舒筋健脑方对缺血缺氧脑瘫模型大鼠细胞凋亡的影响

doi:10.12307/2024.395

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (28): 4477-4483.doi: 10.12307/2024.395

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舒筋健脑方对缺血缺氧脑瘫模型大鼠细胞凋亡的影响

姜煜1，徐林1，赵亚林2，刘港1，张亚奇1，白惠中1，任敬佩1，曾杰3，穆晓红1

1北京中医药大学东直门医院，北京市 100007；2北京市丰台康复医院，北京市 100161；3重庆市中医院，重庆市 400011

收稿日期:2023-05-30 接受日期:2023-07-04 出版日期:2024-10-08 发布日期:2023-11-27
通讯作者: 穆晓红，博士，教授，主任医师，北京中医药大学东直门医院，北京市 100007
作者简介:姜煜，女，1999年生，山东省青岛市人，汉族，北京中医药大学在读硕士，主要从事中西医结合骨伤、脑性瘫痪的研究。
基金资助:
北京市自然科学基金面上项目(7222281)，项目负责人：穆晓红

Effects of Shujin Jiannao Prescription on cell apoptosis in rats with hypoxic-ischemic brain injury

Jiang Yu1, Xu Lin1, Zhao Yalin2, Liu Gang1, Zhang Yaqi1, Bai Huizhong1, Ren Jingpei1, Zeng Jie3, Mu Xiaohong1

1Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100007, China; 2Fengtai Rehabilitation Hospital of Beijing Municipality, Beijing 100161, China; 3Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400011, China

Received:2023-05-30 Accepted:2023-07-04 Online:2024-10-08 Published:2023-11-27
Contact: Mu Xiaohong, MD, Professor, Chief physician, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100007, China
About author:Jiang Yu, Master candidate, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100007, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Beijing (General Program), No. 7222281 (to MXH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

脑性瘫痪：简称“脑瘫”，指在大脑发育未成熟阶段由于早产、难产、窒息及黄疸等原因引起的非进行性脑损伤，主要表现为姿势异常和运动障碍。
细胞凋亡：指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞凋亡是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。

背景：围产期缺血缺氧性脑损伤是脑性瘫痪发生的最常见原因之一。舒筋健脑方是北京中医药大学东直门医院骨科治疗脑瘫、改善脑部供血的经验方剂。

目的：探讨舒筋健脑方改善脑性瘫痪缺血缺氧的作用机制。
方法：采用64只新生7 d龄SD大鼠，随机分为6组，对照组、模型组各12只，米诺环素组、舒筋健脑方低、中、高剂量组各10只。除对照组外，其余各组建立新生大鼠缺血缺氧脑瘫模型。造模成功后的药物组大鼠分别进行米诺环素、舒筋健脑方各剂量[4，8，16 g/(kg·d)]灌胃，每日1次，持续1周。给药前后测量各组大鼠的体质量，检测行为学变化，苏木精-伊红染色观察大鼠脑组织海马CA1区组织形态，免疫组化和Western Blot检测大鼠脑组织Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达水平。

结果与结论：①体质量：与模型组比较，舒筋健脑方中、高剂量组大鼠体质量得到显著增加(P < 0.05)；②行为学：与模型组比较，米诺环素组大鼠有效延长了悬吊时间(P < 0.05)，舒筋健脑方中、高剂量组大鼠有效延长了悬吊时间、缩短了倾斜板实验时间、提升了Longa评分(P < 0.05)；③组织形态：药物组大鼠脑组织仅少量神经细胞坏死形成，细胞排列较整齐，细胞结构较为完整，只部分细胞核变小；④免疫组化和Western Blot结果：与模型组比较，米诺环素组、舒筋健脑方中、高剂量组Bax和Caspase-3的表达减少(P < 0.05)，舒筋健脑方中、高剂量组Bcl-2表达增加(P < 0.05)，米诺环素组、舒筋健脑方各剂量组Bcl-2/Bax蛋白表达增加(P < 0.05)，蛋白表达量随舒筋健脑方的剂量增加而增加，且舒筋健脑方高剂量组与米诺环素组作用差异无显著性意义(P > 0.05)；⑤结果说明，舒筋健脑方治疗缺血缺氧脑瘫大鼠的机制可能是提升抗凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制促凋亡蛋白Bax的表达，降低Caspase-3的蛋白表达，最终抑制脑瘫大鼠海马组织细胞凋亡；舒筋健脑方在一定范围内，剂量越高治疗效果越好，且高剂量使用疗效不亚于米诺环素。

