵从实验动物保护法规施行。
1.3.2 实验药品、试剂及仪器白细胞介素6酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒、白细胞介素1β ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子α ELISA试剂盒(北京索莱宝)；数字显示脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)、磨骨钻(上海豪海设备有限公司)、3.0 T磁共振成像(MRI)仪(美国GE)、LBY-N6K全自动自清洗血流变仪检测(上海普利生)、光学显微镜(日本Olympus)、石蜡切片机(美国 Thermo)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 36只SD大鼠使用随机数表法，编号、称质量。将大鼠随机分到假手术组、模型组和改良模型组(n=12)。

1.4.2 模型制备依据先前PENG等[4]的打击方式建立大鼠Feeney自由落体脑损伤模型，并进行改良。1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠俯卧位置于脑立体定位仪上，用小钻头磨骨钻低速2 m/s，以脑中线旁2.5 mm、前囟后1.5 mm 为中心，直径约5 mm在打击的损伤区域边缘依次打6-8个小孔，每圆孔直径为0.3-0.5 mm，感到空腔而不触及脑实质后立即抽出，见图1。用手术镊将每2个小孔间夹出一道缝隙，轻轻剥离颅骨，不破坏硬脑膜。打击装置参数如下：重力锤20 g，打击高度为20 cm，深度5 mm。将重力锤打在中间直径约5 mm的损伤区，撞击完成后迅速抬起撞击杆。模型组按常规开骨窗方法，持续磨骨至暴露硬脑膜，打击装置参数与改良模型组设定一致。假手术组手术流程与改良模型组一致，实施开颅、开骨窗，但不对脑皮质实施打击。造模后第7天麻醉大鼠后取材。

1.5 主要观察指标
1.5.1 大鼠死亡率及体征观察造模过程中硬膜出血情况，造模后持续观察大鼠行为、体质量等体征，记算死亡率。

1.5.2 mNSS评分造模后第1天，依据mNSS评分表对大鼠神经功能缺损进行评分并记录数据[11]。从运动试验、感觉试验、平衡试验、反射试验方面对各组大鼠进行评估，分值为0-18分，得分越高，则神经功能缺损越严重。

