益气通脉方干预动脉粥样硬化模型小鼠血清氨基酸代谢的变化

doi:10.12307/2023.523

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (28): 4441-4447.doi: 10.12307/2023.523

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益气通脉方干预动脉粥样硬化模型小鼠血清氨基酸代谢的变化

王姝瑞1，2，张翌蕾1，2，焦伟杰2，3，刘志华3，张奎明1，2，崔应麟2，3

1河南中医药大学第二临床医学院，河南省郑州市 450046；2河南省中医药防治心脑血管病重点实验室，河南省郑州市 450002；3河南省中医院，河南省郑州市 450002

收稿日期:2022-01-12 接受日期:2022-08-27 出版日期:2023-10-08 发布日期:2023-01-29
通讯作者: 崔应麟，硕士，主任医师，河南省中医药防治心脑血管病重点实验室，河南省郑州市 450002；河南省中医院，河南省郑州市 450002
作者简介:王姝瑞，女，1994年生，开封市杞县人，汉族，博士，医师，主要从事中医药防治脑病的研究。
基金资助:
河南省科技攻关项目(212102311123)，项目负责人：崔应麟；河南省科技攻关项目(212102311139)，项目负责人：刘志华

Effects of Yiqi Tongmai Fang on serum amino acid metabolism of atherosclerotic mice

Wang Shurui1, 2, Zhang Yilei1, 2, Jiao Weijie2, 3, Liu Zhihua3, Zhang Kuiming1, 2, Cui Yinglin2, 3

1Second Clinical School, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; 2Henan Key Laboratory of Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, Zhengzhou 450002, Henan Province, China; 3Henan Hospital of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China

Received:2022-01-12 Accepted:2022-08-27 Online:2023-10-08 Published:2023-01-29
Contact: Cui Yinglin, Master, Chief physician, Henan Key Laboratory of Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, Zhengzhou 450002, Henan Province, China; Henan Hospital of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China
About author:Wang Shurui, MD candidate, Physician, Second Clinical School, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; Henan Key Laboratory of Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, Zhengzhou 450002, Henan Province, China
Supported by:
Henan Provincial Science and Technology Research Projects, Nos. 212102311123 (to CYL) and 212102311139 (to LZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

动脉粥样硬化：是一种全身慢性炎症性疾病，是引起心脑血管疾病发生的重要病理基础。常见导致动脉粥样硬化的因素包括高血压、高脂血症、大量吸烟以及糖尿病、肥胖和一些遗传因素，其病理因素为脂质沉积、炎症和氧化应激。动脉粥样硬化最重要的原因是血管内皮细胞的损伤、增殖、迁移和炎性病变，最终造成炎性斑块甚至血栓等，诱发心脑血管疾病。
代谢组学：代谢组是指生物在特定时期内所有的低分子量代谢产物，代谢组学则是对所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的一门新学科，是系统生物学的重要组成部分。代谢产物作为生物学现象的终点，能调控信号释放、能量传递、细胞间通信等多种生命活动。近年来广泛应用于疾病的诊断和医药的研发等。

背景：动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病的病理基础。益气通脉方能显著改善患者动脉粥样硬化，然而关于动脉粥样硬化及益气通脉方干预下的代谢谱及机制分析尚不完善。
目的：探讨益气通脉方治疗动脉粥样硬化的可能作用机制。
方法：选取36只C57/B6J雄性小鼠，其中正常组6只，给予普通饮食12周；其余30只ApoE-/-基因小鼠随机分为模型组、益气通脉方低、中、高剂量组和阿托伐他汀组，每组6只，高脂饲养的同时分别以氯化钠、低、中、高剂量益气通脉方[0.39，0.78，1.56 g/(kg·d)]及阿托伐他汀2.6 mg/(kg·d)灌胃，12周后采集各组小鼠血清和主动脉组织。通过血管组织病理切片观察各组小鼠主动脉病理改变程度与血管狭窄情况，血清采用超高效液相色谱-质谱高通量靶标代谢组学技术分析代谢谱，筛选组间差异氨基酸。

