灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控

doi:10.12307/2024.200

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 4041-4047.doi: 10.12307/2024.200

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控

李雁冰1，2，王记委 1，2，刘晓琴2，郭敏芳2，牛晓洁2，孟涛2，苏琴1，2，王瀚斌3，杨立志3，马存根1，尉杰忠1，2，4

1山西中医药大学神经生物学研究中心/国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西省晋中市 030619；2山西大同大学脑科学研究所，山西省大同市 037009；3山西国润制药有限公司，山西省大同市 038100；4大同市第五人民医院，山西省大同市 037009

收稿日期:2023-08-01 接受日期:2023-09-18 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-24
通讯作者: 尉杰忠，博士，教授，博士生导师，山西中医药大学神经生物学研究中心/国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西省晋中市 030619；山西大同大学脑科学研究所，山西省大同市 037009；大同市第五人民医院，山西省大同市 037009 马存根，博士，教授，博士生导师，山西中医药大学神经生物学研究中心/国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室，山西省晋中市 030619
作者简介:李雁冰，女，广东省梅州市人，山西中医药大学在读硕士，主要从事神经退行性疾病的基础和应用研究。王记委，男，河南省驻马店市人，山西中医药大学在读硕士，主要从事神经退行性疾病的基础和应用研究。
基金资助:
山西省 2022 年度“四个一批”科技兴医创新计划项目(2022XM33)，项目负责人：尉杰忠；山西省基础研究计划青年科学研究项目(20210302124276)，项目负责人：刘晓琴；山西大同大学横向项目(2022001)，项目负责人：刘晓琴；山西大同大学校级科研项目(2022Q21)，项目负责人：刘晓琴；山西省卫生健康委科研项目(2021168)，项目负责人：尉杰忠；大同市平台计划项目(2022082)，项目负责人：尉杰忠

Regulatory effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on H2O2-induced apoptosis and mitochondrial dysfunction in SH-SY5Y cells

Li Yanbing1, 2, Wang Jiwei1, 2, Liu Xiaoqin2, Guo Minfang2, Niu Xiaojie2, Meng Tao2, Su Qin1, 2, Wang Hanbin3, Yang Lizhi3, Ma Cungen1, Yu Jiezhong1, 2, 4

1Research Center of Neurobiology/The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; 2Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; 3Shanxi Guorun Pharmaceutical Co., Ltd., Datong 038100, Shanxi Province, China; 4Datong Fifth People’s Hospital, Datong 037009, Shanxi Province, China

Received:2023-08-01 Accepted:2023-09-18 Online:2024-09-08 Published:2023-11-24
Contact: Yu Jiezhong, MD, Professor, Doctoral supervisor, Research Center of Neurobiology/The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China; Datong Fifth People’s Hospital, Datong 037009, Shanxi Province, China Ma Cungen, MD, Professor, Doctoral supervisor, Research Center of Neurobiology/The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China
About author:Li Yanbing, Master candidate, Research Center of Neurobiology/The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China Wang Jiwei, Master candidate, Research Center of Neurobiology/The Key Research Laboratory of Benefiting Qi for Acting Blood Circulation Method to Treat Multiple Sclerosis of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, Shanxi Province, China; Institute of Brain Science, Shanxi Datong University, Datong 037009, Shanxi Province, China
Supported by:
Shanxi Province 2022 “Four Batch One” Science and Technology Innovation Plan Project, No. 2022XM33 (to YJZ); Youth Science Research Project of Shanxi Province Basic Research Program, No. 20210302124276 (to LXQ); Horizontal Project of Shanxi Datong University, No. 2022001 (to LXQ); Shanxi Datong University Campus Level Research Project, No. 2022Q21 (to LXQ); Research Project of Shanxi Provincial Health Commission, No. 2021168 (to YJZ); Datong City Platform Plan Project, No. 2022082 (to YJZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

灵孢多糖：是灵芝孢子粉中的主要活性成分之一，具有调节免疫功能、抗肿瘤、清除自由基、延缓衰老、神经系统保护等多种药理活性，已有研究证实灵孢多糖可通过促进神经再生有效改善阿尔茨海默病小鼠的认知功能及学习能力。

氧化应激：是生物体内活性氧产生与清除之间不平衡导致的一种病理失衡。氧化应激导致活性氧生成过量时，会损伤中枢神经系统的神经元，导致后期线粒体功能障碍，加重阿尔茨海默病。

背景：目前研究证实，灵孢多糖可促进神经退行性相关疾病的神经再生。神经退行性疾病的发生与线粒体功能失调密切相关，但灵孢多糖对神经退行性疾病的细胞凋亡及线粒体功能的调控作用尚不明确。
目的：探索灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控作用及机制。
方法：SH-SY5Y细胞分为3组：对照组，过氧化氢组，灵孢多糖组。对照组细胞正常培养，过氧化氢组细胞用300 μmol/L过氧化氢处理24 h，灵孢多糖组先用300 μg/μL灵孢多糖干预一两个小时，然后加入300 μmol/L过氧化氢干预24 h，干预结束后用JC-1试剂盒检测线粒体膜电位，TUNEL染色试剂盒检测细胞凋亡情况，丙二醛试剂盒和超氧化物歧化酶试剂盒检测丙二醛和超氧化物歧化酶活性，免疫荧光染色法和Western blot法检测凋亡、线粒体动力学相关蛋白的表达。