https://orcid.org/0009-0002-0186-7231(姜煜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 脑性瘫痪, 舒筋健脑方, 细胞凋亡, 缺血缺氧脑损伤, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Perinatal hypoxic-ischemic brain injury is one of the most common causes of cerebral palsy. Shujin Jiannao Prescription is an experienced formula for treating cerebral palsy and improving blood supply to the brain developed by the Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine.
OBJECTIVE: To explore the possible mechanism of Shujin Jiannao Prescription in treating hypoxic-ischemic cerebral palsy.
METHODS: Sixty-four 7-day-old Sprague-Dawley rats were randomly divided into six groups. There were 12 rats in each of the control and model groups as well as 10 animals in each of the minocycline group, and the low-, medium-, and high-dose groups of Shujin Jiannao Prescription. The neonatal rat ischemic-hypoxic cerebral palsy model was established in all groups except for the control group. After successful modeling, rats in each drug group were respectively gavaged with minocycline and Shujin Jiannao Prescription at a dose of 4, 8, and 16 g/kg per day for 1 week. Body mass of rats was measured and behavioral changes were detected before and after drug administration. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the histomorphology of hippocampal CA1 region of rat brain tissue, and immunohistochemistry and western blot were used to detect the expression levels of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in the brain tissue of rats.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, medium- and high-dose Shujin Jiannao Prescription significantly increased the body mass of rats (P < 0.05). Compared with the model group, minocycline effectively prolonged the suspension time of ischemic-hypoxic cerebral palsy rats (P < 0.05), while medium- and high-dose Shujin Jiannao Prescription significantly prolonged the suspension time, shortened the inclined plane test time, and increased the Longa score of rats (P < 0.05). The pathological results showed that after drug intervention, only a small number of neuronal cells in the brain tissue of rats were necrotic, the cells were more neatly arranged, the cell structure was more complete, and only part of the cell nuclei became smaller. Compared with the model group, minocycline and medium- and high-dose Shujin Jiannao Prescription reduced the expression of Bax Caspase-3 (P < 0.05), medium- and high-dose Shujin Jiannao Prescription increased the expression of Bcl-2 (P < 0.05), and Bcl-2/Bax protein expression was increased in minocycline and three Shujin Jiannao Prescription groups (P < 0.05). In addition, the protein expression was increased in a dose-dependent manner after intervention with Shujin Jiannao Prescription, and there was no significant difference between the minocycline and three Shujin Jiannao Prescription groups (P > 0.05). To conclude, the mechanism by which Shujin Jiannao Prescription treats ischemic-hypoxic cerebral palsy in rats may be to enhance the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2, inhibit the expression of pro-apoptotic protein Bax, and reduce the expression of Caspase-3, ultimately inhibiting the apoptosis of hippocampal neuronal cells in rats with cerebral palsy. Within a certain range, the higher dose of Shujin Jiannao Prescription indicates the better therapeutic effect, and the high-dose Shujin Jiannao Prescription is as effective as minocycline.

Key words: cerebral palsy, Shujin Jiannao prescription, apoptosis, hypoxic-ischemic brain injury, rat

中图分类号:

姜煜, 徐林, 赵亚林, 刘港, 张亚奇, 白惠中, 任敬佩, 曾杰, 穆晓红. 舒筋健脑方对缺血缺氧脑瘫模型大鼠细胞凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4477-4483.