结果与结论：①在形态上，与模型组相比，益气通脉方各组血管病理损伤和狭窄程度明显改善；②在血清氨基酸代谢上，与正常组相比，模型组共有7种氨基酸水平明显改变，包括L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸水平的升高，L-精氨酸、3-甲基-L-组氨酸水平的降低；③益气通脉方能够调节差异氨基酸水平，并且益气通脉方高剂量组调节代谢物最多；④提示益气通脉方可延缓动脉粥样硬化进展，其中益气通脉方高剂量组作用最为显著，作用机制可能与调节氨基酸代谢相关。

https://orcid.org/0000-0002-9451-3573(王姝瑞)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 益气通脉方, 动脉粥样硬化, 氨基酸代谢, ApoE-/-小鼠, 超高效液相色谱-质谱

Abstract: BACKGROUND: Atherosclerosis is the pathological basis of many cardiovascular and cerebrovascular diseases. Yiqi Tongmai Fang can significantly improve atherosclerosis in patients, but the metabolic spectrum and mechanism underlying the intervention of atherosclerosis using Yiqi Tongmai Fang are still incomplete.
OBJECTIVE: To explore the possible mechanism of Yiqi Tongmai Fang in the treatment of atherosclerosis.
METHODS: Thirty-six male C57/B6J mice were selected, 6 of which were used as normal controls and given normal diet for 12 weeks. The remaining 30 ApoE-/- mice were randomly divided into model group, low-, medium- and high-dose Yiqi Tongmai Fang groups and atorvastatin group, with 6 mice in each group, and then were fed with high fat diet combine with intragastrical administration of sodium chloride, low-, medium- and high-dose Yiqi Tongmai Fang (0.39, 0.78, 1.56 g/kg per day) and atorvastatin (2.6 mg/kg per day), respectively. Serum and aortic tissue were collected after 12 weeks. The pathological changes of the aorta and vascular stenosis were observed by vascular histopathological section. The serum samples were analyzed by ultrahigh performance liquid chromatography-mass spectrometer for high-throughput target metabolomics, to screen different amino acids between groups.
RESULTS AND CONCLUSION: In terms of morphology, vascular pathological injury and stenosis were significantly improved in the Yiqi Tongmai Fang groups compared with the model group. In terms of serum amino acid metabolism, the levels of seven amino acids were significantly changed in the Yiqi Tongmai Fang group compared with the normal control group, including the increased levels of L-Glutamic acid, L-Tyrosine, L-Aspartate, L-Lysine and L-Valine, and the decreased levels of L-Arginine and 3-methyl-L-histidine. Yiqi Tongmai Fang could regulate the levels of different amino acids and high-dose Yiqi Tongmai Fang could regulate the most metabolites. Overall, these findings indicate that Yiqi Tongmai Fang can delay the progression of atherosclerosis and its mechanism may be related to the regulation of amino acid metabolism. Moreover, high-dose Yiqi Tongmai Fang has the most significant effect.

Key words: Yiqi Tongmai Fang, atherosclerosis, amino acid metabolism, ApoE-/- mouse, ultrahigh performance liquid chromatography-mass spectrometer

中图分类号:

王姝瑞, 张翌蕾, 焦伟杰, 刘志华, 张奎明, 崔应麟. 益气通脉方干预动脉粥样硬化模型小鼠血清氨基酸代谢的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(28): 4441-4447.