结果与结论：①与对照组相比，过氧化氢组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著降低，细胞凋亡率、丙二醇水平显著增高，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组线粒体膜电位和超氧化歧化酶活性显著增高，细胞凋亡率、丙二醛水平显著下降，差异均有显著性意义(P < 0.05)；②与对照组相比，过氧化氢组促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达显著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达显著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)；③与对照组相比，过氧化氢组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达均显著增高，线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达均显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达显著降低，线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达显著增高，差异均有显著性意义(P < 0.05)；④以上结果证实，灵孢多糖可通过改善线粒体功能障碍以减轻过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤和细胞凋亡。

https://orcid.org/0009-0006-5940-7069 (李雁冰)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 灵孢多糖, SH-SY5Y细胞, 细胞凋亡, 线粒体功能障碍, 氧化应激

Abstract: BACKGROUND: Current studies have confirmed that Ganoderma lucidum polysaccharides can promote nerve regeneration in neurodegeneration-related diseases. The occurrence of neurodegenerative diseases is closely related to mitochondrial dysfunction, but the role of Ganoderma lucidum polysaccharides on the regulation of apoptosis and mitochondrial function in neurodegenerative diseases is not yet clarified.
OBJECTIVE: To explore the regulatory effects and mechanisms of Ganoderma lucidum polysaccharides on apoptosis and mitochondrial dysfunction in H2O2-induced SH-SY5Y cells.
METHODS: SH-SY5Y cells were divided into three groups: control group, H2O2 group, and Ganoderma lucidum polysaccharides group. Cells in the control group were normally cultured. Cells in the H2O2 group were treated with 300 μmol/L H2O2 for 24 hours. In the Ganoderma lucidum polysaccharides group, the intervention with 300 μg/L Ganoderma lucidum polysaccharides was conducted first for 1-2 hours, followed by the addition of 300 μmol/L H2O2 for 24 hours. The mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 kit. Apoptosis was detected by TUNEL staining kit. The activities of malondialdehyde and superoxide dismutase were detected by malondialdehyde test kit and superoxide dismutase test kit, respectively. The apoptosis and expression of mitochondrial dynamics-related proteins were detected by immunofluorescence staining and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with the control group, the mitochondrial membrane potential and superoxide dismutase activity were significantly reduced, as well as apoptotic rate and malondialdehyde levels were significantly increased in the H2O2 group (P < 0.05). After treatment with Ganoderma lucidum polysaccharides, the membrane potential and superoxide dismutase activities were significantly increased, and apoptotic rate and malondialdehyde levels were significantly reduced compared with the H2O2 group (P < 0.05). (2) The expression levels of pro-apoptotic proteins Bax and Caspase-3 were significantly increased, but the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly decreased in the H2O2 group compared with the control group (P < 0.05). Compared with the H2O2 group, the levels of Bax and Caspase-3 were significantly decreased, but the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2 was significantly increased in the Ganoderma lucidum polysaccharides group (P < 0.05). (3) Compared with the control group, the expression of mitochondrial splitting proteins Fis1 and p-Drp1 was significantly increased, but the expression of mitochondrial fusion proteins OPA1, Mfn1, and Mfn2 was decreased in the H2O2 group (P < 0.05). Compared with the H2O2 group, Fis1 and p-Drp1 expression was significantly reduced, but the expression levels of OPA1, Mfn1, and Mfn2 were significantly increased in the Ganoderma lucidum polysaccharides group (P < 0.05). (4) The above results confirm that Ganoderma lucidum polysaccharides can attenuate H2O2-induced oxidative stress damage and apoptosis in SH-SY5Y cells by ameliorating mitochondrial dysfunction.

Key words: Ganoderma lucidum polysaccharides, SH-SY5Y cell, apoptosis, mitochondrial dysfunction, oxidative stress

中图分类号:

李雁冰, 王记委, 刘晓琴, 郭敏芳, 牛晓洁, 孟涛, 苏琴, 王瀚斌, 杨立志, 马存根, 尉杰忠. 灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4041-4047.

Li Yanbing, Wang Jiwei, Liu Xiaoqin, Guo Minfang, Niu Xiaojie, Meng Tao, Su Qin, Wang Hanbin, Yang Lizhi, Ma Cungen, Yu Jiezhong. Regulatory effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on H2O2-induced apoptosis and mitochondrial dysfunction in SH-SY5Y cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 4041-4047.

