达格列净减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡和功能障碍

doi:10.12307/2023.773

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (1): 80-85.doi: 10.12307/2023.773

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

达格列净减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡和功能障碍

赵权威，李辉，刘大男，龚才伟，陈龙

贵州医科大学附属医院心血管内科，贵州医科大学医学科学研究所，贵州省贵阳市 550004

收稿日期:2022-11-03 接受日期:2022-12-27 出版日期:2024-01-08 发布日期:2023-06-28
通讯作者: 刘大男，博士，教授，主任医师，硕士、博士生导师，贵州医科大学附属医院心内科，贵州医科大学医学科学研究所，贵州省贵阳市 550004
作者简介:赵权威，男，1996年生，河南省驻马店市人，汉族，贵州医科大学在读硕士，主要从事动脉粥样硬化的发病机制及防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81660083)，项目负责人：刘大男；贵州省科技创新人才团队项目[(2020)5014]，项目负责人：刘大男；贵州省“百”层次创新型人才培养计划项目[(2015)4026]，项目负责人：刘大男

Dapagliflozin attenuates endothelial cell pyroptosis and dysfunction induced by oxidized low-density lipoprotein

Zhao Quanwei, Li Hui, Liu Danan, Gong Caiwei, Chen Long

Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Institute of Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China

Received:2022-11-03 Accepted:2022-12-27 Online:2024-01-08 Published:2023-06-28
Contact: Liu Danan, MD, Professor, Chief physician, Master’s/Doctoral supervisor, Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Institute of Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
About author:Zhao Quanwei, Master candidate, Department of Cardiology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Institute of Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81660083 (to LDN); Guizhou Provincial Science and Technology Innovation Talent Team Project, No. (2020)5014 (to LDN); Guizhou Provincial Hundred-Level Innovative Talent Cultivation Plan, No. (2015)4026 (to LDN)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

达格列净：一种钠-葡萄糖共转运蛋白2(sodium-glucose cotransporter-2，SGLT2)抑制剂，可以通过选择性地抑制SGLT2蛋白，减少肾小管对葡萄糖的重吸收和增加尿糖排出，降低血糖对内皮细胞的“毒性”而发挥抗炎和抗氧化潜能，从而延缓动脉粥样硬化的进展。

核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NOD-like receptor family，pyrin domain-containing protein 3，NLRP3)炎症小体：由受体蛋白NLRP3、衍接蛋白(凋亡相关斑点样蛋白)和效应蛋白(半胱天冬氨酸蛋白酶1前体)三部分组成。受体蛋白是炎症小体的核心，NLRP3作为感受器识别入侵病原体诱导产生的分子模式和一些内源性与损伤相关的分子模式后产生信号，通过衍接蛋白即包含半胱天冬氨酸蛋白酶募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白与半胱天冬氨酸蛋白酶1前体结合，组装形成多蛋白复合物，从而使无活性半胱天冬氨酸蛋白酶1前体转为有活性的半胱天冬氨酸蛋白酶1而作用于白细胞介素1β前体和白细胞介素18前体，促进其成熟和活化，引发一系列炎症反应。

背景：达格列净是钠-葡萄糖共转运蛋白2的抑制剂，可以通过调节糖代谢和抑制炎症改善内皮细胞功能，从而延缓动脉粥样硬化的进展。
目的：观察达格列净对氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡和内皮功能障碍的影响。
方法：将人脐静脉内皮细胞分为3组：对照组不进行任何干预，模型组加入氧化低密度脂蛋白处理24 h，达格列净组在加入氧化低密度脂蛋白的基础上给予达格列净干预24 h，CCK-8检测内皮细胞增殖活性，ELISA检测细胞培养上清液中细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1水平；硝酸还原酶法检测细胞一氧化氮水平；Hoechst 33342/PI荧光双染和乳酸脱氢酶释放实验检测内皮细胞焦亡情况和焦亡特征；Western blot检测内皮细胞焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD、白细胞介素18和白细胞介素1β蛋白表达。