Wang Shurui, Zhang Yilei, Jiao Weijie, Liu Zhihua, Zhang Kuiming, Cui Yinglin. Effects of Yiqi Tongmai Fang on serum amino acid metabolism of atherosclerotic mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(28): 4441-4447.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 36只小鼠全部进入结果分析。
2.2 益气通脉方减轻小鼠血管组织的病理改变苏木精-伊红染色后观察血管组织，如图1箭头所示。正常组内膜整体光滑完整，平滑肌排列整齐，管腔内无斑块；模型组小鼠主动脉可见明显的斑块形成，结构形态紊乱，内皮连续性损伤，平滑肌细胞增生，斑块内泡沫细胞沉积，管腔狭窄，周围炎性细胞浸润；益气通脉方低剂量组结构较规则，可见内膜增厚，少量泡沫细胞沉积，斑块不明显；益气通脉方中剂量组病变较轻，内皮结构欠规则，平滑肌排列紊乱；益气通脉方高剂量组与阿托伐他汀组主动脉结构较清晰，内膜较平整，结构正常。此次研究结果提示各组主动脉血管壁呈动脉粥样硬化内皮损伤改变，益气通脉方及阿托伐他汀干预后的病理改变较模型组减轻，益气通脉方高剂量组与阿托伐他汀组病理改变程度较轻。

2.3 益气通脉方改善小鼠血管狭窄利用Imagepro软件测量各组血管截面面积及同截面斑块面积，如图2所示，与正常组比较，模型组小鼠血管狭窄率增高(P < 0.01)；与模型组比较，益气通脉方各剂量组小鼠血管狭窄率均显著降低(P < 0.01) 。此次研究提示，模型组主动脉粥样硬化斑块面积增多，益气通脉方及阿托伐他汀干预后的斑块面积降低，益气通脉方组与阿托伐他汀组降低程度相当。

2.4 血清样品代谢组学分析图3显示正常组、模型组血清样品在主成分分析得分图中各自聚为一类，二维空间上显著分离，表明模型组小鼠血清代谢轮廓的改变。图4显示模型组与益气通脉方低、中、高剂量组、阿托伐他汀组在主成分分析得分图中明显分离，且趋近于正常组，其中益气通脉方各组较阿托伐他汀组有更趋近于正常组的趋势；表明各治疗组能够调节小鼠血清代谢轮廓，且益气通脉方的作用可能优于阿托伐他汀钙片。

2.5 与动脉粥样硬化相关的生物标志物的筛选将正常组、模型组进行置换检验，表明了模型的稳健性良好，不存在过拟合现象。通过单变量统计分析，绘制火山图(图5)。以P < 0.05认为有统计学意义，并符合VIP值> 1，鉴定为动脉粥样硬化相关的生物标志物，最终鉴定血清相关生物标志物7个，见表1。

2.6 益气通脉方对氨基酸代谢的调控益气通脉方各组均纳入统计分析，并有不同程度的调控作用，其中益气通脉方高剂量组调控趋势最明显。结果显示，益气通脉方高剂量组能够显著调控6种差异氨基酸代谢产物水平，分别是L-酪氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸和L-天冬氨酸(P < 0.05)，见表1；阿托伐他汀组能够调控5种差异氨基酸代谢产物水平，分别是3-甲基-L-组氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸(P < 0.05)，见表1。益气通脉方高剂量组对氨基酸的调控作用，见图6。