图/表（结果） 8

2.1 筛选过氧化氢的最佳干预浓度用CCK-8法检测不同浓度过氧化氢溶液对SH-SY5Y细胞活力的影响。如图1所示，用200 μmol/L 过氧化氢溶液处理时，细胞活力有所下降，但与0 μmol/L比较无显著差异。给予250 μmol/L过氧化氢溶液处理，细胞活力继续下降，但与0 μmol/L比较仍无显著差异。使用300 μmol/L过氧化氢溶液处理时，细胞活力显著下降，与0 μmol/L比较差异有显著性意义(P < 0.01)，对细胞活力影响较小，升高过氧化氢浓度至350，400，450 μmol/L时，细胞活力继续下降，与0 μmol/L比较差异有非常显著性意义(P < 0.001)，对细胞活力影响较大，所以后续实验中所用过氧化氢溶液浓度均为300 μmol/L。

2.2 不同质量浓度灵孢多糖对SH-SY5Y细胞存活率的影响为检测不同质量浓度灵孢多糖对细胞增殖的影响，选取了3个质量浓度的灵孢多糖(100，300，500 μg/μL)对细胞进行干预。由图2A可见：3个质量浓度灵孢多糖对细胞均没有毒性。进一步检测不同质量浓度灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞增殖的影响，由图2B可见：用灵孢多糖干预24 h后，100 μg/μL灵孢多糖溶液对细胞存活率无显著影响，当使用300 μg/μL灵孢多糖溶液处理后，细胞存活率显著升高(P < 0.001)，说明灵孢多糖能减轻过氧化氢对SH-SY5Y细胞氧化应激水平，对细胞有保护作用。后续实验均选用300 μg/μL灵孢多糖对细胞进行处理。

2.3 灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞形态的影响对照组SH-SY5Y细胞在镜下观察形态多为梭形，细胞突起明显，生长状态良好；经过氧化氢干预后，细胞胞体多呈肥大状，细胞突起消失；灵孢多糖处理后，细胞形态与对照组相似，多呈梭形，突起较为明显，见图3。

2.4 灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激水平的影响见图4。与对照组相比，过氧化氢组的超氧化物歧化酶活性显著下降(P < 0.001)，丙二醛水平上升(P < 0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组的超氧化物歧化酶活性上升(P < 0.01)，丙二醛水平下降(P < 0.01)，说明灵孢多糖能改善过氧化氢对SH-SY5Y细胞造成的氧化应激损伤。

2.5 灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响 JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，当线粒体膜电位下降或丧失时，发出绿色荧光。用JC-1试剂盒可直接检测出灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位的影响，见图5，与对照组相比，过氧化氢组的红/绿荧光强度比值显著下调(P < 0.01)，证明过氧化氢组线粒体膜电位水平降低；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组红/绿荧光强度比值显著提高(P < 0.05)，证明灵孢多糖可以改善细胞的线粒体膜电位水平，对细胞具有保护作用。

2.6 灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响如图6所示，与对照组相比，过氧化氢组的细胞凋亡率显著升高(P < 0.001)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组的细胞凋亡率降低(P < 0.01)。

免疫荧光结果显示，与对照组相比，过氧化氢组Cleaved Caspase-3的表达显著增加(P < 0.001)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组Cleaved Caspase-3的表达显著降低(P < 0.01)，见图7A。
Western blot检测凋亡相关蛋白的表达，与对照组相比，过氧化氢组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达均显著增加(P < 0.05，P < 0.01)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降(P < 0.05)；与过氧化氢组比，灵孢多糖组促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达均显著降低(P < 0.05，P < 0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显著增加(P < 0.05)，见图7B。

上述结果显示，灵孢多糖可以通过抑制促凋亡蛋白的表达，提高抗凋亡蛋白的表达，从而抑制过氧化氢诱导的SY5Y细胞凋亡。
2.7 灵孢多糖对线粒体动力学的调控 Western blot结果显示，与对照组相比，过氧化氢组线粒体融合蛋白OPA1、Mfn1、Mfn2的表达均显著降低(P < 0.01，P < 0.05，P < 0.001)，线粒体分裂蛋白Fis1与线粒体动力学蛋白p-Drp1的表达均显著提高(P < 0.05，P < 0.05)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组OPA1、Mfn1、Mfn2的表达均显著增加(P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01)，Fis1与p-Drp1的表达均显著降低(P < 0.05，P < 0.05)。免疫荧光结果显示，与对照组相比，过氧化氢组OPA1、Mfn1的表达均显著降低(P < 0.01，P < 0.001)，p-Drp1的表达显著增加(P < 0.001)；与过氧化氢组相比，灵孢多糖组OPA1、Mfn1的表达均显著升高(P < 0.01，P < 0.05)，p-Drp1的表达显著下降(P < 0.01)。上述结果表明灵孢多糖可以促进线粒体融合蛋白的表达，抑制线粒体分裂蛋白、线粒体动力学蛋白的表达。见图8。