结果与结论：①氧化低密度脂蛋白可以导致内皮细胞焦亡和功能障碍；②与对照组相比，模型组细胞活性和一氧化氮水平下降(P < 0.05)，而乳酸脱氢酶、细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1以及单核细胞趋化蛋白1显著增多(P < 0.05)；与模型组相比，达格列净组细胞活性和一氧化氮水平明显增加(P < 0.05)，而乳酸脱氢酶、细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1以及单核细胞趋化蛋白1显著下降(P < 0.05)；③与模型组相比，达格列净组细胞焦亡率以及焦亡因子NLRP3、caspase-1、GSDMD、白细胞介素18和白细胞介素1β蛋白表达明显减少(P < 0.05)；④以上结果表明，达格列净可以抑制氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡并改善内皮细胞功能障碍。

https://orcid.org/0000-0002-8205-5501(赵权威)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 达格列净, 焦亡, 氧化低密度脂蛋白, NLRP3炎症小体, 人脐静脉内皮细胞, 内皮细胞功能, 动脉粥样硬化

Abstract: BACKGROUND: Dapagliflozin, an inhibitor of sodium-glucose cotransporter 2, can delay the progression of atherosclerosis by regulating glucose metabolism, inhibiting inflammation and improving endothelial cell function.
OBJECTIVE: To study the effect of dapagliflozin on cell pyroptosis and endothelial dysfunction induced by oxidized low-density lipoprotein.
METHODS: Human umbilical vein endothelial cells were divided into a control group (no intervention), a model group (treated with oxidized low-density lipoprotein for 24 hours), and a dapagliflozin group (treated with oxidized low-density lipoprotein + dapagliflozin for 24 hours). Endothelial cell proliferation activity was measured by cell counting kit-8 assay. The levels of intercellular adhesion molecule 1, vascular cell adhesion molecule 1, and monocyte chemotactic protein-1 in cell supernatant were detected using ELISA. Nitric oxide level in the cells was detected by nitrate reductase assay. The pyroptosis rate and characteristics of endothelial cells were detected by Hoechst 33342/PI fluorescence co-staining and lactate dehydrogenase release assay. The protein expression levels of NLRP3, caspase-1, GSDMD, interleukin-1β, and interleukin-18 were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Oxidized low-density lipoprotein could cause pyroptosis and dysfunction of endothelial cells. (2) Compared with the control group, the level of nitric oxide and cell activity were decreased (P < 0.05), while lactate dehydrogenase, intercellular adhesion molecule 1, vascular cell adhesion molecule 1, and monocyte chemotactic protein-1 levels were significantly increased in the model group (P < 0.05). Compared with the model group, cell activity and nitric oxide levels significantly increased (P < 0.05), but lactate dehydrogenase, intercellular adhesion molecule 1, vascular cell adhesion molecule 1, and monocyte chemotactic protein-1 levels were significantly diminished in the dapagliflozin group (P < 0.05). (3) Compared with the model group, cell pyroptosis rate and the protein expression of pyroptosis factor NLRP3, caspase-1, GSDMD, interleukin-18 and interleukin-1β significantly reduced in the dapagliflozin group (P < 0.05). (4) The results indicate that dapagliflozin inhibits oxidized low-density lipoprotein-induced endothelial pyroptosis and ameliorates endothelial cell dysfunction.

Key words: dapagliflozin, pyroptosis, oxidized low-density lipoprotein, NLRP3 inflammasome, human umbilical vein endothelial cell, endothelial cell function, atherosclerosis

中图分类号:

赵权威, 李辉, 刘大男, 龚才伟, 陈龙. 达格列净减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡和功能障碍[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(1): 80-85.

Zhao Quanwei, Li Hui, Liu Danan, Gong Caiwei, Chen Long. Dapagliflozin attenuates endothelial cell pyroptosis and dysfunction induced by oxidized low-density lipoprotein[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(1): 80-85.