1.5.3 磁共振成像分别于造模后第1天和第7天检测创伤大鼠T2WI核磁成像，每组取6只大鼠测量T2值。1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠。麻醉成功后将大鼠固定于机床上核磁线圈内，采用头先进俯卧位定位，采集大鼠T2WI成像。MRI扫描参数如下：松弛时间(TR)6 248 ms，回波时间(TE)120 ms，视场(FOV)8 cm2，矩阵256×256，层厚2 mm，层数20，扫描时间138 s。在GE工作站阅片，观察和评估造模结果，记录损伤区域T2值，T2值测量感兴趣区域(ROI)2 mm×2 mm。
1.5.4 血液黏度检测造模后第7天，每组随机选取6只大鼠血液样本，采用全自动自清洗血流变仪检测血液黏度。取血后于室温下静置 10-20 min，测定前对血样进行充分混匀，检测各组全血黏度低切(20/s)、中切(60/s)、高切(150/s)和血浆黏度，分析血液流变学变化情况。
1.5.5 ELISA炎症因子检测造模后第7天，每组随机选取6只大鼠血浆样本，使用ELISA试剂盒检测大鼠血浆中的白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α水平，以上因子的检测步骤严格按照试剂盒操作。
1.5.6 苏木精-伊红染色造模后第7天戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，取大鼠脑组织损伤部位制作大鼠冠状位石蜡切片。将石蜡切片放置在烤箱中烘烤1 h，温为60 ℃。烘烤后经二甲苯、梯度乙醇进行脱蜡处理。脱蜡后将切片染色：苏木精染色液5 min，水冲洗2 min，分化液分化2-10 s，水冲洗2 min，返蓝液30 s，水冲洗2 min，伊红染色液1 min。梯度乙醇、二甲苯将切片脱水透明，用中性树胶封固。在光学显微镜下观察苏木精-伊红染色切片。
1.6 统计学分析统计方法经承德医学院生物统计学专家审核。采用SPSS 25.0软件进行统计分析，计量资料均采用x±s表示，进行单因素方差分析和事后检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前创伤性脑损伤的研究重点是找到一种有效治疗方法，以促进神经再生和脑保护[12]。创伤性脑损伤动物模型通常被用来研究和探寻治疗创伤性脑损伤的方法，研究其治疗机制。创伤性脑损伤模型有多种造模方法，常见的有液体冲击损伤模型[13]、受控皮质撞击模型[14]、自由落体模型[6]、爆炸创伤模型等[15]。此外，创伤性脑损伤模型还可合并多种损伤或并发症模型，如脑损伤并发坐骨损伤神经损伤[16]。在单一创伤性脑损伤模型中，自由落体模型因其成本低、易于操作[7]，较多的研究采用此方法造模。然而自由落体模型也存在一定局限性，如Shohami自由落体模型采取不开骨窗的手术方法，造成闭合创伤性脑损伤，但它的局限性是造成的创伤性脑损伤较轻，且容易造成颅骨骨折[17]。Marmarou模型中采取的建模方式同样为不开骨窗，在头骨上放一个保护性垫片后打击颅骨[18]，尽管该模型中有了保护性措施，但还是有很大概率造成颅骨骨折，从而导致大鼠的较高致死率，且复现效果较差[19]。Feeney自由落体模型有较好的复现性和致伤程度可控性[20]，但该模型需要开骨窗，持续用磨骨钻开颅骨的步骤带来的热效应、震动等损伤额外因素影响造模效果[6]，持续高速磨骨钻虽然速度快，但不易控制，由于骨渣渗入易造成出血、损伤脑实质，这些额外的致伤因素会不可控地增加创伤性脑损伤模型大鼠的死亡率。此次研究采用Feeney自由落体改良模型，改良开颅骨的方式，低速磨骨钻开小孔未触及硬脑膜时立刻取出，在损伤范围内按此方法依次开6-8孔，再剥离颅骨。应用此改良方法可以减轻开颅骨时带来的触及脑实质出血、持续磨骨导致的热效应和震动等额外损伤。
在临床上，医生评估创伤性脑损伤患者根据多指标划分，如意识丧失时间、哥斯拉昏迷评分，以及大脑结构和功能成像(如CT和MRI)[21]。此次研究依据这些指标，进行创伤性脑损伤后大鼠的模型效果评估，从行为学评分、磁共振成像、病理切片等角度考察，可以综合判断模型组、改良模型组脑组织、神经、运动功能等损伤情况的差异[22-23]。结果显示，改良模型组应用改良开颅骨的方式，以高度20 cm、重力锤20 g、深度5 mm的打击参数造模，大鼠术后均存活，且无硬膜出血；而模型组大鼠在术中有硬膜下出血现象，先后在造模后第1，3天出现死亡及未苏醒情况，且第7天取材时发现了2只大鼠有血块淤积现象。这些情况提示此次研究中改良模型较好地控制了大鼠的死亡率和硬膜出血的现象，降低了额外损伤。研究应用mNSS评分在造模后第1天评估了大鼠的神经功能，mNSS评分可从不同角度整体评估神经功能的缺损程度，它包括运动、感觉、平衡和反射4方面，得分越高，功能障碍越严重，可较直观反映大脑损伤程度，是常用于脑外伤等神经疾病动物模型的研究[24]。