2.2  血浆低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇的检测结果  与对照组相比较，高脂组、液氮组及液氮+免疫刺激组大鼠中的低密度脂蛋白胆固醇水平均明显升高(P < 0.05)，而高密度脂蛋白胆固醇水平则明显下降(P < 0.05)；高脂组、液氮组及液氮+免疫刺激组组间比较时，三者均无明显差异(P > 0.05)。见表1。

2.3  血浆超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α、单核细胞超化蛋白1、基质金属蛋白酶9水平等炎症指标的检测结果  与对照组相比较，高脂组大鼠血清中的超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α、单核细胞超化蛋白1、基质金属蛋白酶9等指标无明显变化(P > 0.05)；与对照组及高脂组相比较，液氮组及液氮+免疫刺激组中大鼠血清中的炎症指标均明显升高，而液氮+免疫刺激组升高趋势则更显著(P < 0.05)；与液氮组相比较，液氮+免疫刺激组中的炎症指标明显升高(P < 0.05)。见表2。

2.4  血浆丙二醛、活性氧簇、氧化修饰型低密度脂蛋白等氧化应激损伤指标的检测结果  与对照组相比较，高脂组大鼠血清中活性氧簇以及丙二醛及氧化修饰型低密度脂蛋白无明显变化(P > 0.05)；与对照组及高脂组相比较，液氮组及液氮+免疫刺激组中的活性氧簇及丙二醛、氧化修饰型低密度脂蛋白均明显升高，而液氮+免疫刺激组升高趋势则更显著(P < 0.05)；与液氮组相比较，液氮+免疫刺激组中的活性氧簇及丙二醛、氧化修饰型低密度脂蛋白明显升高(P < 0.05)。见表3。

2.5  血红素氧合酶1蛋白表达量的检测  对照组、高脂组、液氮组、液氮+免疫刺激组血红素氧合酶1蛋白表达量依次为0.041±0.002，0.045±0.002，0.068±0.003，0.096± 0.007；与对照组比较，高脂组血红素氧合酶1蛋白表达量无明显变化，而液氮组、液氮+免疫刺激组明显升高(P < 0.05)；与高脂组相比较，液氮组、液氮+免疫刺激组血红素氧合酶1蛋白表达量明显升高，而液氮+免疫刺激组升高更显著(P < 0.05)；与液氮组相比较，液氮+免疫刺激组中血红素氧合酶1蛋白表达量明显升高(P < 0.05)。见图1。

2.6  各组大鼠颈总动脉镜下组织病理学变化  对照组大鼠镜下组织病理学显示动脉内皮排列整齐，未见明显粥样斑块形成；高脂组大鼠镜下提示动脉内膜稍增厚，但仍未见明显粥样斑块形成；液氮组大鼠镜下可见粥样硬化斑块形成，其纤维帽较厚，帽下可见较多的胶原纤维、少量沉积的脂质、泡沫细胞以及少许炎症细胞；而液氮+免疫刺激组大鼠内膜下可见明显增厚隆起的斑块，各层结构排列明显紊乱，斑块内纤维含量明显减少，纤维帽薄且欠完整，其帽下可见大量浸润的巨噬细胞，并可见大量泡沫细胞及脂质，中膜平滑肌纤维排列也明显紊乱。见图2。

众所周知，由不稳定斑块破裂及局部血栓形成所诱发的急性冠脉综合征及急性缺血性脑卒中等疾病在世界范围内均具有极高的致残率和致死率，面对日趋年轻化的心血管疾病高发现实，加强以动脉粥样硬化为病理基础的缺血性心、脑血管疾病的防治工作已刻不容缓^[1-2]。已有大量研究证实，动脉粥样硬化系一种多因素性疾病，可由先天易感性遗传因素及后天性外在危险因素共同导致；在其外在危险因素中，吸烟、血脂与血糖代谢异常、高血压疾患等目前已被证实为致动脉粥样硬化的高危因素，尽管各种危险因素致动脉粥样硬化的机制不尽相同，但炎症及氧化应激的进展为不稳定斑块致急性缺血事件的共同特征^[3-5]，其具体发病机制迄今尚未完全阐明。因此，建立合适的动物易损斑块模型以供研究对心脑血管疾病的防治工作具有重要的指导意义，但目前尚无公认的复制易损斑块的方法。目前已有文献表明，采用适当的免疫刺激可促进动脉粥样硬化的成模，但耗时长成本高；也有学者将液氮注入血管腔内以复制动脉粥样硬化模型，同样也因为其操作复杂、血管出血死亡率高等缺陷暂未广泛应用于动脉粥样硬化的模型构建^[6-7]。文章在综合整理相关文献后，将免疫刺激及液氮损伤结合起来进行优化整合，以期能够复制出能广泛应用的动脉粥样硬化易损斑块模型。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物观察。