Jiang Yu, Xu Lin, Zhao Yalin, Liu Gang, Zhang Yaqi, Bai Huizhong, Ren Jingpei, Zeng Jie, Mu Xiaohong. Effects of Shujin Jiannao Prescription on cell apoptosis in rats with hypoxic-ischemic brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(28): 4477-4483.

图/表（结果） 12

2.1 实验动物数量分析实验选用的对照组12只SD大鼠及造模成功的52只SD大鼠，实验过程均无死亡，全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠体质量比较见表1。术前7 d龄SD大鼠各组的体质量差异无显著性意义(P > 0.05)，说明各组大鼠基线水平一致，具有可比性。术后灌胃1周检测体质量，与对照组相比，模型组、米诺环素组及舒筋健脑方低剂量组大鼠体质量显著减少(P < 0.05)；与模型组相比，舒筋健脑方中剂量组和高剂量组大鼠体质量显著增加(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方低剂量组体质量显著减少(P < 0.05)。

2.3 各组大鼠行为学评分比较
2.3.1 悬吊实验结果见表2。依据悬吊实验评分标准，悬吊时间越长评分越高。术后24 h对照组大鼠悬吊实验评分明显高于其他各组(P < 0.05)；模型组与各用药组大鼠评分差异无显著性意义(P > 0.05)，说明造模成功。术后灌胃1周与对照组相比，模型组、舒筋健脑方低剂量组评分显著减少(P < 0.05)；与模型组相比，米诺环素组、舒筋健脑方中、高剂量组评分显著增加(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方低剂量组评分显著减少(P < 0.05)。

2.3.2 倾斜板实验见表3。术后24 h对照组大鼠倾斜实验时间明显短于其他各组(P < 0.05)；模型组与各用药组大鼠倾斜实验时间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，说明造模成功。术后灌胃1周，与对照组相比，模型组、舒筋健脑方低剂量组大鼠倾斜实验时间显著延长(P < 0.05)；与模型组相比，舒筋健脑方中、高剂量组倾斜实验时间显著缩短(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方低剂量组倾斜实验时间显著延长，舒筋健脑方中、高剂量组时间显著缩短(P < 0.05)。

.3.3 Longa评分结果见表4。术后24 h对照组大鼠Longa评分为0，其他各组大鼠评分明显增加(P < 0.05)；模型组与各用药组大鼠评分差异无显著性意义(P > 0.05)，说明造模成功。术后灌胃1周与对照组相比，其他各组大鼠评分显著增加(P < 0.05)；与模型组相比，其他各组大鼠评分显著降低(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方中剂量组大鼠评分显著增加(P < 0.05)。

2.4 各组大鼠大脑海马CA1区组织形态结构比较见图1。对照组神经细胞胞浆丰富且排列紧密整齐，细胞结构清晰、完整；模型组的神经细胞数量减少，细胞排列不均匀，细胞结构破坏、外形不规则、胞浆减少、细胞核变小或者消失；米诺环素组及舒筋健脑方各剂量组缺血缺氧性改变减轻，少量神经细胞坏死形成，细胞排列较整齐，细胞结构较为完整，只部分细胞核变小。

2.5 免疫组化检测各组大鼠海马CA1区组织Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达见表5，图2-4。

2.5.1 Bcl-2的表达结果显示，模型组Bcl-2表达最少，舒筋健脑方高剂量组Bcl-2表达最多，舒筋健脑方各剂量组Bcl-2表达量随药物剂量增加而增加；与模型组相比，舒筋健脑方中、高剂量组Bcl-2表达显著增加(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方高剂量Bcl-2表达显著增加(P < 0.05)。
2.5.2 Bax的表达结果显示，模型组Bax表达最多，舒筋健脑方中剂量组Bax表达最少；与模型组相比，米诺环素组、舒筋健脑方低、中和高剂量组Bax表达显著减少(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方低剂量Bax表达显著增加，舒筋健脑方中剂量Bax表达显著减少(P < 0.05)。
2.5.3 Caspase-3的表达结果显示，舒筋健脑方低剂量组Caspase-3表达最多，舒筋健脑方高剂量组Caspase-3表达最少，舒筋健脑方各剂量组表达量随药物剂量增加而减少；与模型组相比，米诺环素组、舒筋健脑方各剂量组的Caspase-3表达均有显著性意义(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方低剂量组Caspase-3表达显著增加(P < 0.05)。
2.6 Western blot检测各组大鼠海马CA1区Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达见图5，表6。