用此次研究中改良的方法，造模第1天各模型组大鼠评分高于假手术组，说明大鼠在第1天出现了神经功能缺损现象，与刘若尘等[25]的结果近似；改良模型组大鼠评分显著低于模型组，说明造模第1天改良模型大鼠虽出现了一定程度的神经缺损，但程度低于模型组。通过T2WI核磁影像观察到不同时期改良模型组和模型组大鼠受到创伤后脑皮质变形较为明显，损伤部位影像中周边组织有局部位移、高亮信号等现象，影像学信息提示大鼠呈现局部创伤性损伤。模型组大鼠的脑白质部位呈片状高亮信号，提示出现了水肿或出血情况，这可能是由于颅骨钻持续磨骨额外带来的损伤所致，并产生了持续的影响。T2加权成像的T2值表示组织中水含量的多少，T2值越高，说明水含量越多，常用于观察脑组织病变中的水肿情况[26]。此次研究发现第1，7天改良模型组T2值比模型组较低，说明磁共振影像中模型组大鼠的水肿情况与改良模型组相比较严重。苏木精-伊红染色可在细胞层面观察大鼠神经元的损伤情况，结果观察到第7天假手术组皮质较为完整，无明显损伤现象；与之对比，模型组皮质出现神经元缺失、细胞核裂解和核固缩等现象，与刘媛等[8]的研究结论近似；与改良模型组相比，模型组还出现了红细胞堆积现象，且组织疏松较为严重。以上结果表明，自由落体冲击导致了改良模型组大鼠局部脑组织形变，从而在mNSS评分上观察到了神经缺损，磁共振影像上观察到了组织结构异常和高亮信号，病理切片上观察到了神经元的破坏和缺失，模型的改良方法有效，可成功建立创伤性脑损伤模型。Feeney模型由于持续磨骨带来的热效应和震动等损伤，叠加在创伤性损伤的基础之上，增加了多种额外的致伤因素，使脑损伤的程度加重，而改良Feeney模型可减轻持续磨骨带来的非冲击损伤，在有效控制脑损伤的同时，还降低动物死亡率。
创伤性脑损伤可分为原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是不可逆的，因此研究大多着眼于继发性损伤。继发性损伤是细胞和分子水平上的损害，如缺血导致细胞死亡、脑水肿加剧以及血脑屏障的损坏[27]。血液流变学、炎症因子等指标可以反映创伤性脑损伤继发性损伤的病理生理变化过程和分子机制。血液流变学中全血黏度在高切变率下反映红细胞的变形能力，而低切变率下则反映红细胞聚集性[28]。血液流变学指标变化越显著，如血液黏度的提高提示脑损伤程度越重[29]。创伤性脑损伤后继发性损伤可激活身体内的炎症反应[30]，当脑血屏障被破坏时，外周炎症因子可进入和浸润脑组织，对脑组织再次造成损伤[31]，其中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等炎症因子水平可反映炎症反应程度[32]，而降低损伤大鼠的白细胞介素1β浓度可促进神经恢复[33]。此次研究显示，低、中、高切变率下脑损伤大鼠的全血黏度均高于假手术组，尹洁[34]在实验中也同样得到脑外伤致大鼠的血液黏度升高。此次研究中各模型组中白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α的质量浓度均高于假手术组，与李娜等[9]的研究近似。模型组大鼠白细胞介素6的质量浓度高于改良模型组，可能是模型组水肿程度增加、硬膜下出血、红细胞堆积等额外情况促进了大鼠部分炎症因子浓度变化。以上结果说明，此次研究中应用的改良模型减能使创伤大鼠的血液流变学指标改变和炎症反应发生，与模型组相比减轻了额外损伤带来的炎症反应，可以用于脑损伤治疗的机制研究。实验结果提示创伤性脑损伤后因水肿使神经元缺失和死亡，从而导致了神经功能缺损，可能与血液流变学变化、白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α炎症因子的浓度增加相关。
此次研究成功改良了Feeney自由落体模型中开颅骨的方法，但有以下几点局限性：①只观察到造模后第7天的指标结果，后续研究可增加时间长度，持续观察创伤性脑损伤后继发性损伤对动物脑部的长期影响；②缺乏指标的动态变化，故不能详细反映损伤情况，后续将进一步增加研究的时间节点观察多个时间点的大鼠脑损伤情况；③实验大鼠的数量较少，未来将增加大鼠数量，并在后续的研究增加脑水肿等蛋白标致物的测量，以探讨大鼠脑损伤的机制。
综上所述，该研究利用Feeney自由落体模型改良方法，尽可能控制创伤性脑损伤大鼠造模中由于开颅骨造成的损伤因素，减轻造模过程中颅骨磨损造成的额外损伤。依托于Feeney自由落体模型具有较好的重复性特点，增加此改良方法可更好地减少开颅的风险因素，降低大鼠的死亡率，从而建立风险因素更加可控的模型。此改良模型可导致大鼠脑皮质损伤，对大鼠行为学、磁共振影像、病理染色和炎症因子均产生一定影响，因此，此次研究的改良模型可以用于后续对脑创伤的神经功能缺损和损伤机制的研究。未来将应用此模型研究治疗创伤性脑损伤的有效方法及治疗机制，更好地为临床研究提供依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

