岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

doi:10.12307/2024.416

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (23): 3609-3614.doi: 10.12307/2024.416

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岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

谢婷1，刘婷婷1，曾雪慧1，李亚敏1，周庞虎2，易念华1

1湖北省妇幼保健院妇女保健科，湖北省武汉市 430070；2武汉大学人民医院骨科，湖北省武汉市 430060

收稿日期:2023-05-13 接受日期:2023-07-08 出版日期:2024-08-18 发布日期:2023-09-12
通讯作者: 易念华，硕士，主任医师，湖北省妇幼保健院妇女保健科，湖北省武汉市 430070 周庞虎，主任医师，博士生导师，武汉大学人民医院骨科，湖北省武汉市 430060
作者简介:谢婷，女，1981年生，湖北省荆州市人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事骨质疏松等疾病研究。
基金资助:
湖北省重点研发计划项目(2021BCA147)，项目负责人：周庞虎

Fucoxanthin alleviates glucocorticoid-induced osteoblast apoptosis by activating nuclear factor erythroid-2-related factor 2

Xie Ting1, Liu Tingting1, Zeng Xuehui1, Li Yamin1, Zhou Panghu2, Yi Nianhua1

1Department of Women’s Health Care, Maternal and Child Health Hospital of Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei Province, China; 2Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Received:2023-05-13 Accepted:2023-07-08 Online:2024-08-18 Published:2023-09-12
Contact: Yi Nianhua, Master, Chief physician, Department of Women’s Health Care, Maternal and Child Health Hospital of Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei Province, China Zhou Panghu, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province, China
About author:Xie Ting, Master, Associate chief physician, Department of Women’s Health Care, Maternal and Child Health Hospital of Hubei Province, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Supported by:
Hubei Provincial Key Research And Development Program, No. 2021BCA147 (to ZPH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

糖皮质激素：被广泛应用于炎症性疾病与免疫性疾病，是继发性骨质疏松症最主要的诱因，能够通过诱导成骨细胞凋亡促进破骨细胞分化等途径导致骨吸收。糖皮质激素干预成骨细胞能够作为骨质疏松症的体外模型用于实验研究。
岩藻黄质：是世界上含量最丰富的类胡萝卜素，能够从海藻等植物中提取制备，生产成本低，同时具有良好的抗氧化性与抗炎特性。由于骨质疏松症的传统治疗药物不良反应较多，基于新型植物源性药物探索骨质疏松症安全有效的干预方式具有重要临床意义。

背景：骨质疏松症发病率高，易导致骨折等并发症的发生，而现有药物干预不良反应大，难以满足临床需求。

目的：探索岩藻黄质对糖皮质激素诱导成骨细胞骨质疏松症模型的作用与潜在机制。
方法：将原代大鼠成骨细胞接种于6孔板内，待细胞融合度达到80%后分4组干预：对照组单纯培养24 h，糖皮质激素组使用地塞米松干预24 h，岩藻黄质组使用岩藻黄质干预24 h，糖皮质激素+岩藻黄质组使用地塞米松与岩藻黄质同时干预24 h。干预结束后，检测细胞增殖、凋亡、细胞内活性氧含量以及凋亡相关蛋白、骨形成相关蛋白、细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达。

结果与结论：①CCK-8检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组细胞活性降低(P < 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组细胞活性升高(P < 0.05)；②JC-1线粒体膜电位染色与流式细胞学检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组细胞凋亡比例增加(P < 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组细胞凋亡比例减少(P < 0.05)；③Western Blot检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达升高(P < 0.05)，BCL2、Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达降低(P < 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达降低(P < 0.05)，BCL2、Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达升高(P < 0.05)；④荧光探针检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组活性氧含量增加(P < 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组活性氧含量减少(P < 0.05)；⑤免疫荧光染色与Western Blot检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达降低(P < 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组细胞核核因子E2相关因子2的蛋白表达升高(P < 0.05)；⑥结果表明，岩藻黄质通过活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡与骨形成相关分子表达。

https://orcid.org/0009-0004-8565-4464(谢婷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨质疏松症, 糖皮质激素, 成骨细胞, 细胞凋亡, 岩藻黄质, 活性氧, 核因子E2相关因子2, 核转位