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引言

动脉粥样硬化是一种全身慢性炎症性疾病，是包括脑卒中和心血管疾病在内的危及生命事件的重要危险因素，严重危害人类健康[1-2]。尽管自20世纪80年代以来，他汀类药物被广泛用作抗高脂血症或动脉粥样硬化的一线治疗药物[3]，但其具有如睡眠障碍、他汀相关肌肉症状和类风湿关节炎等副反应[4]。随着人口老龄化、动脉粥样硬化发病率的增高及未病先防理念的普及，寻找新的药物预防和治疗动脉粥样硬化的意义重大。
动脉粥样硬化的发生机制复杂，脂质沉积、炎症和氧化应激是其主要病理因素[5]。代谢特征作为基因和表型之间的关键联系，近年来在筛选生物标志物和阐释疾病发生的潜在机制上逐渐被重视[6]。已有研究表明，代谢紊乱是动脉粥样硬化发生和发展的关键因素[7]，动脉粥样硬化危险人群的血液代谢谱具有变异性甚至遗传性，如氨基酸、脂类、酰基肉碱物种等[8-10]，其中氨基酸代谢的紊乱可能导致内皮细胞发生功能障碍，极大地影响着血管稳态和动脉粥样硬化的发生[11]。
益气通脉方具有益气化瘀、通络泄浊的功效，能够促进机体气血循环，推陈致新，并且前期临床研究发现其能显著改善患者颈部血管斑块数量及体积，防治脑血管疾病[12]。而动脉粥样硬化及益气通脉方干预下的代谢谱及机制分析尚不完善。此次研究基于超高效液相色谱-质谱(ultrahigh performance liquid chromatography-mass spectrometer，UHPLC-MS/MS)高通量靶标氨基酸代谢组学技术和多元统计分析方法，对比各组小鼠血清氨基酸代谢的变化，为进一步探寻动脉粥样硬化的发病机制及中医药的可能治疗机制奠定基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，单因素方差分析、多元变量统计分析。
1.2 时间及地点实验于2020年12月至2021年6月在河南省中医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 C57遗传背景的载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺陷小鼠是人类动脉粥样硬化研究的理想动物模型[13]，因而此次研究选取 SPF 级雄性C57/B6J小鼠36只，其中6只作为正常组，其余30只为载脂蛋白E缺陷(ApoE-/-)小鼠，6 周龄，体质量20-25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006，实验动物合格证编号：110011200110972671。饲养于河南省中医院中心实验室动物中心，饲养环境恒温、恒湿，温度23-25 ℃，湿度50%-70%，12 h交替照明。
实验动物普通饲料及高脂高胆固醇饲料(H10540)由北京科澳协力饲料有限公司提供[经营许可证号：SCXK(京)2019-0003]。详细实验经河南省中医院动物实验伦理委员会审核，批准号：PZ-HNSZYY-2020-07。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要药物、试剂与仪器益气通脉方(人参、三七、丹参、土鳖虫、水蛭、生大黄)中所有饮片均来自河南省中医院药剂科，由赵旭主任药师鉴定；阿托伐他汀(国药准字H20051408，批号：CG7037)，辉瑞制药有限公司。将以上中药饮片及西药粉碎制得细粉，于4 ℃存储备用。按《药理实验方法学》剂量换算表[14]，将成人每日剂量[益气通脉方0.2 g/(kg·d)，阿托伐他汀钙片0.33 mg/(kg·d)]，以 0.002 6为换算系数，换算成20 g小鼠每日的等效剂量为益气通脉方0.78 g/(kg·d)，阿托伐他汀2.6 mg/(kg·d)；益气通脉方取临床等效剂量的1/2倍、1倍、2倍[0.39 g，0.78 g，1.56 g/(kg·d)]，制得益气通脉方低、中、高剂量组；阿托伐他汀组取阿托伐他汀临床等效剂量，分别于0.9%氯化钠溶液中制得药物混悬液[15]。无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，苏木精-伊红染液(Servicebio生物科技有限公司)，甲醇、乙腈、甲酸(CNW Technologies公司)。
超高效液相1290 InfinityⅡseries UHPLC System型、质谱6460 Triple Quadrupole Mass Spectrometer型(Agilent公司)、离心机Heraeus Fresco17型(Thermo Fisher Scientific公司)，超声仪YM-080S型(深圳市方奥微电子有限公司)。
1.4 方法
1.4.1 模型制备与分组实验小鼠适应性喂养4周后，C57/B6J小鼠(n=6)，普通饮食基础上以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃为正常组；30只ApoE-/-基因小鼠按随机数字表法分为5组，每组6只；其中模型组在高脂饮食基础上以等体积氯化钠溶液灌胃；益气通脉方低、中、高剂量组在高脂饮食基础上分别以益气通脉方0.39，0.78，1.56 g/(kg·d)灌胃；阿托伐他汀组在高脂饮食基础上以阿托伐他汀钙片2.6 mg/(kg·d)灌胃。12周后取模型组主动脉根部判断模型是否成功。