改良Feeney自由落体法建立大鼠创伤性脑损伤模型

Establishment of a rat model of traumatic brain injury using the modified Feeney’s free-fall method

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王伟庆, 周越. 慢性炎症调控脂肪组织的纤维化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1307-1312.
[2]	岳云, 王佩佩, 袁兆鹤, 何生存, 贾戌生, 刘倩, 李占涛, 付慧玲, 宋斐, 贾孟辉. 巴豆霜干预脑缺血再灌注损伤大鼠皮质区JNK/p38 MAPK及神经元凋亡的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1186-1192.
[3]	赵嘎日达, 任逸众, 韩长旭, 孔令跃, 贾岩波. 蒙药额尔敦-乌日勒修复骨关节炎大鼠模型的机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1193-1199.
[4]	阮蓉, 娄旭佳, 金其贯, 章立冰, 徐尚, 胡玉龙. 白藜芦醇可调控运动性疲劳大鼠的糖异生[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1229-1234.
[5]	乔虎军, 王国祥. 白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 516-521.
[6]	陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.
[7]	姜煜, 徐林, 赵亚林, 刘港, 张亚奇, 白惠中, 任敬佩, 曾杰, 穆晓红. 舒筋健脑方对缺血缺氧脑瘫模型大鼠细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4477-4483.
[8]	尹林伟, 黄夏荣, 孙光华, 刘静, 钟培瑞, 王金玲, 陈佳倩, 文幸, 甘邵婷, 胡文韬, 李萌萌, 周君. 脉冲电磁场可抑制老年大鼠膝关节软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4522-4527.
[9]	关金琦, 孙萍萍, 边静, 闫雪, 张为民. 天麻素干预可减轻缺血性脑卒中大鼠的炎症损伤[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4535-4540.
[10]	王绍娜, 高晨, 樊飞燕, 刘飞祥, 张运克. 中药及间充质干细胞调控免疫反应治疗肌萎缩侧索硬化症的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4087-4093.
[11]	万俊, 白艳杰, 王岩, 陈淑颖, 陈丽敏, 肖雨倩, 孙可心. 长链非编码RNA与缺血性脑卒中后的神经免疫炎症及相关信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3265-3271.
[12]	李荀, 张伟超, 李英杰, 柳荣, 田雪文, 张鹏翼, 王孝强. 中等强度运动对去卵巢大鼠骨组织自噬水平的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3130-3136.
[13]	姬卫秀, 白毅, 王硕, 赵云罡. 3-硝基-N-甲基水杨酰胺对肢体缺血再灌注损伤大鼠骨骼肌的保护作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3164-3169.
[14]	陈思敏, 胡颖俊, 闫文睿, 冀乐, 邵梦丽, 孙泽, 郑红星, 祁珊珊. 链脲佐菌素诱导糖尿病脑病大鼠模型的构建及评价[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(2): 237-241.
[15]	张萍萍, 梁婷婷, 范明松, 陈黎, 张世昌. 旋转生物反应器内球形体培养对人胎盘间充质干细胞炎症因子分泌的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3012-3017.