NLRP3炎性小体及炎症因子水平预测糖尿病足溃疡皮瓣修复后的早期感染

doi:10.12307/2024.425

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

半胱天冬酶1(Caspase-1) mRNA：Caspase-1属炎性介导因子，而Caspase-1 mRNA是Caspase-1的表达形式，主要在巨噬细胞和神经元以外的各种细胞类型和组织中表达。当宿主细胞被病原体感染时，可以通过识别特定的特异性蛋白，启动宿主细胞的凋亡，清除抗原，起到抗病毒的作用。
凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC) mRNA：是ASC编码表达水平的方式，主要在单核细胞和黏膜上皮细胞中表达。ASC是MASUMOTO等在1999年于日本衰老研究中心发现的一种蛋白，因在细胞凋亡时能在细胞质中聚集成中空的斑块而得名，其在炎症、免疫调节等方面广泛发挥作用。

背景：研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β均可以通过诱发炎症级联反应释放炎症因子、影响代谢应激、损伤内皮细胞等参与糖尿病足溃疡的发生、发展，可以为早期感染提供参考。

目的：进一步探讨外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平对糖尿病足溃疡皮瓣修复术后早期感染的预测价值。
方法：选取糖尿病足溃疡患者147例，根据术后1周内发生感染的情况分为感染组与非感染组，Logistic回归分析外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平与术后早期感染的关系，并评估预测价值。

结果与结论：①147例糖尿病足溃疡患者术后1周内发生感染35例(23.8%)，分离致病菌47株，含革兰阳性菌25株(53.19%)；革兰阴性菌22株(46.81%)。②单因素分析显示，Wagner分级、是否合并糖尿病肾病、手术时间、外周血NLRP3、Caspase-1及ASC的mRNA、白细胞介素18、白细胞介素1β水平均是影响术后早期感染的危险因素(均P < 0.05)。③多因素分析提示，Wagner分级、NLRP3、Caspase-1及ASC 的mRNA、高白细胞介素18、白细胞介素1β均是影响术后早期感染的独立危险因素(均P < 0.05)。④ROC曲线结果显示，NLRP3、Caspase-1及ASC的mRNA、白细胞介素18、白细胞介素1β对糖尿病足溃疡患者术后早期感染的区分效能曲线下面积(AUC)分别为0.823，0.705，0.676，0.811和0.853，联合预测效能AUC为0.915。⑤结果说明，糖尿病足溃疡患者主要是受到革兰阳性菌的影响，且外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平是影响术后早期感染的独立危险因素，上述指标的联合预测效能更优，值得进一步深入研究。

https://orcid.org/0009-0004-0074-8147(盛玉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病足溃疡, 皮瓣修复术, 术后早期感染, NLRP3, 白细胞介素18, 白细胞介素1β

Abstract: BACKGROUND: Studies have shown that nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome, interleukin-18, and interleukin-1β levels can induce an inflammatory cascade response to release inflammatory factors, affect metabolic stress, and damage endothelial cells involved in the development and progression of diabetic foot ulcers, which can provide a reference for early infections.
OBJECTIVE: To investigate the predictive effect of peripheral blood mononuclear cell NLRP3 inflammasome, interleukin-18 and interleukin-1β levels on early infection after flap repair of diabetic foot ulcers.
METHODS: A total of 147 patients with diabetic foot ulcers were selected and divided into infection group and non-infection group according to whether they were infected within 1 week after operation. Logistic regression was used to analyze the relationship between NLRP3 inflammasome, interleukin-18 and interleukin-1β levels in peripheral blood mononuclear cells and early postoperative infections, and to evaluate their predictive values.
RESULTS AND CONCLUSION: In 147 patients with diabetic foot ulcers, 35 cases (23.81%) were infected within 1 week after operation, and 47 strains of pathogenic bacteria were isolated, including 25 strains of Gram-positive bacteria (53.19%) and 22 strains of Gram-negative bacteria (46.81%). Univariate analysis showed that Wagner grade, presence of comorbid diabetic nephropathy, operation time, peripheral blood NLRP3 mRNA, Caspase-1 mRNA, ASC mRNA, interleukin-18 and interleukin-1β levels were risk factors for early postoperative infections (all P < 0.05). Multivariate analysis suggested that Wagner grade, NLRP3 mRNA, Caspase-1 mRNA, ASC mRNA, high interleukin-18, interleukin-1β were independent risk factors (all P < 0.05). Receiver operator characteristic curve results showed that the area under the receiver operator characteristic curve of NLRP3 mRNA, Caspase-1 mRNA, ASC mRNA, interleukin-18 and interleukin-1β for early postoperative infections in patients with diabetic foot ulcers was 0.823, 0.705, 0.676, 0.811 and 0.853, respectively, and the area under the curve of combined predictive efficacy was 0.915. To conclude, patients with diabetic foot ulcers are mainly affected by Gram-positive bacteria, and the levels of NLRP3 inflammasome, interleukin-18 and interleukin-1β in peripheral blood mononuclear cells are independent risk factors for early postoperative infections. The combined prediction efficacy of these indicators is better and deserves further in-depth study.