1.2  时间及地点  实验于2017年6月至2018年12月在西南医科大学医学实验中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  8周龄左右雄性SPF级SD大鼠40只，体质量(220±10) g，均由西南医科大学医学实验中心提供和喂养；喂养环境室温(22±2)℃，相对湿度(55±5)%；生产许可证号：SCXK(川)2019-27，使用许可证号：SYXK(川) 2019-042。所有实验动物均按照3R原则施以人道主义关怀。

1.3.2  主要试剂  维生素D3注射液(江苏吴中医药集团有限公司，批号QT171235)、戊巴比妥钠(上海榕柏生物技术有限公司，批号171104W)、卵清白蛋白及牛血清蛋白(北京索莱宝科技有限公司，批号为201714P2，714W052)；氧化修饰型低密度脂蛋白、丙二醛、基质金属蛋白酶9、超敏C-反应蛋白、白细胞介素10、单核细胞超化蛋白1、活性氧簇等(英国Abcam公司，批号分别为Ek-R31010、Ek-AQ2098、Ek-LQ5406、Ek-R30257、Ek-HT0296、Z06527、LY-Z0932Q)。

1.3.3  主要仪器  全自动生化分析仪(湖南湘仪实验室仪器，型号：TBA-40FR)，电子称重天平(德国Satorius公司)，酶标仪(Diatek公司，型号DR-200Bs)，手术操作器械(深圳徕越生物技术有限公司)，台式离心机(上海安亭科学仪器厂，型号TGL-16c)，医用高压消毒灭菌锅(上海鼎谦生物科技有限公司)，脱色摇床(北京市六一仪器厂，型号WD-9405A)，医用低温冰箱(山东博科科学仪器有限公司)。

1.3.4  高脂饲料配方  将比例为3%-0.5%-0.2%-5%- 10%的胆固醇粉-胆酸钠-丙硫氧嘧啶-白砂糖-猪油的混合物加入比例为81.3%的基础饲料粉剂中搅拌混匀，并制成特制高脂饲料以供实验大鼠食用。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组、饲养方法及免疫刺激方法  雄性SD大鼠40只，经适应性喂养1周后将其随机分为4组，即对照组、高脂组、液氮组、液氮+免疫刺激组。其中对照组及高脂组大鼠分别予以常规饲料及特制高脂饲料喂养2周后，予以维生素D3注射液(70×10⁴ U/kg)经腹腔一次性注射，并施以假手术操作，术后继续分别予以常规饲料及特制高脂饲料喂养10周。液氮组及液氮+免疫刺激组大鼠经特制高脂饲料喂养2周，予以维生素D3注射液(70×10⁴ U/kg)经腹腔一次性注射后，分别施以液氮冷冻损伤术，术后液氮组及液氮+免疫刺激组大鼠继续予以高脂饲料饲养10周；期间液氮+免疫刺激组大鼠加以免疫刺激：即予以牛血清白蛋白经皮下注射(每周3次，共计3周，以40 mg/kg注射)及卵清白蛋白经腹腔注射 (间隔3 d注射，共计5次，以2.5 mg/kg注射)，而液氮组大鼠予以等量生理盐水同期进行干预^[8]。此外，在各组大鼠饮水中不间断中加入FeSO₄粉剂，剂量为(250 mg/L)。