1.4.2 主动脉样本采集与处理采样前禁食不禁水12 h，腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，摘眼球取血，分离血清，并剥取主动脉。去除周围的脂肪组织后于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上，石蜡包埋切片并苏木精-伊红染色，观察各组主动脉组织病理变化，并利用Imagepro软件测量各组主动脉血管狭窄率。

血管狭窄率=斑块面积/血管面积×100%。
1.4.3 血清样本处理与检测将样本置于冰水浴解冻，涡旋10 s以混匀；取50 µL待测样本于EP管中，向其中加入200 µL 甲醇乙腈混合提取液(体积比= 1∶1，含同位素标记内标混合物，-20 ℃预冷)，涡旋30 s混合均匀；冰水浴超声15 min；将样本液-40 ℃静置1 h；样品在4 ℃，12 000 r/min，离心15 min；取80 µL上清液至LC进样瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析。
流动相条件：此项目使用Agilent 1290 InfinityⅡseries (Agilent Technologies)超高效液相色谱仪，通过Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (100×2.1 mm，1.7 μm，Waters)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为1%甲酸水溶液，B相为1%甲酸乙腈。柱温箱温度为35 ℃，样品盘设为4 ℃，进样体积为1 μL。
质谱条件：此项目使用装备AJS-ESI离子源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下：高压毛细管电泳+4 000/-3 500 V，喷嘴电压+500/-500 V，N2气体温度300 ℃，N2气体流5 L/min，鞘N2气体温度250 ℃，气流量11 L/min，压力310.3 kPa。
1.5 主要观察指标
1.5.1 苏木精-伊红染色观察主动脉组织病理变化将切片依次放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-体积分数75%乙醇5 min，自来水洗；放入苏木精染液染3-5 min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；依次入体积分数85%，95%的梯度乙醇脱水各5 min，入伊红染液中染色5 min；依次放入无水乙醇Ⅰ5 min -无水乙醇Ⅱ5 min-无水乙醇Ⅲ 5 min -二甲Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min，透明中性树胶封固。镜下观察拍照。
1.5.2 氨基酸代谢高通量靶标检测利用UHPLC-MS/MS平台进行高通量靶标代谢组学定量检测，包括1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、4-氨基丁酸、4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、β-丙氨酸、甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-瓜氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸、L-蛋氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-天冬酰胺和L-赖氨酸，共25个目标氨基酸代谢物。
1.6 统计学分析原始数据预处理后，对氨基酸代谢组的定量结果进行Student’s t检验的单变量统计分析，主成分分析、正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)的多元变量统计分析，以P < 0.05认为有统计学意义，并符合变量投影重要度(variable importance in the projection，VIP)大于1，筛选组间差异代谢产物。随后对可选择数据进行单因素方差分析及箱线图分析。计量资料应用GraphPad Prism 8.0统计学软件进行数据处理，两组间比较采用LSD t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way Anova)，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经河南省中医院生物统计学专家审核。