参考文献

[1] MACDONALD R, BARNES K, HASTINGS C, et al. Mitochondrial abnormalities in Parkinson’s disease and Alzheimer’s disease: can mitochondria be targeted therapeutically? Biochem Soc Trans. 2018; 46(4):891-909.
[2] ABATE M, FESTA A, FALCO M, et al. Mitochondria as playmakers of apoptosis, autophagy and senescence. Semin Cell Dev Biol. 2020;98: 139-153.
[3] JOHNSON J, MERCADO-AYON E, MERCADO-AYON Y, et al. Mitochondrial dysfunction in the development and progression of neurodegenerative diseases. Arch Biochem Biophys. 2021;702:108698.
[4] ANNESLEY SJ, FISHER PR. Mitochondria in Health and Disease. Cells. 2019;8(7):680.
[5] WHITLEY BN, ENGELHART EA, HOPPINS S. Mitochondrial dynamics and their potential as a therapeutic target. Mitochondrion. 2019;49:269-283.
[6] YAPA NMB, LISNYAK V, RELJIC B, et al. Mitochondrial dynamics in health and disease. FEBS Lett. 2021;595(8):1184-1204.
[7] NG MYW, WAI T, SIMONSEN A. Quality control of the mitochondrion. Dev Cell. 2021;56(7):881-905.
[8] WU Y, CHEN M, JIANG J. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and drug targets via apoptotic signaling. Mitochondrion. 2019;49:35-45.
[9] NUNNARI J, SUOMALAINEN A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 2012;148(6):1145-1159.
[10] IENCO EC, LOGERFO A, CARLESI C, et al. Oxidative stress treatment for clinical trials in neurodegenerative diseases. J Alzheimers Dis. 2011;24 Suppl 2:111-126.
[11] SEWERYN E, ZIAŁA A, GAMIAN A. Health-Promoting of Polysaccharides Extracted from Ganoderma lucidum. Nutrients. 2021;13(8):2725.
[12] 吴宜娟,莫明树,黄树宣.灵孢多糖对Aβ25-35损伤SH-SY5Y细胞保护作用的研究[J].热带医学杂志,2018,18(8):1006-1009.
[13] 于红梅,金永华.灵芝孢子粉对Guillain Barre综合征的疗效和作用机制[J].中风与神经疾病杂志,2013,30(12):1114-1115.
[14] ZENG P, GUO Z, ZENG X, et al. Chemical, biochemical, preclinical and clinical studies of Ganoderma lucidum polysaccharide as an approved drug for treating myopathy and other diseases in China. J Cell Mol Med. 2018;22(7):3278-3297.
[15] LI K, WANG Z. lncRNA NEAT1: Key player in neurodegenerative diseases. Ageing Res Rev. 2023;86:101878.
[16] ØVERGAARD KR, ØRBECK B. Children with neurodegenerative disease and obsessive-compulsive behaviour. Tidsskr Nor Laegeforen. 2020;140(6). doi: 10.4045/tidsskr.19.0703.
[17] LI R, ROBINSON M, DING X, et al. Genistein: A focus on several neurodegenerative diseases. J Food Biochem. 2022;46(7):e14155.
[18] YOUSEFI N, ABDOLLAHII S, KOUHBANANI MAJ, et al. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) as game-changing tools in the treatment of neurodegenerative disease: Mirage or reality? J Cell Physiol. 2020; 235(12):9166-9184.
[19] HOU Y, DAN X, BABBAR M, et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 2019;15(10):565-581.
[20] RAI SN, SINGH C, SINGH A, et al. Mitochondrial Dysfunction: a Potential Therapeutic Target to Treat Alzheimer’s Disease. Mol Neurobiol. 2020;57(7):3075-3088.
[21] VAN RENSBURG DJ, LINDEQUE Z, HARVEY BH, et al. Reviewing the mitochondrial dysfunction paradigm in rodent models as platforms for neuropsychiatric disease research. Mitochondrion. 2022;64:82-102.
[22] 冯鹏,胡珀,李慧,等.灵芝孢子粉在免疫调节中的作用及机制研究进展[J].药物生物技术,2021,28(3):308-314.
[23] CAI Q, LI Y, PEI G. Polysaccharides from Ganoderma lucidum attenuate microglia-mediated neuroinflammation and modulate microglial phagocytosis and behavioural response. J Neuroinflammation. 2017; 14(1):63.
[24] 杨海华,李毅,张丹桃,等.灵孢多糖对MPP+损伤PC12细胞的保护作用[J].中山大学学报(医学科学版),2007,28(4):393-396.
[25] GANGRAS P, GELFANOVA V, WILLIAMS GD, et al. Investigating SH-SY5Y Neuroblastoma Cell Surfaceome as a Model for Neuronal-Targeted Novel Therapeutic Modalities. Int J Mol Sci. 2022;23(23):15062.
[26] TAŞ CENGIZ Z, YILMAZ H, BEYHAN YE, et al. The Importance of Antioxidant Enzymes and Oxidative Stress in Human Fascioliasis. Turkiye Parazitol Derg. 2023;47(1):38-41.
[27] CHEN M, WU W, LIU D, et al. Evolution and Structure of API5 and Its Roles in Anti-Apoptosis. Protein Pept Lett. 2021;28(6):612-622.
[28] ASADI M, TAGHIZADEH S, KAVIANI E, et al. Caspase-3: Structure, function, and biotechnological aspects. Biotechnol Appl Biochem. 2022;69(4):1633-1645.
[29] YUAN Z, DEWSON G, CZABOTAR PE, et al. VDAC2 and the BCL-2 family of proteins. Biochem Soc Trans. 2021;49(6):2787-2795.
[30] CHAN DC. Mitochondrial Dynamics and Its Involvement in Disease. Annu Rev Pathol. 2020;15:235-259.
[31] GIACOMELLO M, PYAKUREL A, GLYTSOU C, et al. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020; 21(4):204-224.
[32] RODRIGUES T, FERRAZ LS. Therapeutic potential of targeting mitochondrial dynamics in cancer. Biochem Pharmacol. 2020;182: 114282.
[33] ADEBAYO M, SINGH S, SINGH AP, et al. Mitochondrial fusion and fission: The fine-tune balance for cellular homeostasis. FASEB J. 2021; 35(6):e21620.
[34] KUMAR S, ASHRAF R, C K A. Mitochondrial dynamics regulators: implications for therapeutic intervention in cancer. Cell Biol Toxicol. 2022;38(3):377-406.