Abstract: BACKGROUND: Osteoporosis has a high incidence, leading to fracture and other complications. However, existing drugs have great side effects and are difficult to meet the clinical application.
OBJECTIVE: To explore the effect and potential mechanism of fucoxanthin on osteoporosis induced by glucocorticoid.
METHODS: Primary rat osteoblasts were inoculated in 6-well plates. When the cell fusion reached 80%, the cells were divided into four groups: the control group was cultured alone for 24 hours, the glucocorticoid group was intervened with dexamethasone for 24 hours, the fucoxanthin group was intervened with fucoxanthin for 24 hours, and the glucocorticoid + fucoxanthin group was intervened with dexamethasone and fucoxanthin at the same time for 24 hours. After intervention, cell proliferation, apoptosis, intracellular reactive oxygen species level, and protein expression of apoptosis-related proteins, bone formation-related proteins, and nuclear factor erythroid-2-related factor 2 were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Cell counting kit-8 results showed that the cell viability was decreased in the glucocorticoid group compared with the control group (P < 0.05) but increased in the glucocorticoid+fucoxanthin group compared with the glucocorticoid group (P < 0.05). JC-1 mitochondrial membrane potential staining and flow cytometry assay showed that the percentage of apoptosis increased in the glucocorticoid group compared with the control group (P < 0.05) but decreased in the glucocorticoid+fucoxanthin group compared with the glucocorticoid group (P < 0.05). Western blot assay showed that compared with the control group, the protein expression of BAX and cleaved poly (ADP-ribose) polymerase was elevated in the glucocorticoid group (P < 0.05), and the protein expression of BCL2, type I collagen α1 peptide chain, alkaline phosphatase, osteocalcin, and RUNX2 was decreased in the glucocorticoid group (P < 0.05). Compared with the glucocorticoid group, the protein expression of BAX and cleaved poly (ADP-ribose) polymerase was decreased (P < 0.05), and the protein expression of BCL2, type I collagen α1 peptide chain, alkaline phosphatase, osteocalcin, and RUNX2 was elevated (P < 0.05) in the glucocorticoid+fucoxanthin group. Fluorescent probe assay showed an increase in reactive oxygen species level in the glucocorticoid group compared with the control group (P < 0.05) and a decrease in reactive oxygen species level in the glucocorticoid+fucoxanthin group compared with the glucocorticoid group (P < 0.05). Immunofluorescence staining and western blot assay showed that the protein expression of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 in the glucocorticoid group was decreased compared with that in the control group (P < 0.05); and the protein expression of nuclear factor erythroid-2-related factor 2 in the glucocorticoid+fucoxanthin group was elevated compared with that in the glucocorticoid group (P < 0.05). To conclude, fucoxanthin can improve glucocorticoid-induced osteoblast apoptosis and the expression of bone formation-related molecules by activating nuclear factor erythroid-2-related factor 2.

Key words: osteoporosis, glucocorticoid, osteoblast, apoptosis, fucoxanthin, reactive oxygen species, nuclear factor erythroid-2-related factor 2, nuclear translocation

中图分类号:

谢婷, 刘婷婷, 曾雪慧, 李亚敏, 周庞虎, 易念华. 岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3609-3614.

Xie Ting, Liu Tingting, Zeng Xuehui, Li Yamin, Zhou Panghu, Yi Nianhua. Fucoxanthin alleviates glucocorticoid-induced osteoblast apoptosis by activating nuclear factor erythroid-2-related factor 2[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3609-3614.