2.6.1 Bcl-2蛋白表达结果显示，模型组表达少，对照组表达最多，舒筋健脑方各剂量组蛋白的表达量随着药物的剂量成正比；与模型组相比，舒筋健脑方高剂量组蛋白表达显著减少(P < 0.05)。
2.6.2 Bax蛋白表达结果显示，模型组表达最多，对照组表达最少；与模型组相比，米诺环素组、舒筋健脑方各剂量组表达显著减少(P < 0.05)。
2.6.3 Bcl-2/Bax的比值模型组Bcl-2/Bax的比值显著低于其他各组(P < 0.05)，其中舒筋健脑方各剂量组的比值与药物的剂量成正比。
2.6.4 Caspase-3蛋白表达结果显示，舒筋健脑方低剂量组表达最多，对照组表达最少；与模型组相比，舒筋健脑方高剂量组蛋白表达显著减少(P < 0.05)；与米诺环素组相比，舒筋健脑方低剂量组蛋白表达显著增加(P < 0.05)。

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引言

脑性瘫痪又称脑瘫(cerebral palsy，CP)是指出生前至出生后早期，在大脑发育未成熟阶段发生脑损伤，形成以运动障碍和姿势异常为主的综合征[1]，常伴有其他功能异常或疾病，例如：感觉、认知、沟通和行为障碍及癫痫等[2]，限制了患者的生活能力，给家庭、社会带来沉重的负担。
脑瘫最常见的病因之一是宫内窒息、早产、产伤等导致围产期新生儿大脑缺血缺氧[3-4]。缺血缺氧可引起兴奋性毒性、氧化应激及炎症反应加剧，导致不同程度的大脑神经元和神经胶质细胞凋亡[5]。缺血缺氧若发生在大脑海马部，则会导致患儿学习、认知、记忆等功能障碍；若发生在锥体系，则会导致患儿运动障碍及姿势异常，形成痉挛型脑瘫。因此，通过有效手段改善脑组织缺血缺氧，减少神经细胞凋亡，是治疗脑瘫的方法之一。
中药具有多成分、多靶点、多通路、多生物途径综合作用的特点[6]，能通过多种机制改善脑缺血缺氧，抑制细胞凋亡。舒筋健脑方是北京中医药大学东直门医院骨科治疗脑瘫的经验方剂，其主要功效是补益肝肾、祛风活血通络，已用于临床多年。既往已有研究发现其促进脑瘫术后康复、辅助脑瘫患者提高认知功能等效果良好[7-8]，但其改善脑瘫缺血缺氧的机制尚不明确。因此，该项研究通过建立新生大鼠缺血缺氧脑瘫模型，分析一般状况、行为学改变、大脑海马细胞形态及B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达等指标变化，探讨舒筋健脑方保护大脑海马神经细胞的潜在机制，为其作为辅助改善脑瘫患者学习认知、改善痉挛的药物开发提供客观依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。多组比较采用方差分析，组间比较采用t检验或秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2020年9-12月在北京中医药大学东直门医院动物实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 动物 6只妊娠14周的SD母鼠，购自北京斯贝福有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0010。母鼠在北京中医药大学东直门医院动物实验室SPF级环境下饲养。动物房饲养条件：室温(22.0±1.5) ℃、相对湿度(50.0±5.5)%，每日光照时间12 h，分笼饲养，自由摄食及饮水。获得的64只7日龄(P7)SD大鼠为实验动物，雌雄不分，体质量13-21 g。实验经北京中医药大学东直门医院伦理委员会批准，符合实验动物伦理相关规定，批准号为DZMEC-KY-2019-85。
1.3.2 药物舒筋健脑方药物组成：黄芪9 g、杜仲6 g、牛膝6 g、益智仁6 g、当归9 g、赤芍9 g、伸筋草12 g、透骨草12 g、钩藤6 g；使用中药颗粒剂由北京康仁堂药业有限公司生产。盐酸米诺环素，瀚晖制药有限公司生产，批准文号：国药准字H20174081。