图/表（结果） 5

2.1 CCK-8结合Western blot筛选达格列净最适干预浓度应用不同浓度的达格列净干预正常细胞24 h后，CCK-8结果显示，当达格列净浓度为50 μmol/L时，细胞活性出现显著下降(P < 0.001)，表明高浓度达格列净对细胞有一定的毒性作用；此外，因为高浓度二甲基亚砜对细胞有增殖毒性，因此设置最大浓度0.1%二甲基亚砜作为对照，与对照组相比，细胞增殖活性并没有受到影响，排除了二甲基亚砜的影响；与对照组相比，达格列净10 μmol/L组细胞活性出现下降趋势，见图1A，因此，选用达格列净浓度为0.1，0.5，1，5 μmol/L进行Western blot实验。NLRP3作为炎症小体激活的核心，在细胞经典焦亡途径中发挥着关键的作用，而caspase-1作为效应蛋白则执行切割下游因子的功能，GSDMD则作为功能蛋白执行胞膜的打孔作用。该实验检测了NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达来确定达格列净最适干预浓度，结果显示，与对照组相比，模型组NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达显著增高(P < 0.01)；而与模型组相比，0.1 μmol/L达格列净组NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白的表达下降(P < 0.05)， 0.5，1，5 μmol/L达格列净组NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白表达则无统计学差异(P > 0.05)，见图1B，C，因此选用达格列净浓度为0.1 μmol/L进行后续实验。

2.2 达格列净对内皮细胞活性的影响氧化低密度脂蛋白作为损伤因素，降低了内皮细胞的活性。CCK-8活性实验结果表明，相对于对照组，模型组细胞活性出现明显的下降(P < 0.01)，经达格列净干预后内皮细胞的活性增加(P < 0.01)，见图2，表明达格列净可以减轻氧化低密度脂蛋白对内皮细胞的损伤，恢复内皮细胞的增殖活性。

2.3 Hoechst33342/PI荧光双染检测内皮细胞焦亡 Hoechst 33342/PI荧光双染结果显示，与对照组相比，模型组PI阳性细胞比率显著增高(P < 0.001)，而与模型组相比，达格列净组PI阳性细胞比率明显降低，差异有非常显著性意义(P < 0.01)；此外，乳酸脱氢酶释放实验结果表明，与对照组相比，模型组细胞上清液乳酸脱氢酶活性明显增加，而用达格列净干预处理内皮细胞后，乳酸脱氢酶释放明显减少(P < 0.001)，见图3。

2.4 Western blot检测内皮细胞焦亡因子的表达 Western blot实验结果表明，与对照组相比，模型组NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-18和IL-1β的表达明显增多，差异有显著性意义(P < 0.01)，与模型组相比，达格列净组NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-18和IL-1β的表达则明显减少(P < 0.05)，见图4。上述结果表明，达格列净可以减少氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡因子的表达。

2.5 内皮细胞一氧化氮合成以及黏附因子水平与对照组相比，模型组细胞内一氧化氮水平明显降低，差异有非常显著性意义(P < 0.001)，与模型组相比，达格列净组细胞内一氧化氮水平显著增加，差异有显著性意义(P < 0.01)；此外，与对照组相比，模型组细胞上清液中炎症因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1水平显著增多，与模型组相比，达格列净组上述因子的含量则明显减少，见图5。以上结果表明，达格列净可以恢复氧化低密度脂蛋白导致的内皮细胞损伤，恢复细胞一氧化氮的合成能力并且抑制内皮细胞黏附因子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的分泌，从而改善内皮细胞功能。