图/表（结果） 9

2.1 岩藻黄质适宜浓度筛选结果岩藻黄质是一种广泛存在于海藻中的类胡萝卜素，其分子式见图1A。使用不同浓度的岩藻黄质干预成骨细胞，发现2.5 μmol/L是最高的无毒浓度，见图1B。因此，使用2.5 μmol/L作为干预浓度用于后续实验。

2.2 各组成骨细胞增殖检测结果 CCK-8检测结果显示，与对照组比较，糖皮质激素组细胞活性降低(P < 0.05)，藻岩黄质组细胞活性无明显变化(P > 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组细胞活性升高(P < 0.05)，见图2。

2.3 各组成骨细胞凋亡检测结果 JC-1线粒体膜电位染色显示，与对照组比较，糖皮质激素组健康线粒体减少(即红色聚合体荧光强度降低)，异常线粒体增加(即绿色单体荧光强度升高)，意味着细胞处于凋亡状态，岩藻黄质组线粒体无明显变化；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组健康线粒体增加(即红色聚合体荧光强度升高)，异常线粒体减少(即绿色单体荧光强度降低)，见图3。

Annexin V-FITC/PI染色后流式细胞学检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组细胞凋亡比例增加(P < 0.05)，藻岩黄质组细胞凋亡比例无明显变化；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组细胞凋亡比例减少(P < 0.05)，见图4。

2.4 各组成骨细胞凋亡蛋白表达检测结果见图5。

Western Blot检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达升高(P < 0.05)，BCL2的蛋白表达降低(P < 0.05)，藻岩黄质组各蛋白表达无明显变化(P > 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组BAX、裂解聚ADP核糖聚合酶的蛋白表达降低(P < 0.05)，BCL2的蛋白表达升高(P < 0.05)。
2.5 各组成骨细胞内活性氧水平与对照组比较，糖皮质激素组细胞内活性氧水平升高(P < 0.05)，岩藻黄质组细胞内活性氧水平无明显变化(P > 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组细胞内活性氧水平降低(P < 0.05)，见图6。结果证实，岩藻黄质对成骨细胞凋亡的保护作用可能是抑制糖皮质激素引起的活性氧水平升高介导的。

2.6 各组成骨细胞骨形成相关蛋白表达检测结果 Western Blot检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达降低(P < 0.05)，藻岩黄质组各蛋白表达无明显变化(P > 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组Ⅰ型胶原蛋白α1肽链、碱性磷酸酶、骨钙蛋白、RUNX2的蛋白表达升高(P < 0.05)，见图7。

2.7 各组成骨细胞内NRF2活性检测结果 NRF2是调控抗氧化应激的一种关键转录因子，在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用[22]。Western Blot检测显示，与对照组比较，糖皮质激素组NRF2蛋白表达降低(P < 0.05)，藻岩黄质组NRF2蛋白表达无明显变化(P > 0.05)；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组NRF2蛋白表达升高(P < 0.05)，见图8A。免疫荧光染色显示，与对照组比较，糖皮质激素组细胞核NRF2表达降低，藻岩黄质组细胞核NRF2表达无明显变化；与糖皮质激素组比较，糖皮质激素+岩藻黄质组细胞核NRF2蛋白表达升高(P < 0.05)，见图8B。