1.3.3 试剂与仪器异氟烷(河北一品制药股份有限公司)；注射用青霉素钠(华北制药股份有限公司)；EDTA抗原修复液、PBS、DAB显色剂、中性树胶封片剂(武汉博士德生物工程有限公司)；丙烯酰胺、双丙烯酰胺、丽春红染色液、十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇(美国伯乐)；PVDF膜(德国密理博)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、Bax抗体、Bcl-2抗体、Caspase-3抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；牛血清白蛋白V、辣根过氧化物酶标记山羊抗猪IgG(北京索莱宝科技有限公司)；ECL发光液(美国Perkin Elmer)；蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂(瑞典罗氏公司)；氧气检测仪AR8100(香港希玛仪器仪表有限公司)；倒置显微镜、成像系统(日本尼康)；稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽、半干转电转印仪(美国伯乐)；计算机图像分析仪(美国 Media Cybenetics)；4 ℃低温高速离心机(美国Thermo)；常温高速离心机、紫外分光光度计、微量加样器(德国艾本德)。
1.4 实验方法
1.4.1 造模方法新生大鼠缺血缺氧脑瘫模型制备，参照经典Rice-Vannucci模型的方法[9]。7 d龄SD大鼠无菌条件下异氟烷吸入麻醉，固定到手术台，持续低剂量麻醉(异氟烷诱导麻醉浓度为体积分数3.0%，维持麻醉浓度为体积分数1.5%)。消毒皮肤，颈部正中切口，分离出左侧颈总动脉，予以双重结扎后剪断血管，缝合皮肤并用青霉素注射液冲洗局部皮肤，复苏1 h后再将幼鼠放入密封缺氧箱中，通入体积分数为92%氮气和体积分数为8%氧气混合气体，2.5 h后取出，放回母鼠笼中继续哺乳。对照组幼鼠仅做麻醉后颈部正中切口，暴露左侧颈总动脉后缝合，不做左侧颈总动脉结扎及缺氧处理。操作过程中使用加热垫和水浴箱保持幼鼠恒温，术后根据行为学观察判定模型构建成功。
1.4.2 模型鉴定及神经行为学检测造模结束后24 h进行行为学检测判断模型是否成功，主要检测项目有：悬吊实验、倾斜板实验及Longa评分；给药1周后各组大鼠再次进行悬吊实验、倾斜板实验和Longa评分检测神经行为学变化。
(1)悬吊实验：使7 d龄大鼠双前腿抓住一水平木棒(直径0.1 cm)，离开桌面45 cm，记录大鼠掉下的时间。评分标准：1分，≤10 s；2分，10 s-< 30 s；3分，30 s-< 2 min；4分，2-5 min；5分，> 5 min。测试大鼠随意运动功能肢体的肌力，悬吊实验中实验组动物分值低于对照组均数-1.96倍标准差，即定义为异常[10]。
(2)倾斜板实验：将7 d龄大鼠头向下倒置于45°斜面上，记录大鼠扭转身体，转至与原始头部方向夹角135°的时间，以秒为计算单位。测试大鼠的平衡能力[11]。倾斜板实验中实验组动物分值高于对照组均数+1.96倍标准差，即定义为异常。
(3)Zea longga神经学检查：Zea longga神经学检查分5个等级：0分，正常，无神经功能缺损；1分，左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分，行走时，大鼠向右侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分，行走时，大鼠身体向右侧(瘫痪侧)倾斜，重度神经功能缺损；4分，不能自发行走，有意识丧失[12]。重复评分3次，取平均值，评分在1-3分，即定义为异常。

