1.4.8  实时定量PCR检测PCNA、Bax及Bcl-2 mRNA表达  根据PCNA、Bax、Bcl-2和GADPH基因的序列，设计PCR引物，见表1。用不同质量浓度大蒜素(0，25，50，100 mg/L)处理成纤维细胞24 h后，使用Trizol试剂盒提取总RNA，并按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。以反转录合成的cDNA为模板，GADPH为内参,进行实时定量PCR检测。体系参数如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次。每组实验重复3遍，用2^-??Ct计算所得数据，得到PCNA、Bax和Bcl-2 mRNA的相对表达量。

2.1  大蒜素对细胞活力的影响  不同质量浓度大蒜素处理成纤维细胞后，成纤维细胞增殖被显著抑制，并呈剂量依赖性，见表2及图1，加药组细胞存活率与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，IC₅₀值为58.18 mg/L。

2.1  大蒜素对细胞活力的影响  不同质量浓度大蒜素处理成纤维细胞后，成纤维细胞增殖被显著抑制，并呈剂量依赖性，见表2及图1，加药组细胞存活率与对照组比较差异均有显著性意义(P < 0.01)，IC₅₀值为58.18 mg/L。

2.2  大蒜素对成纤维细胞形态的影响  不同质量浓度大蒜素作用于成纤维细胞24 h后，对照组细胞呈梭形，大小均匀，核仁呈椭圆形，贴壁生长。随着大蒜素质量浓度的增加，细胞体积变小，形态不规则，呈现凋亡特征。荧光显微镜下对照组细胞结构清晰，包膜完整，着均匀的绿色荧光。随药物质量浓度增大，活细胞比例逐渐减少，部分细胞核染色质着橘红色，并出现凋亡小体，见图2。

2.3  大蒜素对成纤维细胞迁移能力的影响  不同质量浓度大蒜素处理成纤维细胞24 h后细胞划痕结果见图3，细胞迁移率分别为(52.87±3.13)%，(41.80±2.04)%，(28.04± 1.55)%及(13.57±1.39)%。与对照组比较，随着大蒜素质量浓度增加，细胞迁移率逐渐下降，差异有显著性意义(n=3，P < 0.01)。Transwell结果见图3，迁移细胞数分别为335.67±10.02，228.00±13.53，153.00±5.57，66.00± 6.56。与对照组比较，随大蒜素质量浓度增加，穿膜细胞数逐渐下降，差异有显著性意义(n=3，P < 0.01)。

2.4  大蒜素对细胞周期的影响  不同质量浓度大蒜素处理成纤维细胞24 h后，与对照组比较，G₁期细胞数量随大蒜素质量浓度增加而减少，S期和G₂期细胞随大蒜素质量浓度增加而增多，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表3及图4。

2.4  大蒜素对细胞周期的影响  不同质量浓度大蒜素处理成纤维细胞24 h后，与对照组比较，G₁期细胞数量随大蒜素质量浓度增加而减少，S期和G₂期细胞随大蒜素质量浓度增加而增多，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表3及图4。

2.5  大蒜素对细胞凋亡的影响  未经大蒜素处理的细胞主要为活细胞，随大蒜素质量浓度增加，细胞凋亡率分别为(2.48±0.29)%，(3.71±0.38)%，(6.73±0.86)%，(18.66± 1.67)%。与对照组比较，差异均有显著性意义(n=3，P < 0.01)，见图5。

2.6  不同质量浓度大蒜素对成纤维细胞增殖及凋亡相关蛋白表达的影响  与对照组比较，不同质量浓度大蒜素组中PCNA及Bcl-2表达下调，Bax表达上调，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图6。

2.7  不同质量浓度大蒜素对成纤维细胞PCNA、Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响  与对照组比较，不同质量浓度大蒜素组中PCNA及Bcl-2 mRNA表达下调，Bax mRNA表达上调，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图7。

腰椎硬膜外纤维化又称为硬膜外瘢痕形成，是椎板切除术后创面愈合过程的自我修复反应。正常的硬膜外纤维化有助于修复手术创面，然而过度纤维化常导致硬膜囊受压或神经根受压，使得轴浆运输受损、动脉供应受限、静脉回流受阻，从而产生一系列临床症状，包括腰腿部疼痛、麻木、无力等^[1-2]。硬膜外瘢痕的形成主要见于椎板切除术后，由于术区局部炎性因子和生长因子激活，大量成纤维细胞聚集，产生胶原纤维来修复椎板缺损部位。纤维结缔组织在缺损部位沉积，最终转变为瘢痕组织^[3-4]，因此成纤维细胞增殖被认为是硬膜外瘢痕形成的主要原因^[5]。研究发现95.6%的患者在椎板切除术后有硬膜外瘢痕过度增生，84.3%的患者同时伴有不同程度的疼痛^[6]，但目前并没有理想的治疗方法。多项基础研究表明，抑制成纤维细胞增殖可以预防硬膜外过度纤维化^[7-9]。最近多项研究已证实他克莫司、羟基喜树碱及丝裂霉素等药物可有效抑制成纤维细胞增殖从而减少硬膜外瘢痕形成^[10-12]，然而这些药物的毒副作用限制了在临床上的广泛使用，因此寻求一种既能预防硬膜外瘢痕且无明显毒性的药物一直在不断探索中。