以上结果证实，岩藻黄质对成骨细胞的保护作用是通过提高NRF2活性介导的。

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引言

骨质疏松症是一种以骨矿物密度与质量降低为特点的代谢性骨病，中国中老年人群中骨质疏松症患病率已达19.2%，显著增加了骨折风险，带来了极大的社会与家庭经济负担[1-3]。糖皮质激素在临床上被广泛应用于炎症性和免疫性疾病的治疗，但长期接触糖皮质激素会增加骨质疏松症发生的风险，糖皮质激素性骨质疏松症已成为继发性骨质疏松症最主要的类型[4]。超生理水平糖皮质激素会产生大量的活性氧，从而诱导氧化应激，导致成骨细胞凋亡及骨形成降低，最终引起骨质流失[5]。多项研究证实，激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，NRF2)可以保护细胞免受氧化应激损伤和细胞凋亡，从而防止氧化应激诱导的骨质疏松症发生和进展[6-7]。因此，针对氧化应激触发的成骨细胞凋亡开发新型干预策略是骨质疏松症的研究热点。
目前骨质疏松症的常规治疗药物主要为钙剂与骨吸收抑制剂，例如双膦酸盐等[8]，然而高剂量长疗程应用带来的如颌骨坏死、非典型骨折等不良反应逐渐受到了人们的重视[9-10]，因此开发更加安全有效的骨质疏松症治疗策略具有重要意义。
营养因素与骨质流失相关，越来越多的学者开始关注与骨质疏松症密切相关的营养成分[11]。类胡萝卜素具有优异的抗炎抗氧化作用，在心血管疾病、代谢性疾病乃至肿瘤中具有重要治疗价值[12-13]。在骨质代谢中，每天摄入胡萝卜等蔬菜人群的骨量显著高于不每天摄入的人群[14]。血清学分析发现，有益骨骼作用的类胡萝卜素在骨质疏松症女性中较低[15]。因此，类胡萝卜素对于骨质疏松症的预防与治疗可能具有重要价值。岩藻黄质是最丰富的类胡萝卜素，占地球上类胡萝卜素总量的近10%[16]，并且相比于其他类胡萝卜素具有生产成本低、抗氧化作用强等优势[17]。岩藻黄质已在糖尿病、肿瘤及肥胖症领域展现出重要的预防与治疗作用[18]。体外研究发现，岩藻黄质处理能够通过激活NRF2信号抑制破骨细胞分化[19-20]。动物研究证实，岩藻黄质能通过抑制氧化应激相关的破骨细胞形成减弱牙周炎中的骨吸收[21]。然而，岩藻黄质在体内外对成骨细胞的作用以及对于骨质疏松症的影响仍不明确。此次实验探讨岩藻黄质对体外成骨细胞活性及骨形成相关分子表达的影响，并研究了其在糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡中的作用与机制，为骨质疏松症的饮食疗法提供了新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验，对于正态分布的数据，采用单因素方差分析与事后检验进行统计分析；对于非正态分布的数据，采用曼-惠特尼双尾非参数检验进行统计分析。
1.2 时间及地点实验于2021年1月至2022年12月在武汉大学中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验用细胞原代大鼠成骨细胞购于武汉普诺赛生物技术有限公司。
1.3.2 主要仪器和试剂岩藻黄质(纯度98.99%)、地塞米松(Medchemexpress公司)；CCK-8细胞活性检测试剂盒(南京建成)；超敏ECL发光液(雅酶)；DCFH荧光探针、DHE荧光探针(Yeason)；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(赛维尔)；抗BAX抗体、抗聚ADP核糖聚合酶抗体(三鹰)；抗BCL2抗体、抗核纤层蛋白B1(Cohesion)；抗Ⅰ型胶原蛋白α1肽链抗体、抗碱性磷酸酶抗体、抗RUNX2抗体、抗骨钙蛋白抗体、抗β-肌动蛋白抗体、抗NRF2抗体(爱博泰克)；核蛋白提取试剂盒(万类生物)；MEM-α培养基(普诺赛)；Microplate reader酶标仪(EnVision)；荧光显微镜(Olympus)；ChemiDoc MP扫膜仪(Bio-Rad)；流式细胞仪(贝克曼)。
1.4 实验方法