引言

线粒体是真核细胞必备的细胞器，是细胞能量生成的场所，不仅能合成ATP，还与细胞凋亡有关[1-2]，线粒体功能在神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、共济失调症的疾病进展中发挥着重要作用[3-4]。正常生理状态下，线粒体的分裂和融合处于动态平衡状态。当外界环境改变或药物刺激作用时，线粒体融合和分裂蛋白的表达水平会发生改变，如动力蛋白相关蛋白1(phospho-Drp1，p-Drp1)、线粒体融合蛋白1(mitofusin1，Mfn1)和线粒体融合蛋白2(mitofusin2，Mfn2)以及视性萎缩蛋白1(optic atrophy，OPA1)，常导致线粒体的分裂与融合失调，从而影响线粒体的正常功能，出现线粒体功能障碍[5-6]，引起细胞凋亡，导致疾病发生[7]。线粒体功能障碍导致ATP显著减少，活性氧过度产生[8]，活性氧产生与清除失衡，甚至会破坏细胞的关键成分，如脂质、蛋白质等，影响细胞稳态，从而加剧细胞的氧化应激[9-10]。越来越多的证据表明，线粒体功能障碍和氧化应激会影响神经退行性疾病的发生发展，但线粒体功能及氧化应激相关方面的治疗药物甚少。因此，开发此方面的有效药物并对其作用机制进行探索，将为神经退行性疾病的预防及治疗提供一定的理论依据。
灵孢多糖(ganoderma lucidum polysaccharides，GLPS)是从灵芝孢子粉中提炼出的多糖成分，是孢子粉中最活跃、最具营养的成分[11]，具有增强免疫功能、抗肿瘤、清除自由基、延缓衰老、保护神经等作用[12-13]。目前已有研究发现灵孢多糖能增强细胞的免疫功能，激活免疫反应，从而抑制肿瘤扩散[14]，虽然对灵孢多糖的研究日益热门，但灵孢多糖调控线粒体功能及氧化应激的研究还未见报道。过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞是氧化应激实验常用的细胞模型。因此，该实验以过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞为研究对象，探索灵孢多糖在改善细胞凋亡及线粒体功能障碍方面的机制，为进一步研究灵孢多糖的药用价值提供理论基础，也为治疗神经退行性疾病提供新思路和新方法。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞实验。
1.2 时间及地点实验于2022年9月至2023年6月在山西大同大学脑科学研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞株由国家中医药管理局益气活血法治疗多发性硬化重点研究室提供。该实验所有研究程序均按照中国山西大同大学伦理委员会要求实行(批准号2021021)。
1.3.2 实验试剂与仪器灵孢多糖注射液，规格：2 mL；4.5 mg(山西国润制药有限公司，国药准字 H20003510)；体积分数3%过氧化氢溶液(LIRCON)；胎牛血清(CellMax，货号SA101.02)；胰蛋白酶(GIBCO，货号25200056)；Pen-Strep(青霉素、链霉素溶液，GIBCO，货号15070063)；DMEM 基础培养基(GIBCO，货号C11995500BT)；Cell Counting Kit-8试剂盒(碧云天，货号C0043)；总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(碧云天，货号S0109)；脂质氧化检测试剂盒(碧云天，货号S0131S)；线粒体膜电位检测试剂盒(Yeasen，货号40706ES60)；兔抗Bax(CST，货号14796s)；兔抗Caspase-3(CST，货号9662s)；兔抗重组人线粒体分裂蛋白1(Fis1，CST，货号32525s)；兔抗p-Drp1(CST，货号3455s)；兔抗Mfn1(CST，货号14739)；兔抗Mfn2(CST，货号9482)；兔抗OPA1(CST，货号67589)；兔抗Bcl-2(ABclonal，货号A0208)；鼠抗GAPDH(BIOSS，货号5174S)；山羊抗兔IgG二抗(ABclonal，货号AS014)；山羊抗鼠IgG二抗(ABclonal，货号AS003)；Alex Flour 594羊抗兔IgG荧光二抗(Abcam，货号ab150080)；Alex Flour 594羊抗鼠IgG荧光二抗(Abcam，货号ab150116)。
1.4 实验方法
1.4.1 SH-SY5Y细胞的体外培养将冻存的SH-SY5Y细胞于37 ℃水浴锅复苏后，用含体积分数10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素溶液的DMEM培养基对细胞进行悬浮，随后离心弃上清液，以适宜密度将细胞接种于细胞培养皿，在体积分数5% CO2、37 ℃培养箱培养，待细胞密度铺至培养皿70%时将其传代。
1.4.2 CCK-8试剂盒筛选过氧化氢浓度将SH-SY5Y细胞传至第3代用于实验，以5×104个/孔密度接种于96孔板中(每孔100 μL细胞混悬液)，第2天加入过氧化氢溶液，使其浓度分别为0，200，250，300，350，400，450 μmol/L，同时设置只加入细胞培养液为空白组，以及只加入细胞和培养液为对照组，在CO2培养箱中避光孵育24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续避光孵育2 h，在酶标仪450 nm波长处测定吸光度值，选取对细胞的最佳干预浓度。