Key words: diabetic foot ulcer, flap repair, early postoperative infection, NLRP3, interleukin-18, interleukin-1β

中图分类号:

盛玉, 杨秋娜, 王强, 易建云. NLRP3炎性小体及炎症因子水平预测糖尿病足溃疡皮瓣修复后的早期感染[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3615-3620.

Sheng Yu, Yang Qiuna, Wang Qiang, Yi Jianyun. NLRP3 inflammasome and inflammatory factor levels predict early infection after flap repair of diabetic foot ulcers[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(23): 3615-3620.

图/表（结果） 5

2.1 参与者数量分析纳入的147例患者全部进入结果分析。
2.2 患者皮瓣修复术后早期感染及病菌分布情况 147例糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后1周内发生感染的例数为35例，发生率为23.8%。35例术后早期感染患者中共分离出47株致病菌，包括革兰阳性菌25株，占比53.19%；革兰阴性菌22株，占比46.81%。因此，革兰阳性菌是主要影响患者皮瓣修复术后早期感染菌群，见表1。

2.3 患者皮瓣修复术后早期感染的单因素分析结果表2结果显示，Wagner分级、是否合并糖尿病肾病、手术时间、外周血NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA表达及白细胞介素18、白细胞介素1β水平、皮瓣种类、皮瓣术后成活情况均是影响糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的相关危险因素(均P < 0.05)。

2.4 影响患者皮瓣修复术后早期感染的多因素Logistic回归分析结果
2.4.1 各因素变量的赋值以糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染发生情况为因变量，以Wagner分级情况、合并糖尿病肾病情况、手术时间情况及外周血NLRP3、Caspase-1及ASC的 mRNA、白细胞介素18、白细胞介素1β水平、皮瓣种类、皮瓣术后成活情况等相关危险因素为自变量，做影响糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的多因素Logistic回归分析。对各因素变量进行赋值，非感染发生赋值为0，感染发生赋值为1；Wagner分级3级为0，4级为1；没有合并糖尿病肾病赋值为0，已合并赋值为1；手术时间< 5 h为0，≥5 h赋值为1；带蒂瓣赋值为0，游蒂瓣为1；皮瓣术后成活为0，不成活为1；NLRP3、Caspase-1及ASC的mRNA、白细胞介素18、白细胞介素1β以实测值输入。
2.4.2 多因素Logistic回归分析结果提示，高Wagner分级(OR=7.799，95%CI=1.790-33.986)、高NLRP3 mRNA水平(OR=5.618，95%CI=2.476-12.747)、高Caspase-1 mRNA水平(OR=5.496，95%CI=1.972-15.319)、高ASC mRNA水平(OR=5.557，95%CI=2.102-14.690)、高白细胞介素18水平(OR=1.809，95%CI=1.227-2.667)、高白细胞介素1β水平(OR=2.499，95%CI=1.365-4.574)、游离瓣(OR=0.245，95%CI=0.109-0.552)、皮瓣术后失活情况(OR=0.087，95%CI=0.036-0.209)均是影响糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的独立危险因素(均P < 0.05)，见表3。

2.5 外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平对糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的预测价值 ROC曲线结果显示，NLRP3、Caspase-1及ASC mRNA、白细胞介素18、白细胞介素1β对糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的区分效能AUC分别为0.823(95%CI=0.729-0.918，P < 0.001)、0.705(95%CI=0.589-0.821，P < 0.001)、0.676(95%CI=0.557-0.795，P=0.002)、0.811 (95%CI=0.709-914，P < 0.001)、0.853(95%CI=0.757-0.948，P < 0.001)，联合预测效能AUC为0.915(95%CI=0.868-0.963，P < 0.001)，见表4，图1。