讨论

课题组认为元气亏虚、瘀血和痰浊阻滞是动脉粥样硬化发生的重要病理因素。益气通脉方由人参、三七、丹参、水蛭、土鳖虫、生大黄按照特定比例配伍打粉所制散剂，涵盖培元、活血通络、泄浊三大治疗思想。方中人参大补元气，助气行血，并扶助正气，祛邪外出，为君药。三七活血化瘀，而不伤正气，主治留滞在脉之新瘀，丹参凉血活血调经，主治留滞在脉之久瘀，并阻止瘀浊化热，二者功在活血化瘀；土鳖虫逐瘀、破积、通络，水蛭破血、逐瘀、通经，二者为虫类药物，“灵动迅速”，能“追拔沉混气血之邪”“搜剔络中混处之邪”，功在破血通经活络，主治日久入络之顽瘀；共为臣药。生大黄相对少剂量应用，意在通泄而不伐伤元气，能够通腑泄浊、攻下积滞、凉血散瘀，配合人参为机体祛邪外出提供动力，使痰瘀之邪有出路，从大便而走，主治留滞在脉之痰浊，并能制约人参之热，为佐助药。六味药物合用，有补有泻，有升有降，共奏补益元气、活血通络泄浊之功。现代药理研究表明，方药主要成分在治疗动脉粥样硬化上有着积极的作用。人参皂苷能够干预凋亡通路及相关蛋白，发挥抗氧化应激、抗炎、抗凋亡作用，保护神经及血管[16-18]；三七总苷能够抑制泡沫细胞形成，减轻血管炎症反应及颈动脉内中膜厚度[19-20]；丹参多酚酸盐可以调整脂代谢，抗氧化损伤[21]；土鳖虫提取物能够保护血管内皮抗氧化应激损伤[22]；水蛭有效成分能够抑制巨噬细胞焦亡和泡沫细胞形成，保护血管平滑肌[23-24]；大黄素能够抗氧化应激及炎症反应，抗动脉粥样硬化[25-26]。
氨基酸是蛋白质的组成部分，在蛋白质合成中发挥作用，对生理病理活动有重要的影响。通常氨基酸作为细胞途径中的代谢物或中间体，直接参与新陈代谢，能够合成具有重要生物学意义的激素和低分子量氮物质的前体，如一氧化氮、多胺、谷胱甘肽、牛磺酸等，是基因表达和蛋白磷酸化级联的关键调控因子[27]。氨基酸及其代谢产物的生化相关性可能在代谢紊乱以及其他与氧化应激相关的病理研究中具有重要意义。研究结果表明，动脉粥样硬化模型小鼠具有明显的动脉粥样硬化特征，血清L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸水平显著升高，L-精氨酸、3-甲基-L-组氨酸水平显著降低，这些代谢产物可能是动脉粥样硬化的潜在生物标记物。益气通脉方或阿托伐他汀干预后，各治疗组动脉粥样硬化明显改善，差异氨基酸水平得到改善。其中高剂量益气通脉方干预后能够显著下调L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸水平，上调L-精氨酸水平(P < 0.05)；阿托伐他汀干预后能够显著下调L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸水平，上调L-天冬氨酸、3-甲基-L-组氨酸(P < 0.05)；相较于阿托伐他汀，益气通脉方在上调L-精氨酸、下调L-酪氨酸水平上有显著优势。
L-酪氨酸是甲状腺激素的前体，也是儿茶酚胺类激素的合成原料，参与机体内多种代谢过程。L-酪氨酸可能通过抗氧化应激、凋亡，改善动脉粥样硬化。在体内，L-酪氨酸被氧化成双酪氨酸结构时，导致蛋白质聚合，促进氧化应激，对机体生理病理状态有重要影响；酪氨酸激活酪氨酸转氨酶时，则能够促进细胞凋亡[28]。L-酪氨酸过度积累，能够导致三羧酸循环中的关键酶发生功能变化，进而使机体能量代谢紊乱，引发线粒体的氧化应激[29]。有研究发现，L-酪氨酸含量减少会影响甲状腺功能减退，引发氧化应激的形成，并且补充L-酪氨酸，可以改善小鼠抗氧化的能力，减轻体内氧化应激反应[30]。同时，WYPYCH等[31]研究表示，L-酪氨酸在体内的积累能改善炎症反应，对保护机体有一定的保护作用。一项人体代谢高通量分析研究发现，L-酪氨酸与冠心病的严重程度和冠状动脉狭窄程度密切相关，可能是临床动脉粥样硬化发病前的标志物[32]。在此次研究中，益气通脉方能够降低L-酪氨酸水平，抗动脉粥样硬化，其具体机制可能与抗氧化应激或凋亡等有关。