1.4.3 不同质量浓度灵孢多糖对SH-SY5Y细胞活性的影响将第3代SH-SY5Y细胞以5×104个/孔密度接种于96孔板中(每孔100 μL细胞混悬液)，待细胞在细胞培养箱中贴壁生长后，加入灵孢多糖溶液，使其终质量浓度分别为100，300，500 μg/μL，药物处理24 h后，每孔加入CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2 h，在酶标仪450 nm波长处测定吸光度值，计算灵孢多糖不同质量浓度下细胞的存活率。
1.4.4 灵孢多糖对过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞增殖的影响将SH-SY5Y细胞传至第3代，以5×104个/孔密度接种于96孔板中(每孔100 μL细胞混悬液)，分为对照组、过氧化氢组、灵孢多糖低剂量组、灵孢多糖中剂量组、灵孢多糖高剂量组，待细胞在培养箱中贴壁生长后，加入灵孢多糖溶液，使其终质量浓度分别为100，300，500 μg/μL，培养一两个小时后加入300 μmol/L过氧化氢溶液，避光处理24 h，每孔加入CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育2 h，在酶标仪450 nm波长处测定吸光度值，选取灵孢多糖对细胞的最佳作用质量浓度。
1.4.5 显微镜下观察过氧化氢及灵孢多糖对SH-SY5Y细胞形态的影响将第3代SH-SY5YS细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板中，分为对照组、过氧化氢组、灵孢多糖组，对照组正常培养，过氧化氢组加入300 μmol/L过氧化氢干预24 h，灵孢多糖组先加入300 μg/μL灵孢多糖溶液干预一两个小时，然后加入300 μmol/L过氧化氢干预24 h，在显微镜下观察细胞形态。
1.4.6 超氧化物歧化酶试剂盒与丙二醛试剂盒检测氧化应激相关指标将第3代SH-SY5Y细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板中，实验分组及干预见1.4.5，干预完成后取上清液，按试剂盒说明书检测氧化应激指标超氧化物歧化酶与丙二醛水平。
1.4.7 JC-1试剂盒检测线粒体膜电位将第3代SH-SY5Y细胞(1×104个)接种于共聚焦培养皿中，实验分组及干预见1.4.5，干预完成后PBS洗1次，加入1 mL配置好的JC-1染色工作液，于37 ℃细胞培养箱中染色20 min，吸弃上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入2 mL DMEM培养液，于激光共聚焦显微镜下观察。
1.4.8 TUNEL试剂盒检测细胞凋亡将第3代SH-SY5Y细胞以2×104个/孔密度接种于放置有细胞爬片的24孔板中，实验分组及干预见1.4.5，干预完成后PBS洗涤1次，吸弃上清，用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，PBS洗1次，加入含0.3%Triton X-100的PBS室温孵育5 min，PBS洗涤一两次，加入配置好的TUNEL检测液，在37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次，用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封固，于激光共聚焦显微镜下观察。
1.4.9 Western blot检测将第3代SH-SY5Y细胞以1×105个/孔密度接种于6孔板中，实验分组及干预见1.4.5，干预完成后提取全细胞蛋白，用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，用PVDF膜转膜，结束后用5%脱脂奶粉在室温下封闭两三个小时，然后加入以下一抗，分别为Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Caspase-3(1∶1 000)、Fis1(1∶1 000)、p-Drp1(1∶1 000)、OPA1(1∶1 000)、Mfn1(1∶1 000)、Mfn2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，选择相对应的鼠抗或兔抗室温下孵育1.5-2.0 h，通过化学发光底物(ECL)用ChemiDocTM成像系统观察记录，并用软件Image Lab进行定量分析。
1.4.10 免疫荧光染色将第3代SH-SY5Y细胞以2×104个/孔密度接种于放置有细胞爬片的24孔板中，实验分组及干预见1.4.5，干预完成后用40 g/L多聚甲醛固定细胞1 h，用含1%BSA的0.3%TritonX-100通透2 h，分别加一抗Cleaved caspase-3(1∶1 000)、OPA1(1∶1 000)、Mfn1(1∶1 000)、p-Drp1(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，选择相对应的荧光二抗避光孵育1.5-2.0 h，用含DAPI的抗荧光淬灭封片液封固，于激光共聚焦显微镜下观察。
1.5 主要观察指标超氧化物歧化酶与丙二醇水平；线粒体膜电位水平；细胞凋亡率；线粒体分裂与融合蛋白、细胞凋亡蛋白及氧化应激相关蛋白的表达。
1.6 统计学分析数据使用GraphPad Prism 9.0统计软件进行处理。计量资料均用x±s表示。多组间比较采用One-Way ANOVA分析，两两比较采用LSD-t检验，方差不齐用秩和检验。以P < 0.05 为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过山西大同大学统计学专家审核。