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照观察。组间比较选用独立样本t检验、χ2检验和秩和检验，并采用Logistic回归模型进行多因素分析。
1.2 时间及地点病历资料来自2019年1月至2022年10月萍乡矿业集团有限责任公司总医院收治的糖尿病足溃疡患者。
1.3 对象选择萍乡矿业集团有限责任公司总医院收治的糖尿病足溃疡患者147例，根据皮瓣修复术后1周内是否发生感染分为感染组与非感染组。
纳入标准：①符合《中国糖尿病足诊治指南》中糖尿病足溃疡的诊断标准[7]；②均接受皮瓣修复手术治疗；③Wagner分级为3，4级。
排除标准：①存在手术禁忌证者；②合并严重肝、肾功能不全者；③合并恶性肿瘤者；④住院时间不足1周或中途转院，临床资料不完整者。
该临床研究方案的实施符合《赫尔辛基宣言》和萍乡矿业集团有限责任公司总医院的相关伦理要求(伦理号：PKZYY-EC-202305-LW03)，患者及其家属均知情同意。
1.4 材料荧光定量试剂盒购自美国Promega公司；实时荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏(Roche)公司(型号：LightCycler96)；SYBR试剂盒购自中国鼎蓝公司；免疫酶联吸附法测定试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；TG20G高速离心机购自江苏新春兰科学仪器有限公司。
1.5 方法
1.5.1 感染判定标准参照国家卫生部制定的《医院感染诊断标准(试行)》对糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后1周内发生感染进行判定[8]：①手术切口有痛、热、红、肿或有脓性分泌物等症状；②主治医师初诊判定为切口感染；③后续细菌培养结果显示为阳性。
1.5.2 资料收集通过查阅医院的电子病例信息系统及问卷调差的方式对147例糖尿病足溃疡患者的年龄、性别、体质量指数、糖尿病病程、糖尿病足溃疡病程、Wagner分级、下肢缺血程度、是否合并糖尿病肾病、是否合并高血压、是否吸烟、患足、手术时间、血常规指标(包括中性粒细胞绝对值、C-反应蛋白、白细胞计数)、皮瓣相关指标(种类、术后成活情况)等一般资料进行收集。其中Wagner分级3级为深部溃疡且合并有骨髓炎或伴有脓肿，4级为局限性坏疽；下肢缺血程度分为轻、中、重度，轻度为0.7≤踝肱指数< 0.9，中度缺血为0.4≤踝肱指数< 0.7，重度缺血为踝肱指数< 0.4，踝肱指数=踝动脉收缩压/肱动脉收缩压[9]。
1.5.3 NLRP3、半胱天冬酶1(Caspase-1)及凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck like protein containing a CARD，ASC)的mRNA水平检测于术后24 h内抽取患者空腹外周肘静脉血4 mL，离心后采用淋巴细胞分离液提取出外周血单核细胞。
采用荧光定量PCR对外周血单核细胞NLRP3、Caspase-1及ASC的mRNA表达水平进行检测，使用Trizol试剂提取外周血单核细胞内的总RNA，将提取的总RNA反转录为模板DNA。反应体系：2×SYBR®Premix Ex TaqTM 10 μL，cDNA 2 μL，无核酸无酶水6.4 μL，上游引物(Forward primer)0.8 μL，下游引物(Reverse primer)0.8 μL，总反应体积20 μL。扩增条件：首先在95 ℃下进行预变性3 min，接着为95 ℃下进行变性10 s、60 ℃下进行退火/延伸30 s，重复40个循环；采用2-ΔΔCt的计算方法，以GAPDH为内参照，根据荧光定量PCR 所得Ct 值计算NLRP3、Caspase-1、ASC的mRNA相对表达量。相关引物序列如下：NLRP3，上游：5’-GAT CTT CGC TGC GAT CAA CA-3’，下游：5’-GGG ATT CGA AAC ACG TGC ATT A-3’，产物长度94 bp；Caspase-1，上游：5’-GCC TGT TCC TGT GAT GTG GA-3’，下游：5’-TTC ACT TCC TGC CCA CAG AC-3’，产物长度175 bp；ASC，上游：5’-CCT TGG ACC TCA CCG A-3’，下游：5’-ATG TCG CGC AGC ACG TTA G-3’，产物长度82 bp；GAPDH，上游：5’-GCA CCG TCA AGG CTG AGA AC-3’，下游：5’-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3’，产物长度138 bp。
1.5.4 白细胞介素18和白细胞介素1β水平检测于术后24 h内抽取患者空腹外周肘静脉血4 mL，先应用TG20G高速离心机高速离心(2 000 r/min)10 min后获取上层清液，接着采用免疫酶联吸附法检测患者外周血白细胞介素18和白细胞介素1β水平，操作按照试剂盒说明书进行。
1.6 主要观察指标 ①患者皮瓣修复术后早期感染及病菌分布；②患者皮瓣修复术后早期感染的单因素分析；③影响患者皮瓣修复术后早期感染的多因素Logistic回归分析；④外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平对患者皮瓣修复术后早期感染的预测价值。
1.7 统计学分析选用SPSS 25.0(美国IBM公司)建立数据库并对数据进行分析处理。符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较选用独立样本t检验；计数资料以例数(百分比)表示，选用χ2检验进行组间差异比较；等级资料采用秩和检验；对单因素分析中有统计学意义的相关危险因素进一步采用Logistic回归模型进行多因素分析。应用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线的曲线下面积(area under curve，AUC)来评估外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平对糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的预测价值。检验水准α=0.05(双侧)。