1.4.1 筛选岩藻黄质适宜浓度将成骨细胞种植于96孔板内，细胞密度为5×103/孔，待24 h细胞黏附后，将培养基替换为含0，0.1，0.5，1，2.5，5，10，20 μmol/L岩藻黄质的MEM-α培养基，培养第24，48小时向培养基中添加CCK-8试剂，于37 ℃培养箱中孵育2 h，通过酶标仪检测450 nm处的吸光度值。此部分实验用以筛选适宜浓度的岩藻黄质用于后续实验。
1.4.2 实验分组及干预将成骨细胞以5×105/孔的密度种植于6孔板中，待细胞融合度达到80%后分4组干预：对照组不进行任何干预，单纯培养24 h；糖皮质激素组使用1 μmol/L地塞米松干预24 h；岩藻黄质组使用2.5 μmol/L岩藻黄质干预24 h；糖皮质激素+岩藻黄质组为两者同时干预24 h。
1.4.3 CCK-8法检测细胞增殖干预结束后，培养基中添加CCK-8试剂，于37 ℃培养箱中孵育2 h，通过酶标仪检测450 nm处的吸光度值。
1.4.4 Western Blot检测相关蛋白表达干预结束后，利用 Western Blot检测细胞内凋亡相关蛋白、骨形成相关蛋白、NRF2的蛋白表达。用含有蛋白酶抑制剂和苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液提取成骨细胞蛋白，核蛋白利用核蛋白提取试剂盒进行蛋白提取；对于每个样品，将总量为40 μg的蛋白上样到SDS聚丙烯酰胺凝胶上，电泳后将蛋白转印至PVDF膜上；使用5%脱脂牛奶封闭并分别使用抗BAX(1∶1 000)、抗BCL2(1∶1 000)、抗聚ADP核糖聚合酶(1∶1 000)、抗Ⅰ型胶原蛋白α1肽链(1∶1 000)、抗碱性磷酸酶(1∶1 000)、抗RUNX2(1∶1 000)、抗骨钙蛋白(1∶1 000)、抗β-ACTIN(1∶1 000)、抗NRF2(1∶1 000)和抗核纤层蛋白B1(1∶1 000)4 ℃孵育过夜；在TBST洗涤后，与HRP缀合的二抗室温孵育1 h，通过化学发光仪可视化条带。
1.4.5 JC-1线粒体膜电位染色检测细胞凋亡干预结束后，跟据试剂商的方案，在完全培养基中用JC-1染色试剂处理细胞15 min，随后在荧光显微镜下采集图像。图像荧光强度使用Image J软件进行定量分析。
1.4.6 Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡干预结束后，用不含EDTA的胰酶消化并收集细胞，以预冷的PBS洗涤细胞2次。加入100 μL Binding Buffer重悬细胞，使用5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染液进行染色，室温反应30 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡比例。
1.4.7 活性氧荧光探针分析成骨细胞经糖皮质激素与岩藻黄质干预结束后替换为无血清培养基，向细胞内加入10 μmol/L的DCFH或DHE荧光探针，避光并在37 ℃下孵育30 min，随后用PBS洗去多余的探针，在荧光显微镜下采集图像。图像荧光强度使用Image J软件进行定量分析。
1.4.8 NRF2免疫荧光染色干预结束后取出细胞爬片，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，利用0.2%曲拉通通透10 min后加入山羊血清封闭；随后与NRF2抗体(1∶200)在4 ℃孵育过夜；此后，将细胞与Cy3缀合的山羊抗兔二抗孵育2 h，并使用DAPI染细胞核；最后，使用荧光显微镜观察并拍照，使用Image J软件对荧光强度进行定量分析。
1.5 主要观察指标各组成骨细胞的增殖、凋亡、细胞内活性氧含量以及细胞内凋亡相关蛋白、骨形成相关蛋白、NRF2的蛋白表达。
1.6 统计学分析所有数据均使用x±s展示，使用GraphPad Prism (Version 7.0)软件分析数据并绘图。数据使用Shapiro-Wilk检验进行正态性分析，对于正态分布的数据，采用单因素方差分析与事后检验进行统计分析；对于非正态分布的数据，采用曼-惠特尼双尾非参数检验进行统计分析。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已通过武汉大学人民医院生物统计学专家审核。