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引言

内皮细胞功能障碍是构成动脉粥样硬化发病的重要因素之一[1]。血管张力调节障碍和黏附分子表达异常是内皮细胞功能障碍的2个重要表现[2]。血管张力调节依赖于一氧化氮的合成，当内皮细胞功能发生障碍时，一氧化氮的合成减少，从而加速了动脉粥样硬化的进程[3-4]。此外，内皮细胞损伤还可以释放一系列黏附因子，包括细胞间黏附分子1 (intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)等，在这些因子的作用下，血管中层的平滑肌细胞和血液中的单核细胞迁移到内膜，在此处单核细胞分化为巨噬细胞，与平滑肌细胞共同吞噬脂质形成泡沫细胞，而泡沫细胞的形成则标志着动脉粥样硬化的形成[5]。因此保护血管内皮细胞、改善内皮细胞功能在抑制动脉粥样硬化的进程中有着重要的作用。
细胞焦亡是一种与炎症相关并伴有大量炎症因子释放的细胞程序性死亡方式[6]，其发生机制分为依赖于caspase-1的经典途径和caspase-4/5/11的非经典途径[7-8]。细胞焦亡经典途径的发生又依赖于核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎症小体的活化，活化的NLRP3炎症小体使caspase-1前体发生自我活化形成具有切割活性的caspase-1，活化的caspase-1切割下游的GSDMD使其发生剪切和多聚化，促使细胞发生穿孔进而触发细胞焦亡，同时活化的caspase-1还切割白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素18(interleukin-18，IL-18)的前体使其成熟并被释放至细胞外，进一步扩大炎症反应[9-11]。研究表明，在动脉粥样硬化各阶段都存在血管壁细胞焦亡，尤其是内皮细胞和巨噬细胞焦亡[12-14]。
达格列净为钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(sodium- glucose cotransporter-2 inhibitor，SGLT2i)，它可以通过选择性地抑制SGLT2蛋白，减少肾小管对葡萄糖的重吸收和增加尿糖排出，降低血糖对内皮细胞的“毒性”而发挥抗炎和抗氧化作用[15-16]。研究表明，用恩格列净干预2型糖尿病小鼠后，减少了小鼠心肌组织焦亡通路因子NLRP3、caspase- 1、GSDMD和IL-1β的表达，还可降低小鼠胰腺组织和胰岛β细胞NLRP3、caspase-1和GSDMD的表达，减少胰岛β细胞焦亡，改善胰岛素分泌不足[17-18]。而达格列净可抑制醋酸诱导的溃疡性结肠炎大鼠结肠组织NF-κB/AMPK/NLRP3信号通路激活，减少IL-1β和IL-18的分泌，从而减轻大鼠结肠炎症[19]。此外，达格列净还可减轻糖尿病动脉粥样硬化小鼠斑块面积和巨噬细胞炎症[20]。由于内皮细胞损伤是动脉粥样硬化的始动环节，而内皮细胞焦亡又参与了动脉粥样硬化的形成，达格列净又具有抗动脉粥样硬化的作用，因此该研究旨在探索达格列净能否通过抑制内皮细胞焦亡和改善内皮细胞功能而发挥抗动脉粥样硬化的作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，两两比较采用t检验或秩和检验，组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验。
1.2 时间及地点实验于2022年6-10月在贵州医科大学分子生物重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞人脐静脉内皮细胞株(普诺赛)由贵州医科大学组织与细胞中心提供。
1.3.2 主要试剂和仪器达格列净购于美国MCE有限公司；氧化低密度脂蛋白购于广州奕元生物有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购买于美国Gibco有限公司；CCK-8检测试剂盒、乳酸脱氢酶检测试剂盒购于武汉塞维尔生物科技有限公司；Hoechst 33342/PI试剂盒、Human ICAM-1、VCAM-1、MCP-1 ELISA检测试剂盒、一氧化氮含量检测试剂盒购于北京索莱宝生物科技有限公司；PVDF膜购于美国Millipore有限公司；NLRP3、caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β和GAPDH抗体购于美国Affinity公司；ECL化学发光试剂盒购于美国Millipore公司；低温高速离心机、酶标仪、Nanodrop 2000核酸定量仪(ThermoFisher)；恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；电泳仪、电泳槽(北京六一仪器厂)；倒置显微镜(Olympus)。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐静脉内皮细胞培养人脐静脉内皮细胞使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养，置于37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱中；待细胞密度达到90%时，在T25培养瓶中加入1 mL含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化两三分钟；在显微镜下观察，待细胞缩小、变圆时，加入5 mL DMEM完全培养基终止消化，用枪头轻轻吹打，使贴壁细胞脱落；将细胞悬液移入15 mL离心管，室温1 600 r/min离心5 min；弃去上清，加入6 mL DMEM完全培养基重悬细胞；然后将细胞悬液分装于2个T25培养瓶中，放入培养箱中培养，传代到第3代时进行后续实验。