1.4.2  液氮冷冻损伤术具体方法  对照组及高脂组大鼠仅予以假手术处理：即右颈总动脉经逐层分离充分暴露后，仅予以生理盐水代替液氮模拟冷冻损伤。液氮组及液氮+免疫刺激组大鼠参照整理后的文献^[8-9]，采用优化后的造模方法：即经高脂饲料饲养2周，并予以维生素D3注射处理后施以液氮冷冻术，其具体方法如下：在无菌环境下经腹腔注射1%戊巴比妥钠(剂量约为50 mg/kg)施行麻醉，待大鼠痛觉消失后，将大鼠四肢及头部固定于手术操作台上。经消毒、铺巾后，充分暴露其颈前区，沿其颈前正中线位置将其皮肤切开，逐层分离皮下组织并分开颈动脉鞘，充分暴露其右侧颈总动脉。以一微动脉夹阻断近心端血流，用玻勾充分排空远心端血流后再以另一微动脉夹阻断远心端血流，使得2个动脉夹之间的血管长度为2.0-3.0 cm，其下再垫以清洁的橡胶片充分保护血管周围组织以避免液氮冷冻时对周围组织造成不必要的误伤。术野准备完毕后取液氮持续、准确滴注于分离的靶血管段，可见靶血管段瞬间色泽变得苍白，保持血管持续冷冻时间为45 s^[9]。停止冷冻约1 min后血管自然复温软化，小心依次去除靶血管段远心端及近心端的动脉夹，观察血流恢复情况，待血管血流恢复畅通后从内至外逐层缝合切口。

术后除切口局部滴加少许青霉素钠溶液外，还经腹腔注射青霉素钠(剂量为8万单位/只)预防感染，连续用药3 d。

1.4.3  标本的收集  造模满10周后，经腹腔注射戊巴比妥钠施行麻醉术，开腹穿刺其腹主动脉抽取4.0-5.0 mL血样于EDTA真空抗凝试管中，充分离心分离出血浆和白细胞待检测。

1.4.4  血浆高、低密度脂蛋白胆固醇的检测  在12 h内取部分血浆通过TBA-40FR全自动生化分析仪进行低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇等血脂指标的测定。

1.4.5  血浆炎症损伤指标的检测  取部分血浆，严格按照试剂盒说明书操作，在12 h内采用酶联免疫吸附测定法(ELASA)进行血浆超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α、单核细胞超化蛋白1、基质金属蛋白酶9水平等指标的测定。

1.4.6  血浆氧化应激损伤指标的检测  取部分血浆，严格遵循化学比色法操作步骤，在12 h内进行活性氧簇、丙二醛、氧化修饰型低密度脂蛋白的检测。

1.4.7  血红素氧合酶1蛋白的检测  取分离出的白细胞，按照血红素氧合酶1抗体试剂盒说明书进行Western Blot操作步骤以检测血红素氧合酶1蛋白表达量，选取GAPDH为内参，通过Quantity图像分析软件对相对表达量进行分析，并以目标蛋白与内标的灰度比值来进行表示。

1.4.8  靶血管段病理学检查  血样搜集完毕后处死各组大鼠，截取造模的大鼠颈总动脉段行常规固定、脱水、浸蜡和包埋，并切片行苏木精-伊红染色于光镜下观察靶血管镜下斑块病理变化。

1.5  主要观察指标  ①大鼠血浆低密度脂蛋白胆固醇及高密度脂蛋白胆固醇；②血浆超敏C-反应蛋白、肿瘤坏死因子α、单核细胞超化蛋白1、基质金属蛋白酶9水平；③血浆丙二醛、活性氧簇、氧化修饰型低密度脂蛋白水平；④大鼠血红素氧合酶1蛋白表达；⑤大鼠颈总动脉镜下组织病理学变化。

1.6  统计学分析  通过SPSS 22.0统计学软件进行分析；实验计量数据均以x(_)±s表示，采用单因素方差做分析研究，在方差齐时采用LSD法进行组间比较；反之，则采用t 检验方式；以P < 0.05时认为差异有显著性意义。