鉴定为脑瘫的SD大鼠中，选取同时具备行为学评估中悬吊实验异常、倾斜板实验异常和Zea longga神经学评分1-3分的缺血缺氧脑瘫模型大鼠进行后续实验。

1.4.3 分组及给药 64只幼鼠依次编号，将幼鼠随机分为6组，对照组12只、模型组12只、米诺环素组10只、舒筋健脑方低剂量组10只、舒筋健脑方中剂量组10只、舒筋健脑方高剂量组10只。于造模结束后24 h，判定模型成功的当天开始灌胃。参考以往研究[13]，给药剂量如下：空白对照组、模型对照组大鼠给予10 mL/(kg·d)生理盐水灌胃，米诺环素组大鼠予以米诺环素40 mg/(kg·d)灌胃，舒筋健脑方低、中、高剂量组分别给予舒筋健脑方4，8，16 g/(kg·d)灌胃，每日1次，连续灌胃1周。
1.4.4 体质量监测各组7 d龄大鼠在术前采用电子天平称量体质量，术后灌胃1周后再次采用电子天平称量体质量。
1.4.5 标本采集与处理神经行为学、体质量检测结束后，大鼠禁食12 h后进行麻醉，取各组大鼠完整脑组织，将脑组织放入40 g/L多聚甲醛溶液中，随后固定、脱水、包埋、切片。剩余大鼠标本经液氮速冻后-80 ℃冰箱冻存，用于免疫组化和蛋白免疫印迹(Western blot)实验。
1.4.6 脑组织形态学检测取脑组织切片，分别用浓度渐次升高的乙醇进行梯度脱水，二甲苯浸渍、石蜡浸蜡后，进行包埋。石蜡切片脱蜡至水，后进行苏木精-伊红染色，中性树脂胶进行透明封固，光学显微镜下观察大鼠脑组织海马CA1区形态。
1.4.7 免疫组化检测将切片脱蜡复水，经体积分数3%H2O2和蒸馏水处理后，切片放入盛有EDTA抗原修复液的容器中，置微波炉内加热后自然冷却。置于5%BSA封闭液中，室温孵育20 min后滴加一抗(Bax为1∶100；Bcl-2为1∶100；Caspase-3为1∶100)湿盒4 ℃过夜，经PBS清洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温孵育20 min后，经PBS清洗。再滴加试剂SABC，室温孵育20 min后，经PBS清洗。使用DAB显色试剂盒(AR1022)进行室温显色后用苏木素轻度复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，于通风橱中晾干后，中性树胶封固，在光学显微镜下拍片，观察脑组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3的阳性表达。
1.4.8 蛋白质免疫印迹法检测从液氮中取出大鼠脑组织，放入预冷却的研钵中，加入液氮直至没过皮质组织，用研磨棒敲碎组织并快速研磨，得到粉末装入预冷的EP管中后，加入50 μL细胞裂解液裂解，冰上静置30 min。4 ℃下将组织匀浆1 000 r/min离心10 min，离心后取上清液。采用BCA法测定样本中的蛋白浓度后，将剩余样本加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水煮5 min，使蛋白质完全变性，室温冷却。制备12% SDS-PAGE凝胶，蛋白上样、电泳后转膜至PVDF膜上。将PVDF膜移入杂交袋加入事先稀释的一抗(Bax为1∶2 000；Bcl-2为1∶2 000；Caspase-3为1∶1 000)，4 ℃孵育一晚。一抗孵育结束后，用 TBST 洗涤 PVDF 薄膜3次，每次10 min。PVDF膜移入杂交袋加入事先稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37 ℃振荡60 min，再次TBST漂洗3次。将PVDF膜置于配置的ECL混合液中，振荡温育5 min，吸水纸吸去膜片多余液体后，将膜片吸附蛋白面朝上，置于X射线片盒中，在暗室内压上X射线片，根据信号强度调整曝光时间，将已曝光的胶片浸入显影液中显影。使用软件Image J对Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白条带灰度值进行分析。
1.5 主要观察指标 ①大鼠体质量；②行为学评分；③海马CA1区组织形态结构；④海马CA1区组织Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达。
1.6 统计学分析使用 SPSS 27.0 软件处理，数据以x±s表示。数据满足正态分布，多组比较采用方差分析，组间比较采用t检验；数据不满足正态分布，则组间比较采用秩和检验，检验水准α=0.05，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经由北京中医药大学东直门医院生物统计学专家审核。