1.4.2 达格列净浓度预实验使用二甲基亚砜溶解达格列净，将正常细胞按照每孔1×104个接种于96孔板中，分别加入0.1%二甲基亚砜，0，0.1，0.5，1，5，10，50 μmol/L达格列净干预，每组设置6个复孔，在培养箱中干预24 h后，弃去培养基，每孔加入100 μL新鲜培养基，然后加入10 μL CCK-8试剂，培养箱孵育2 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度值。按照以下公式计算细胞活力：细胞活性(%)=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。在不影响细胞增殖活性的浓度下，结合Western blot实验(方法见1.4.6)确定达格列净最适干预浓度。空白组不接种细胞，仅加入100 μL含有不同浓度达格列净的培养基，对照组接种细胞，加入100 μL不含达格列净的培养基，实验组接种细胞，加入含0.1%二甲基亚砜或不同浓度达格列净的培养基。
1.4.3 细胞模型构建及分组将人脐静脉内皮细胞分为对照组、模型组、达格列净组，对照组细胞不做任何处理，模型组细胞加入质量浓度为2 000 μg/mL的氧化低密度脂蛋白 100 μL使其终质量浓度为100 μg/mL，培养箱培养24 h；达格列净组细胞先加入0.1 μmol/L达格列净预孵育24 h，然后加入氧化低密度脂蛋白，培养箱继续培养24 h。
1.4.4 CCK-8检测细胞增殖活性将人脐静脉内皮细胞按照每孔1×104个接种于96孔板中，按照1.4.3实验分组进行干预，干预结束后按1.4.2方法加入CCK-8试剂，酶标仪检测450 nm处吸光度值。
1.4.5 Hoechst 33342/PI双染检测细胞焦亡细胞种板前铺好细胞爬片，将人脐静脉内皮细胞按照1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞密度达到60%-70%时，按照1.4.3实验分组进行干预，干预结束后PBS清洗细胞，40 g/L多聚甲醛溶液固定细胞，根据Hoechst 33342/PI双染试剂盒说明书分别取1 mL染色工作液，5 μL Hoechst 33342染液，5 μL PI染液，4 ℃孵育25 min，PBS清洗，滴加抗荧光淬灭封片剂封固；倒置荧光显微镜下拍摄，用Image J软件评估PI阳性细胞的百分比。
1.4.6 乳酸脱氢酶释放实验将人脐静脉内皮细胞按照1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞密度达到60%-70%时，按照1.4.3实验分组进行干预，干预结束后收集上清液，根据乳酸脱氢酶活性检测试剂盒的说明书制备样品和标准品，并将制备好的样品转移到96孔板中，使用酶标仪检测490 nm波长下的吸光度值，计算乳酸脱氢酶活性：待测乳酸脱氢酶活性(mU/mL)=(干预组吸光度值-对照组吸光度值)/(标准品吸光度值-对照组吸光度值)×标准品浓度(mU/mL)。
1.4.7 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 将人脐静脉内皮细胞按照1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞密度达到60%-70%时，按照1.4.3实验分组进行干预，干预结束后收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值，以标准品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，用软件绘制标准曲线，通过对应吸光度值由标准曲线计算出样品ICAM-1、VCAM-1、MCP-1水平。
1.4.8 Western blot检测焦亡因子蛋白表达将人脐静脉内皮细胞按照1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞密度达到60%-70%时，按照1.4.3实验分组进行干预，干预结束后收集细胞，在各组细胞中加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，裂解物转入1.5 mL EP管内，超声破碎后，4℃，14 000 r/min离心20 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量。取等量蛋白上样，经SDS-PAGE电泳后，恒流转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，封闭后加入一抗(NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β、GAPDH抗体)，4 ℃冰箱孵育过夜，加入二抗IgG室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，采用ECL法检测蛋白表达，通过Image J软件进行分析。
1.4.9 一氧化氮水平测定将人脐静脉内皮细胞按照1×105个/孔接种于6孔板中，待细胞密度达到60%-70%时，按照1.4.3实验分组进行干预，干预结束后收集细胞，按照细胞数量(106)∶提取液体积(mL)为(5-10)∶1的比例加入提取液，冰浴超声破碎，然后4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清至冰上待测，按照试剂盒说明书进行操作，最后用酶标仪测定550 nm处吸光度值，然后计算一氧化氮水平。
1.5 主要观察指标各组细胞焦亡率和焦亡特征；焦亡因子NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18、IL-1β等蛋白表达；内皮细胞一氧化氮水平和细胞培养上清液ICAM-1、VCAM-1、MCP-1水平。
1.6 统计学分析运用GraphPad Prism 8.0.1进行统计分析和作图。计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验或秩和检验，组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis检验。检验水准取α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。统计学方法已经贵州医科大学生物统计学专家审核。