长期以来，关于动脉粥样硬化早中期病变的模型构建已相对成熟，但尚缺乏能够广泛复制的动脉粥样硬化晚期易损斑块模型构建方法。国内外学者在探索易损斑块模型构建之初，采用单纯高脂饮食构建粥样硬化易损斑块模型，但其造模时间长、成模率低，基于此，有学者对饮食进行改造，即在特制饮食中加入链脲霉素等药物破坏实验动物的胰岛细胞，促使血糖水平增高进而加速动脉粥样硬化向易损斑块的发展^[11]，但此类造模方式的缺陷在于仅考虑了高水平血糖相关性易损斑块介导的急性缺血事件，不能反映临床上多因素相互作用(如吸烟、血脂代谢紊乱、高血压等)形成的斑块所介导的血管事件。随后有研究者再次进行改进，采取外源性药物(如蝰蛇毒、维生素K拮抗剂等)以及机械性损伤(如球囊扩张损伤血管、结扎动脉)等干预方式促进斑块破裂形成易损斑块^[12-14]，然上述人为干预措施形成的易损斑块与人类斑块自发破裂的病理生理过程仍有较大差距。随着近些年基因技术的发展，国外有学者将P53基因转染至ApoE^-/-实验小鼠体内促进易损斑块形成^[15]，尽管其形成的易损斑块与人类相似度较高，但由于小鼠血管细小、基因操作技术复杂、标本获取难度大以及成本高等缺陷仍难得以推广。大鼠为易于获取的饮食结构与人类相似的常用实验动物，理论上可以构建出与人体动脉粥样硬化形态结构特征相似的疾病模型^[10]，考虑到雌性大鼠体内较高的雌激素水平有碍于动脉粥样硬化模型的建立，因此，为复制出理想的动脉粥样硬化易损斑块模型，作者仅选用雄性SD大鼠作为实验对象。

既往有学者利用免疫刺激方法进行动脉粥样硬化的模型构建^[16]，也有学者利用液氮复制动脉粥样硬化模型，而此次实验则将两者有机结合起来用以易损斑块模型的构建：考虑到动脉粥样硬化的发生发展是以低密度脂蛋白胆固醇为主的脂质沉积在受损的内皮下为始发环节，预先连续2周给高脂组、液氮组、液氮+免疫刺激组大鼠喂养特制的高脂饮食以使其血浆胆固醇水平(主要是低密度脂蛋白胆固醇)升高后，再给各组大鼠经腹腔注射维生素D3促进Ca²⁺在内皮细胞的沉积^[17]；在此基础上再手术分离颈总动脉，对液氮组、液氮+免疫刺激组大鼠施以液氮充分冷冻的方法人为损伤其颈总动脉血管内皮，此时血浆中已显著升高的胆固醇便可有效沉积到内皮下，液氮冷冻血管后，受损的内皮细胞会释放大量炎症因子以及生长-趋化因子(如肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶9等)，促进单核-巨噬细胞在局部聚集，并籍此放大炎症反应促进氧化应激水平的提高，同时聚集的细胞可包裹吞噬已显著增高的血浆脂质促进泡沫细胞沉积在受损的内皮下^[18]；液氮冷冻术后继续予以高脂饲料喂养以保持血浆高低密度脂蛋白胆固醇水平；同时还因高铁储存量水平可加速动脉粥样硬化的发展^[19]，实验持续在各组大鼠饮水中加入FeSO₄粉剂。与此同时，还间断给液氮+免疫刺激组大鼠予以牛血清白蛋白及卵清白蛋白等异体蛋白注射以诱发持续性免疫炎症反应^[20]。加以持续免疫刺激诱导的炎症反应可提高内皮素1水平、降低大鼠体内一氧化氮含量，并进一步增强巨噬细胞黏附性，提高体内氧化应激水平。经上述综合措施干预12周后，选取相关指标进行检测分析，结果表明：单纯高脂饲料喂养的高脂组大鼠除血脂水平变化显著外，其余炎症指标、氧化应激损伤指标、血红素氧合酶1蛋白表达量较常规饲料喂养的对照组大鼠均无明显变化，同时镜下病理学也仅仅是稍增厚，无明显粥样斑块形成；而除特制高脂饲料喂养外，额外予以液氮冷冻损伤的液氮组以及同时施以液氮冷冻损伤和免疫刺激的液氮+免疫刺激组大鼠尽管血脂水平较高脂组大鼠无明显差异，但这2组大鼠血清炎症指标、氧化应激指标、血红素氧合酶1表达量却有显著变化，有趣的是液氮+免疫刺激组大鼠的变化趋势较液氮组更为显著，表明液氮+免疫刺激组大鼠体内具有更明显的的炎症及氧化应激状态，这可能与同时施以液氮冷冻损伤和免疫刺激较单纯施以液氮冷冻损伤更能激发大鼠体内炎症及氧化应激状态相关，同时这也解释了为何液氮+免疫刺激组大鼠的变化趋势较液氮组会更为显著。