L-精氨酸在血管稳态和心脑血管等疾病状态下生理和病理学中有重要的作用[33]。L-精氨酸可能通过抗氧化应激、炎症反应，调整肌酸和能量代谢，改善动脉粥样硬化。尿素循环中，L-精氨酸由一氧化氮合酶和精氨酸酶分别催化为一氧化氮和尿素，而一氧化氮作为血管功能和张力的关键代谢物，在内皮细胞中扩散到动脉血管平滑肌细胞，激活一氧化氮/cGMP级联，使动脉血管平滑肌细胞松弛，抗动脉粥样硬化，在血管内稳态中起着至关重要的作用[34]。此外，L-精氨酸作为甘氨酸脒基转移酶的底物，被催化为胍基乙酸，再经胍基乙酸甲基转移酶转化为肌酸[35-36]。研究表明，肌酸水平与脂肪摄入量及心血管事件呈负相关[37]。因此，L-精氨酸作为肌酸和能量代谢中的关键前体，影响着动脉粥样硬化的发展。实验研究中，动脉粥样硬化小鼠血清L-精氨酸水平下降，进一步验证了L-精氨酸发生异常代谢，而益气通脉方干预后提高了动脉粥样硬化小鼠L-精氨酸水平。因此，益气通脉方可能通过调节精氨酸代谢，促进能量代谢，减少氧化应激和脂质沉积对血管内皮的损伤。
在体内，L-天冬氨酸由L-谷氨酸转氨给草酰乙酸而得。在鸟氨酸循环中，L-天冬氨酸能够促进生成尿素，降低血液中氮的含量。YANNI等[38]研究L-天冬氨酸和L-谷氨酸同时干预，能够抑制动脉粥样硬化兔模型的血管脂肪条纹形成，抑制主动脉内膜增厚和动脉粥样硬化进展。MARTIN-LORENZO等[39]研究发现，在主动脉组织中L-天冬氨酸沉积，并且在尿液中的循环减少。L-天冬氨酸可能在动脉粥样硬化患者中也有所升高[40]。此次研究中，动脉粥样硬化小鼠血清中L-天冬氨酸、L-谷氨酸水平显著升高，益气通脉方能够下调L-天冬氨酸、L-谷氨酸，可能是通过尿素循环，调节了活性氮自由基的生成，减轻氧化应激反应，抑制血管内皮损伤。
缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸属于支链氨基酸。最新研究证明，每种支链氨基酸都有独特的代谢作用。L-缬氨酸作为支链氨基酸合成通路上的关键产物，它的减少能够调整肝脏脂肪代谢，增加能量消耗，激活FGF21-UCP1轴，促进机体能量平衡[41]。L-缬氨酸能够激活许多代谢过程的关键调控因子mTOR机制靶点，参与调节细胞自噬等蛋白质的翻译和修饰[42]。此外，L-缬氨酸还可能通过调控PI3K/AKT等多个信号通路，影响巨噬细胞极化、脂质代谢、自噬等多种功能，是治疗动脉粥样硬化的潜在靶点[37，43]。此次研究中，动脉粥样硬化小鼠血清L-缬氨酸水平增高，益气通脉方可能通过调节L-缬氨酸水平，干预PI3K/AKT等信号通路，发挥抗动脉粥样硬化的作用。
综上所述，益气通脉方可延缓动脉粥样硬化的进程，其作用机制可能与调节氨基酸代谢，参与抗氧化应激、炎症反应等有关。下一步将结合蛋白组学、生化检测等，进一步探讨益气通脉方防治动脉粥样硬化的机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

益气通脉方干预动脉粥样硬化模型小鼠血清氨基酸代谢的变化

Effects of Yiqi Tongmai Fang on serum amino acid metabolism of atherosclerotic mice

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