讨论

内皮细胞是动脉内膜的主要组成成分，覆盖于血管腔的内表面，可以通过分泌和释放多种血管活性物质及细胞因子，从而发挥抗凝、抗血小板聚集、抗炎、调脂、调节血管舒缩以及维持内环境稳定等作用[21]。内皮细胞损伤作为动脉粥样硬化的始动环节，在动脉粥样硬化的发生和发展中起着至关重要的作用，因此，减轻内皮细胞损伤、改善血管内皮功能可能成为动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。研究表明，氧化低密度脂蛋白促进了内皮细胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等黏附因子的表达，进而促进免疫细胞转移至内皮细胞下组织间隙，启动动脉粥样硬化斑块的形成过程[22-23]。该研究采用氧化低密度脂蛋白刺激内皮细胞，使细胞一氧化氮含量明显下降，并且促进了ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等黏附因子的分泌，而给予达格列净干预后，可以显著恢复内皮细胞一氧化氮的合成能力，减少上述黏附因子的分泌。这也与UTHMAN等[24]的研究结果一致，他们的研究结果表明，达格列净和恩格列净可以恢复肿瘤坏死因子α导致的内皮细胞一氧化氮合成能力的下降，并且还可以减少活性氧的表达，从而改善内皮细胞功能。他们的研究还表明，尽管肿瘤坏死因子α可以降低内皮型一氧化氮合酶的表达，但是达格列净和恩格列净干预后并不能使内皮型一氧化氮合酶表达增多。因此，作者推测达格列净可能通过减少活性氧的产生从而恢复了内皮细胞一氧化氮的合成能力和生物利用度。
细胞焦亡作为一种与炎症相关的细胞程序性死亡方式，其与动脉粥样硬化之间的关系也被广泛关注。当细胞发生焦亡时，细胞膜会在GSDMD-N的作用下形成10-20 nm的孔道，胞膜完整性受到破坏，最终导致细胞内的乳酸脱氢酶和炎症因子释放到细胞外[8，25]。细胞发生焦亡时，染色质固缩，细胞膜形成孔道，PI荧光染料通过破裂的孔道进入到细胞内部，并嵌入到DNA的双链当中，在荧光显微镜下观察时焦亡阳性细胞会出现强红色的荧光。该研究采用Hoechst33342/PI荧光双染来检测内皮细胞焦亡情况。细胞焦亡的发生又与氧化低密度脂蛋白密切相关，研究表明氧化低密度脂蛋白不仅可以导致内皮细胞功能障碍，还可以通过激活NF-κB/NLRP3信号通路从而增加人主动脉血管平滑肌细胞焦亡的发生[26]。而用caspase-1抑制剂VX-765处理ApoE-/-小鼠后，小鼠主动脉粥样硬化斑块以及焦亡因子显著减少，并且还抑制了氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞的焦亡[27]。该研究采用氧化低密度脂蛋白来构建内皮细胞焦亡模型，当氧化低密度脂蛋白刺激内皮细胞24 h后，内皮细胞焦亡率、乳酸脱氢酶的释放以及焦亡功能因子NLRP3、caspase-1、GSDMD以及下游炎症因子IL-18和IL-1β的表达明显增加，这表明氧化低密度脂蛋白可以激活NLRP3炎症小体诱导内皮细胞焦亡。