讨论

神经退行性疾病是全球致残率较高的疾病，在儿童和成年人身上都会发生，急剧增多的患病人口增加了全球的经济负担[15-16]。神经退行性疾病是由中枢神经系统的细胞结构破坏或功能逐渐丧失所导致，可出现运动障碍、行为异常和认知障碍等表现，到目前为止无直接延缓或预防神经退行性疾病的药物[17-18]。目前，关于神经退行性疾病的发病机制有很多学说，如线粒体功能障碍、细胞衰老、自噬、细胞凋亡等[19]。线粒体通过提供能量来维持细胞的稳态，但该过程中会产生活性氧。当线粒体功能障碍时，中和活性氧的物质如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性下调，活性氧就会大量产生，机体抗氧化过程出现失衡，细胞出现氧化损伤，导致氧化应激及细胞凋亡，从而影响神经元的功能，破坏机体稳态[20-21]。目前，线粒体功能调控方面的研究是神经退行性疾病研究领域的热门方向，作用于这方面的药物较少。因此，寻找相关的药物成为目前研究的重大突破口。
灵芝孢子是灵芝成熟后菌盖中释放的卵型生殖细胞，其中的活性成分包括多糖、三萜类等，灵孢多糖就是从中提取的活性成分，随着对灵孢多糖的进一步研究发现，其具有抗氧化、抗炎等药理作用[22]，例如CAI等[23]通过脂多糖诱导BV2小胶质细胞，观察灵孢多糖对炎症模型的影响，结果发现灵孢多糖能抑制促炎细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素6和诱导型一氧化氮合酶的表达，上调抗炎细胞因子转化生长因子β的表达。目前虽然有研究证实灵孢多糖对帕金森病大鼠神经元有一定的神经保护作用[24]，但作用机制还未明确，并且灵孢多糖的抗氧化性未有相关实验证明。因此为了进一步探究灵孢多糖在神经保护方面的相关机制，该实验使用过氧化氢诱导SH-SY5Y细胞凋亡，观察灵孢多糖对过氧化氢诱导的氧化应激损伤的影响。SH-SY5Y细胞(人神经母细胞瘤细胞)来自SK-N-SH细胞系，该细胞系最初是从1名转移性神经母细胞瘤患者的骨髓活检中培养出来的，目前SH-SY5Y细胞已被广泛用于神经退行性疾病的致病分子机制研究[25]。
超氧化物歧化酶和丙二醛是氧化应激的重要指标[26]，该研究结果显示过氧化氢组较对照组的超氧化物歧化酶活性显著降低，丙二醛水平显著升高；而用灵孢多糖治疗后，超氧化物歧化酶活性显著升高，丙二醛水平显著降低，证明灵孢多糖可以抑制过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤。细胞凋亡也称为细胞程序性死亡[27]。既往的研究显示，细胞的过度凋亡与神经退行性疾病发病密切相关，Bax和Caspase-3是细胞凋亡相关蛋白，Bax可通过改变线粒体结构，导致细胞释放凋亡因子，促进细胞凋亡；Caspase-3被激活后，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2正常功能，加快细胞凋亡[28-29]，细胞过度凋亡加速氧化应激进程，影响细胞正常生理功能，导致线粒体功能障碍，从而导致神经退行性疾病发病率增加。JC-1、TUNEL试剂盒和Western blot结果表明，灵孢多糖能够显著增加过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞线粒体膜电位，降低细胞凋亡率，抑制凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达，同时促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而减轻过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤。
线粒体分裂与融合的动态平衡保证了正常的线粒体功能，线粒体融合是指两个线粒体合成一个更大的线粒体，分裂则是指分裂成两个更小的线粒体[30-31]。Mfn1、Mfn2与OPA1都是与线粒体融合相关的蛋白，其缺乏导致线粒体动力学和能量代谢异常，OPA1主要分布在线粒体内膜上，通过各种酶水解蛋白质产生对应的维持线粒体稳态的蛋白质异构体，其表达异常则会导致线粒体形态改变，影响线粒体分裂与融合的机制。Mfn2在线粒体内与抗凋亡蛋白质Bcl-2相互作用，共同保护细胞凋亡，避免其过度凋亡，保护线粒体形态及功能，避免线粒体功能障碍影响退行性疾病发病[32]。p-Drp1/Fis1的相互作用与神经退行性疾病病理过程中的线粒体分裂有关，过度分裂会诱发氧化应激[33-34]，导致线粒体功能异常，甚至出现严重的线粒体障碍，引发各种疾病，包括神经退行性疾病。该研究中Western blot与免疫荧光结果表明，过氧化氢可导致SH-SY5Y细胞内Mfn1、Mfn2、OPA1蛋白表达显著降低，Fis1和p-Drp1蛋白表达显著增加，灵孢多糖处理后，能够显著增加过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞内Mfn1、Mfn2和OPA1蛋白的表达，同时显著抑制Fis1和p-Drp1蛋白的表达，促进线粒体动力学平衡，从而有利于细胞的生长。
综上所述，灵孢多糖能够通过改善线粒体功能障碍来减轻过氧化氢诱导的SH-SY5Y细胞氧化应激损伤，抑制细胞过度凋亡，这可能是通过调控凋亡相关蛋白、线粒体分裂与融合相关蛋白的表达来实现的，但具体机制尚未明确，这些结果为进一步探讨灵孢多糖在神经退行性疾病的作用及其临床应用前景提供了一定的理论基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