讨论

糖皮质激素是继发性骨质疏松症最主要的病因，易导致骨折等并发症的发生，带来巨大社会经济负担[23]。现有药物虽能在一定程度上改善骨质疏松的症状，但长期服用会导致诸多不良反应[24]，例如：抗骨吸收药物双膦酸盐容易引起非典型股骨骨折和颌骨坏死[25]，促骨合成药物甲状旁腺激素类蛋白有促进骨肉瘤发生的潜在风险[26]。近期开发的人源化单克隆抗硬化素抗体Romosozumab可以刺激骨形成的同时抑制骨吸收，在临床研究中表现出比双膦酸盐更好的治疗效果[27-28]，然而与双膦酸盐相比，接受Romosozumab治疗的女性具有更高的严重心血管事件发生率[29]。Denosumab是一种近期研究提出的针对核因子κB配体受体致活剂蛋白的单克隆抗体，能够显著抑制破骨细胞发育，从而治疗骨质疏松症[30]，但其停药后具有多发性椎骨骨折的风险[27]。因此，开发安全有效的骨质疏松干预策略意义重大。
岩藻黄质是世界上最丰富的类胡萝卜素，具有来源广泛、生产成本低以及抗氧化能力高等特点。岩藻黄质已被证实在多种炎性疾病、肥胖及肿瘤等疾病中具有治疗作用[31-33]。以往研究发现，岩藻黄质能够促进干细胞的成骨分化、抑制破骨细胞的分化与活性，提示岩藻黄质在骨质疏松症中的治疗潜力[20，34-35]，然而其对成骨细胞的作用仍有争议。WALSH等[35]发现岩藻黄质干预并不会影响成骨细胞合成骨形成相关分子的能力，但高浓度的岩藻黄质会抑制成骨细胞的活性。此次研究结果显示，安全浓度下的岩藻黄质不会影响成骨细胞的活性与功能，在糖皮质激素干预下岩藻黄质对成骨细胞具有保护作用，表现在岩藻黄质能够促进成骨细胞合成骨形成相关分子、同时抑制成骨细胞凋亡。以上结果证实，岩藻黄质在病理条件下对成骨活性与功能的保护作用。
包括羟自由基、过氧化氢以及超氧阴离子在内的活性氧形成于氧化磷酸化和其他酶促过程中氧的不完全还原反应，是调节细胞增殖、分化和存活的重要信号分子[36]。在病理条件下，活性氧的形成超过细胞氧化防御能力的调节极限，从而引发细胞氧化应激，介导多种病理进程的发生发展，其中包括细胞凋亡[37-38]。因此，考虑到岩藻黄质独特的还原性，此次研究评价了岩藻黄质对成骨细胞内活性氧水平的影响。DCFH和DHE是传统的活性氧荧光探针，前者与广泛的活性氧成分发生反应产生荧光，而后者主要用于评价超氧阴离子的含量[39]，此次研究联合以上两种方法对活性氧含量进行稳健的评估，结果发现糖皮质激素显著增加了成骨细胞内DCFH以及DHE荧光强度，这与先前的研究结果相一致[40]；而岩藻黄质部分逆转了糖皮质激素诱导的DCFH以及DHE荧光强度增高，这提示岩藻黄质对成骨细胞保护作用可能是活性氧依赖的。同时，岩藻黄质干预不会抑制正常成骨细胞内活性氧的浓度，提示岩藻黄质可能不影响生理条件下活性氧介导的信号传导，因此具有相对安全性。
NRF2是细胞内调节抗氧化基因的关键转录因子，负责诱导各种细胞防御机制以抵抗氧化应激反应[41]。研究证实NRF2核转位会激活其抗氧化靶基因的转录，从而阻止细胞的氧化应激损伤[42]。抗凋亡基因例如BCL2也是NRF2的转录作用靶点，激活NRF2的表达能够在广泛细胞中观察到凋亡保护作用[43-44]。此外，NRF2已被证实是一种关键的抗骨质疏松症因子，调节NRF2活性在体内外均显示出显著的骨质疏松症治疗作用[45]。激活NRF2可以抑制成骨细胞的死亡与衰老，减少破骨细胞的形成[46-47]。除了直接的抗氧化作用，诸多类胡萝卜素被证实可以通过激活NRF2活性来增强细胞抵抗氧化损伤的能力[48]。因此，此次实验评价了岩藻黄质对成骨细胞细胞核NRF2活性的影响，结果发现岩藻黄质能够促进NRF2核转来增强其转录活性，证实了岩藻黄质对成骨细胞的保护作用还可能是通过促进NRF2核转位介导的。
研究仍然具有一定的局限性：首先，应当进一步建立骨质疏松症动物模型以探索岩藻黄质在动物体内的治疗作用，并评价其生物安全性；此外，需进一步探索岩藻黄质激活NRF2的具体分子调控途径，以揭示其在激素诱导骨质疏松症中的详细作用机制。
总之，该研究首次证实了岩藻黄质通过抑制活性氧含量、增加NRF2活性来抑制激素诱导的成骨细胞凋亡，促进骨形成相关分子表达的作用机制，见图9，揭示了激素性骨质疏松症的新型干预策略，对于骨质疏松症的预防与治疗具有一定参考价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

岩藻黄质活化核因子E2相关因子2改善糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡

Fucoxanthin alleviates glucocorticoid-induced osteoblast apoptosis by activating nuclear factor erythroid-2-related factor 2

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