讨论

中国是现存糖尿病患者最多的国家，糖尿病患者总数目前已然超过1亿，约占全世界糖尿病患者总数的1/4，给国家公共卫生健康带来了极大挑战[10]。作为临床上常见的糖尿病并发症，糖尿病足溃疡具有治疗难度大、创面易感染、复发率高等特点，且约19%的糖尿病足溃疡患者需采取病足截肢，5年病死率高达45%左右，是糖尿病患者致残、致死的最主要原因之一[11-12]。皮瓣修复手术具有操作简单、手术风险小、术后皮瓣存活率高等特点，目前已被广泛应用于临床各类外科手术的创面修复当中。LU等[13]的研究成果也证实，糖尿病足溃疡患者及时进行皮瓣修复手术治疗可显著降低患者截肢率，下肢挽救率可达79%左右。但糖尿病患者皮瓣修复术后患者容易并发感染，这可能致使患者病情恢复受到影响，进一步导致患者康复进程延后，患者及其家庭的经济负担加重。因此，积极探讨影响糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的危险因素及可有效预测感染发生的相关指标，有助于临床医务人员尽早辨别高危人群并制定合理的针对性措施，进而减少感染的发生。
孙建新[14]的研究结果显示，手部创面皮瓣修复术后感染的发生率为21.46%(56/261)；此次研究结果显示，147例糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后1周内发生感染的例数为35例，发生率为23.8%，高于既往皮瓣修复术后感染的发生率，分析原因可能与糖尿病患者常受到自身免疫功能弱化、自身代谢紊乱等因素的影响，故较未合并糖尿病的患者而言，糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后更易发生感染[15-16]。35例术后早期感染患者中共分离出47株致病菌，其中革兰阳性菌占比略高于革兰阴性菌(53.19% vs. 46.81%)，这可能与医院所处的地理位置和气候有关，如气候干燥的地区较气候潮湿的地区更容易发生革兰阳性菌感染[17]。革兰阳性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的细菌，经过染色后细菌细胞仍然保留初染结晶紫的蓝紫色。临床上常见的革兰阳性菌主要包括金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、粪肠球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌等，主要是以产生外毒素的形式引起感染，其直接接触和空气飞沫传播是主要的感染途径，由于部分菌种可长期存在于正常人体中，当机体免疫力下降时也可能会引起感染。
如果糖尿病患者皮瓣修复术后血象相关指标升高、病原学证据、溃疡伤口边缘组织出现红肿热痛等，可以进一步判断为早期出现感染[18]。而且创面愈合的进程与炎症、血管形成、细胞增殖等有关[19]。WEIGELT等[20]研究结果显示了糖尿病足溃疡患者外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平、血清C-反应蛋白、白细胞介素6、干扰素-γ等炎症标志物水平升高的机制。外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平等炎症标志物是评估糖尿病足溃疡早期感染等并发症和溃疡严重程度的指标[21]。进一步单因素及多因素Logistic回归分析结果提示，高Wagner分级、高NLRP3、Caspase-1及ASC mRNA水平、高白细胞介素18和白细胞介素1β水平、游离瓣、皮瓣术后失活情况均是影响糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染的独立危险因素。此次研究糖尿病足溃疡患者Wagner分级为3级或4级，原因是Wagner分级为1级或2级的糖尿病足溃疡患者症状较轻，可考虑采取保守的抗生素药物治疗，而Wagner分级为5级的糖尿病足溃疡患者一般需进行截肢手术治疗[22]。而既往研究表明，Wagner分级与糖尿病足溃疡患者的炎性反应指标水平密切相关，Wagner分级越高提示患者受炎症影响越严重，患者并发感染的风险就越高[23]。