讨论

脑瘫属于中医“五迟五硬”的范畴，属虚实夹杂病，小儿肾脾亏虚、精血不足是致病之本，肝风内动是发病之标[14]。舒筋健脑方中黄芪、杜仲、牛膝、益智仁补益脾肾，强壮筋骨，当归、赤芍活血化瘀，伸筋草、透骨草祛风湿通络，钩藤祛除内外之风。诸药配合，共奏补益肝肾、祛风通络之功。方证对应，舒筋健脑方应能发挥一定的作用。
此次实验所参照的经典Rice-Vannucci模型被广泛认为是一种成功的新生动物缺血缺氧脑损伤模型[15-17]。该研究使用7 d龄SD大鼠的原因是，该年龄的大脑组织与妊娠32-34周的人类胎儿相似[18]，特别适用于模拟人类早产儿短暂性局灶性脑缺血；且该模型大鼠在行为学、认知能力等测试中表现显著缺陷[19]。模型大鼠反应迟钝、平衡能力下降、肌肉力量降低且生长发育相对迟缓等，这与典型的脑瘫症状相符，也通过了行为学检测，提示造模成功。米诺环素是第2代半合成四环素类抗生素，具有抗菌能力强大、抗菌谱广、容易通过血脑屏障等特点[20]。研究发现，米诺环素在急性脑损伤患者尤其是缺血亚群中显示出了良好的神经保护作用[21]。故此次研究中选择米诺环素作为阳性对照药物。
此项研究发现，经过1周的中药干预，舒筋健脑方中、高剂量组大鼠体质量得到显著增加，脑瘫大鼠整体生长发育得到改善；在行为学检测中，米诺环素组有效延长了缺血缺氧脑瘫大鼠悬吊时间，而舒筋健脑方中、高剂量组有效延长了缺血缺氧脑瘫SD大鼠悬吊时间、缩短了倾斜实验时间、提升了Longa评分，提高了脑瘫SD大鼠肢体肌肉力量，改善了平衡能力及神经功能。说明舒筋健脑方中、高剂量可减轻肌力低下、行为障碍等症状，整体疗效不亚于米诺环素。
舒筋健脑方中的部分中药及提取物改善细胞凋亡可以是多途径、多靶点，Bcl-2、Bax、Caspase-3是其共有的途径之一。研究发现，黄芪多糖(APS)可降低小鼠帕金森模型大脑黑质中bax/bcl-2比值、Caspase-3蛋白含量，保护小鼠神经元和线粒体[22]。当归提取物通过激活p38 MAPK介导的p90RSK/p-Bad诱导的海马细胞中的抗凋亡相关Cytc/ Caspase-3通路，对海马组织缺血再灌注损伤发挥保护作用[23]。益智仁治疗靶点之一的CASP3参与负责凋亡执行的Caspase酶的激活级联反应，是脑损伤神经元凋亡的重要生物标志[7]。杜仲叶提取物可抑制氧糖剥夺/复糖复氧诱导的PC12细胞凋亡、氧化应激和炎性因子表达而减轻PC12细胞损伤，其机制与上调miR-140-5p表达有关[24]。此外，牛膝成分β-蜕皮甾酮(βEcdysterone，βEcd)联合杜仲成分松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)干预糖皮质激素性骨质疏松症模型小鼠时，地塞米松上调小鼠Caspase-3、Bax等凋亡相关蛋白表达，降低Bcl-2/Bax比值。βEcd-PDG上调Bcl-2、降低Bax表达，升高Bcl-2/Bax比值，βEcd-PDG可保护骨组织细胞免受GC诱导的凋亡，有利于骨稳态的恢复和骨形成[25]。因此，各药物可以协同发挥作用。