SGLT2i作为一种新型的降糖药物，越来越多的临床试验不仅关注其对血糖的益处，还关注其对心血管系统的保护作用。诸多研究已经证实，SGLT2i在糖尿病-动脉粥样硬化小鼠模型中不仅能够稳定发挥控制血糖的作用，还能稳定斑块，改善内皮功能以及抑制巨噬细胞炎症和血管平滑肌细胞增殖迁移，从而延缓动脉粥样硬化进展[20，24，28-31]。达格列净作为SGLT2i的一种，还可以通过发挥抗氧化应激、调节细胞自噬以及减少泡沫细胞的形成延缓动脉粥样硬化形成[32-34]。该研究通过达格列净干预氧化低密度脂蛋白刺激形成的内皮细胞焦亡模型，结果表明，达格列净可以降低内皮细胞焦亡率，减少细胞上清乳酸脱氢酶的含量以及细胞焦亡因子NLRP3、Caspase-1、GSDMD等蛋白的表达。该研究结果显示，达格列净可以通过抑制NLRP3/Caspase-1的表达从而减轻内皮细胞焦亡，但是达格列净是通过直接作用还是间接作用于NLRP3/Caspase-1尚不清楚。LENG等[31]研究表明活性氧可以通过激活NLRP3炎症小体从而介导巨噬细胞焦亡的发生，而给予达格列净干预后，可以明显降低活性氧的生成从而减轻巨噬细胞焦亡。此外，细胞外的晶体颗粒可以通过损伤溶酶体，导致溶酶体膜通透性增加而释放组织蛋白酶，在组织蛋白酶的作用下激活NLRP3炎症小体，导致焦亡的发生[35]。而达格列净是否可以通过减轻溶酶体损伤，从而减少组织蛋白酶的释放，进而抑制NLRP3炎症小体介导的细胞焦亡，这需要更进一步的研究。
综上所述，达格列净可以改善由氧化低密度脂蛋白导致的内皮细胞功能障碍，恢复内皮细胞合成一氧化氮的能力，减少黏附分子ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的分泌，还可以通过抑制NLRP3炎症小体的激活从而抑制内皮细胞焦亡的发生。然而，此次实验为达格列净对体外细胞模型干预实验，并不能完全模拟其对体内血管壁内皮细胞焦亡的影响。此外，达格列净减轻内皮细胞焦亡的发生机制，是通过直接作用还是间接作用于NLRP3炎症小体尚不清楚。因此，下一步拟继续通过细胞模型实验来研究达格列净对内皮细胞焦亡的作用及具体机制，以期进一步明确达格列净对动脉粥样硬化的影响及其调控的分子机制。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

达格列净减轻氧化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞焦亡和功能障碍

Dapagliflozin attenuates endothelial cell pyroptosis and dysfunction induced by oxidized low-density lipoprotein

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