NLRP3炎性小体是由核心蛋白NLRP3、效应蛋白Caspase-1以及接头蛋白ASC组成的一种结构高度保守的复合体，该复合体被激活后能加速下游信号通路中的相关炎症因子白细胞介素18、白细胞介素1β的成熟与释放，在感染性疾病的发生发展过程中起到关键作用[24-26]。NLRP3炎症小体是机体先天自身免疫系统的重要组成部分，参与调控多种炎症疾病及自身免疫性疾病的发生与进展[27-28]。NLRP3炎症小体可通过有效辨别病原相关模式分子或损伤相关分子模式后被激活，致使NLRP3、Caspase-1及ASC的表达水平上调，并对炎症相关因子白细胞介素18与白细胞介素1β的成熟与释放进行诱导，诸多炎症反应也因此被激活，而炎症细胞受到招募去往感染部位，参与机体的免疫防御系统[29-30]。
此次研究结果显示，感染组糖尿病足溃疡患者术后外周血单核细胞NLRP3、Caspase-1及ASC的 mRNA水平明显高于非感染组，与卫会明等[30]的研究结果近似，提示NLRP3炎性小体信号通路被激活可能参与皮瓣修复术后早期感染的发生，临床应尽早对接受皮瓣修复手术的糖尿病足溃疡患者进行外周血单核细胞NLRP3炎性小体水平检测，这对预防及治疗患者术后早期感染具有一定的应用价值。欧海燕等[31]学者指出，机体体内NLRP3在一般情况下活化程度较低，而NLRP3在受到外部各种刺激致使活化程度加深时，被过度激活的Caspase-1可进一步使细胞焦亡或凋亡信号通路处于异常活化状态，加速下游炎症相关因子白细胞介素18与白细胞介素1β的合成与释放，最终产生炎症级联反应。为进一步分析活化后的NLRP3炎性小体是如何参与糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染疾病的发生及发展过程，此次研究通过检测血清炎症相关因子白细胞介素18与白细胞介素1β的水平发现，感染组糖尿病足溃疡患者术后血清白细胞介素18与白细胞介素1β水平明显高于非感染组，说明糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染与血清白细胞介素18与白细胞介素1β水平上调密切相关，考虑原因可能是炎性小体过度活化导致白细胞介素1β和白细胞介素18的合成与释放的异常增加，进而造成机体炎性症状加重，从而损害葡萄糖代谢并增强胰岛素抵抗，机体免疫系统受到损伤，机体免疫力下降，故糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后并发早期感染的风险增加[32]。同时此次研究ROC曲线结果显示，NLRP3、Caspase-1及ASC的 mRNA、白细胞介素18、白细胞介素1β对糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染预测的AUC分别为0.823，0.705，0.676，0.811，0.853，联合预测AUC为0.915，说明NLRP3、Caspase-1及ASC mRNA、白细胞介素18、白细胞介素1β对糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后早期感染均具有一定的预测价值，且联合预测效能靠优。
综上所述，革兰阳性菌是糖尿病足溃疡患者皮瓣修复术后感染的主要致病菌，且外周血单核细胞NLRP3炎性小体、白细胞介素18和白细胞介素1β水平是影响术后早期感染的独立危险因素，上述指标的联合预测效能靠优，有助于临床评估术后早期感染的发生情况，并可应用于预防与治疗术后早期感染，进而提高患者生活质量。此次研究存在以下不足：单中心研究，样本量较少，结果难免存在人为偏倚，后续有待多中心、样本量充足的研究结果做进一步考证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程