斑块内的炎症及氧化应激状态是粥样斑块不稳定的关键性因素^[21]，上述相关炎症及氧化应激损伤指标均为特意遴选出与动脉粥样硬化发生、发展及斑块稳定性紧密相关的分子学标志物，特别是基质金属蛋白酶9、超敏C-反应蛋白及氧化修饰型低密度脂蛋白等均被视为判定斑块易损性的重要指标^[22-24]，而这些指标在液氮+免疫刺激组大鼠血清中具有显著变化。从病理学检查结果看，液氮组、液氮+免疫刺激组大鼠靶血管病理学检查均可见斑块形成，但值得注意的是，液氮+免疫刺激组大鼠镜下斑块结构与液氮组相比，具有非常显著的巨噬细胞浸润，同时纤维帽薄且不完整，纤维帽下的泡沫细胞及脂质也更为明显，而纤维含量却明显减少，各层结构的排列也极为紊乱，这些镜下组织病理学改变也进一步证实了液氮+免疫刺激组大鼠颈总动脉斑块的易损性。通过上述复合措施干预后，液氮+免疫刺激组大鼠既有符合易损斑块特征的组织病理学形态结构改变，也通过分子标志物水平的变化反映出斑块内显著的炎症及氧化应激状态，两者结合起来表明成功在液氮+免疫刺激组大鼠中复制出了易损斑块模型，这也符合近些年国内外学者对“易损斑块”的定义：即包括薄帽纤维斑块和由脂质核心、薄纤维帽、大量巨噬细胞浸润组成的病变^[25-26]。

此次实验结合既往相关文献对液氮冷冻损伤术也进行了改良，无需采用注射器精细将液氮注入血管腔内，利用液氮透壁全层冷冻损伤保证了管壁的完整性而避免实验大鼠出血死亡，操作相对简单。大鼠易于获取和喂养，此外，液氮冷冻损伤联合持续免疫刺激可在血管内皮已有损伤的基础上，持续诱导炎症反应加速动脉粥样硬化的进展，具成本低、死亡率低、造模时间短，实验操控性及可重复性好、成模率高等优点，有望成为推进基础研究及药物干预实验的的标准动物模型。

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文题释义：

免疫刺激：通过免疫刺激剂激活机体的非特异性免疫和/或特异性免疫，增强机体的免疫应答，并可籍此激活嗜中性粒细胞和白细胞的吞噬作用，刺激淋巴细胞的产生或分泌淋巴因子，协调机体的细胞免疫和体液免疫对外界刺激物做出排斥反应等。

易损斑块：动脉粥样硬化斑块进程后期形成的不稳定和有斑块破裂倾向的斑块，主要组织病理学特征包括薄帽纤维斑块和由脂质核心、薄纤维帽、大量巨噬细胞浸润组成的斑块。

既往有学者利用免疫刺激方法进行动脉粥样硬化的模型构建^[16]，也有学者利用液氮复制动脉粥样硬化模型，而此次实验则将两者有机结合起来用以易损斑块模型的构建。大鼠为易于获取的饮食结构与人类相似的常用实验动物，理论上可以构建出与人体动脉粥样硬化形态结构特征相似的疾病模型，考虑到雌性大鼠体内较高的雌激素水平有碍于动脉粥样硬化模型的建立，因此，为复制出理想的动脉粥样硬化易损斑块模型，作者仅选用雄性SD大鼠作为实验对象。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程