此次研究中，苏木精-伊红染色观察大鼠大脑组织，发现药物组大鼠大脑组织神经细胞缺血缺氧性改变减轻，仅少量神经细胞坏死形成，细胞排列较整齐，细胞结构较为完整，只部分细胞核变小，提示舒筋健脑方和米诺环素确能改善大脑神经细胞缺血缺氧。进一步观察发现米诺环素和舒筋健脑方对新生缺血缺氧脑瘫大鼠的作用机制体现在影响Bcl-2、Bax、Caspase-3因子表达中。免疫组化实验发现，米诺环素可减少Bax和Caspase-3表达；舒筋健脑方低剂量可减少Bax表达；中、高剂量可增加Bcl-2表达，减少Bax、Caspase-3表达；且舒筋健脑方中、高剂量效果与米诺环素组类似，弱于米诺环素。Western blot实验显示，米诺环素组和舒筋健脑方低、中剂量组可减少缺血缺氧脑瘫大鼠海马组织CA1区Bax蛋白表达，增加Bcl-2/Bax蛋白表达的比值；舒筋健脑方高剂量组可减少Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达，增加Bcl-2/Bax蛋白表达的比值。米诺环素和舒筋健脑方治疗均可提高Bcl-2/Bax比值，且Bcl-2/Bax比值与舒筋健脑方剂量成正比；均可降低Caspase-3蛋白表达，且Caspase-3蛋白表达与舒筋健脑方剂量成正比，其中舒筋健脑方高剂量可以显著降低；同样发现舒筋健脑方高剂量效果与米诺环素组类似，低、中剂量组效果弱于米诺环素。因此，舒筋健脑方中各药物之间的协同作用可以有效保护脑瘫大鼠受损的海马细胞，通过提高Bcl-2/Bax的比值，降低Caspase-3，减轻细胞凋亡，且药物在一定范围内，剂量越高治疗效果越好，且舒筋健脑方高剂量使用疗效不亚于米诺环素。
Bcl-2蛋白家族是公认的调节细胞凋亡的关键因子[26]，主要作用于线粒体。其中，促进凋亡成员Bax和抗凋亡成员中的Bcl-2是一对拮抗蛋白。Bax与Bcl-2结合形成复合物，促进Bcl-2的降解，以减轻Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用[27]。另外，细胞凋亡发生是一个由含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，Caspase-3是主要的效应Caspase，是多种凋亡途径的最后执行蛋白[28]，在细胞凋亡过程中占据核心地位。其中，Bax可触发相关细胞因子，激活Caspase-3，启动Caspase级联反应，促进凋亡[29]。Bcl-2表达增多，通过阻断细胞因子的释放，抑制下游Caspase-3的激活，从而有效地抑制细胞凋亡的发生[30]。
综上，舒筋健脑方治疗与Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达水平密切相关，其治疗作用可能是通过提升抗凋亡蛋白Bcl-2表达与抑制促凋亡蛋白Bax表达，提升了Bcl-2/Bax的比值比，降低Caspase-3的蛋白表达，抑制脑瘫SD大鼠海马组织细胞凋亡。在一定范围内，舒筋健脑方剂量越高治疗效果越好，且高剂量使用疗效不亚于米诺环素。但此次研究还存在一定的局限性：动物实验观察周期较短，可在下一步实验中延长观察周期，以探讨舒筋健脑方治疗缺血缺氧脑瘫模型大鼠的远期效果；动物行为学仅检测了肢体运动能力，还可增加水迷宫实验等检测模型大鼠的学习、认知能力[31-32]。缺血缺氧脑损伤涉及分子、细胞、蛋白众多，舒筋健脑方的作用机制研究仍有很大的空间，有待进一步综合分析。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

舒筋健脑方对缺血缺氧脑瘫模型大鼠细胞凋亡的影响

Effects of Shujin Jiannao Prescription on cell apoptosis in rats with hypoxic-ischemic brain injury

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