灵孢多糖对过氧化氢致SH-SY5Y细胞凋亡及线粒体功能障碍的调控

Regulatory effect of Ganoderma lucidum polysaccharides on H2O2-induced apoptosis and mitochondrial dysfunction in SH-SY5Y cells

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 8

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	杨毅峰, 叶楠, 王琳, 郭帅成, 黄健. 右美托咪定抗缺血再灌注损伤的信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(9): 1464-1469.
[2]	娄国, 张艳, 付常喜. 内皮型一氧化氮合酶在运动预适应改善心肌缺血-再灌注损伤中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(8): 1283-1288.
[3]	潘小龙, 樊飞燕, 应春苗, 刘飞祥, 张运克. 中药抑制间充质干细胞衰老的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1091-1098.
[4]	陈泽鹏, 侯永辉, 陈树东, 侯宇, 林定坤. 牛磺熊去氧胆酸干预缺糖缺氧条件下脊髓神经元的凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(4): 528-534.
[5]	曹胜, 孔令伟, 徐昆, 孙志杰. 负载丹酚酸B甲基丙烯酰化明胶水凝胶对椎间盘退变的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 380-386.
[6]	段彦哲, 滑键林, 丁智斌, 江楠, 宋丽娟, 闫玉清, 马存根. 细胞凋亡在缺血性脑卒中过程中作用的可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4145-4150.
[7]	陶经纬, 周婧雅, 赵毅, 任敬佩, 胡传宇, 徐林, 穆晓红, 范筱. 川芎嗪对脊髓损伤大鼠铁死亡的调控作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4158-4163.
[8]	罗善超, 唐继仁. 橙皮素抑制氧化应激影响软骨细胞的炎性退变[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(26): 4184-4188.
[9]	况园军, 于素美, 钟颖怡, 章旭红, 马胜超, 杨安宁, 郝银菊, 熊建团, 焦运, 姜怡邓. 环状RNA hsa-circ-0001360在同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4060-4064.
[10]	何波, 何志军, 刘涛, 马岁录, 魏晓涛, 王威威. 间充质干细胞治疗皮瓣缺血再灌注损伤的作用机制及优势[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4065-4071.
[11]	闫炳翰, 李志超, 苏辉, 薛海鹏, 徐展望, 谭国庆. 天然产物调控氧化应激治疗骨质疏松症[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(24): 3915-3921.
[12]	谢婷, 刘婷婷, 曾雪慧, 李亚敏, 周庞虎, 易念华. 岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3609-3614.
[13]	郑俭彬, 陆玉春, 江自鲜, 李秀芳, 王涛, 王文静. 彝药斯赤列甲醇提取物对骨关节炎模型大鼠的治疗作用及靶点预测[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3627-3635.
[14]	马万里, 杨红胜, 屈波, 张正东, 龚凯, 林炎水. 黄芩素预防大鼠激素性股骨头坏死的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3661-3668.
[15]	海振, 宁忠平. 红景天苷对血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞纤维化的保护作用[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3137-3142.