大蒜素是一种具有2个烯丙基作为碳链的硫代亚磺酸盐，其在微生物、植物和哺乳动物细胞中具有多种生物活性^[13]。作为一种天然存在的有机含巯基化合物，大蒜素不仅具有抗炎、抗菌、降脂及抗肿瘤作用^[14-19]，而且有抗肺、肝、心脏等器官组织纤维化作用^[20-22]。此外，大蒜素作为大蒜提取物并没有明显的不良反应^[21]，但其在硬膜外瘢痕中的作用从未被研究。基于此，此次实验假设大蒜素可抑制硬膜外瘢痕来源的成纤维细胞增殖并诱导其凋亡，探究其作用机制，以求为预防硬膜外瘢痕提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  于2017年12月至2019年12月在扬州大学临床医学院生物医学实验中心完成。

1.3  药物及试剂  人体硬膜外瘢痕来源的成纤维细胞(中国科学院上海细胞典藏库，中国)，大蒜素(青岛捷世康生物科技有限公司，中国)，DMEM培养液、胎牛血清(Gibco公司，美国)，青霉素链霉素混合液、胰酶消化液(碧云天生物科技研究所，中国)，PBS(Hyclone公司，美国)，CCK-8试剂盒(Dojindo Laboratories公司，日本)，Transwell小室以及24孔细胞培养板(corning公司，美国)，AO/EB试剂盒、细胞周期试剂盒、细胞凋亡试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，中国)，细胞核增殖抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、Bax抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，中国)，Bcl-2抗体、二抗(上海爱必信生物科技有限公司，中国)，Trizol试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司，中国)，反转录试剂盒、实时定量PCR反应试剂盒及引物设计(上海吉凯基因科技有限公司，中国)。

1.4  方法

1.4.1  细胞培养  成纤维细胞经解冻复苏后常规培养于含有体积分数10%胎牛血清、100 mg/L链霉素和1×10⁵ U/L青霉素的DMEM培养液中，在37 ℃、体积分数5%CO₂及饱和湿度下孵箱中培养，隔日换液，取对数生长期细胞进行实验。

1.4.2  CCK-8检测细胞活力  将生长良好的细胞浓度为1×10⁵ L^-1的成纤维细胞悬液接种于96孔板，每孔200 μL，培养24 h后，空白孔不加入大蒜素(0 mg/L)，其他各实验孔分别加入质量浓度12.5，25，50，100，200和400 mg/L的大蒜素处理细胞。于孵箱培养24 h后，每孔加CCK-8试剂10 μL，孵化2 h，用酶标仪测定450nm处的吸光度(A值)。细胞存活率=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%。绘制细胞存活率曲线，并测定药物半数抑制率IC₅₀值。

1.4.3  细胞形态观察  根据1.4.2研究结果，选择终质量浓度为0，25，50，100 mg/L的大蒜素作用于成纤维细胞24 h，显微镜下观察细胞形态。取等体积混匀制成的AO/EB染色液4 μL加入到预观察的细胞悬液100 μL中，在室温下孵育 5 min，取10 μL于载玻片上，在荧光显微镜下观察。

1.4.4  划痕试验及Transwell检测细胞迁移能力  于6孔板中每孔加入约2×10⁵个成纤维细胞，培养24 h后用10 μL吸头于每孔垂直划3道划痕，PBS清洗划落的细胞，每孔依次加入大蒜素质量浓度分别为0，25，50，100 mg/L无血清培养液2 mL培养，分别于0 h及24 h观察。用ImageJ软件计算迁移率，迁移率=(初始面积-相应时间点的面积)/初始面积×100%。

24孔板Transwell上室中加入200 μL无血清培养基，并种入1×10⁵个成纤维细胞，下室加入大蒜素质量浓度分别为0，25，50，100 mg/L的含体积分数10%胎牛血清的培养液500 μL培养24 h。40 g/L多聚甲醛固定后用0.1%结晶紫染色，于倒置相差显微镜下观察、拍照，随机取3个视野计数迁移细胞数量。

1.4.5  流式细胞仪检测细胞周期  收集不同质量浓度大蒜素(0，25，50，100 mg/L)处理24 h后的成纤维细胞，     2 000 r/min离心5 min，预冷PBS洗涤2次，加体积为70%的无水乙醇固定过夜，1 000 r/min离心3 min，弃无水乙醇加预冷PBS洗涤2次，用事先配备好的PI/RNase染色工作液500 μL重悬细胞，室温避光孵育1 h后，上流式细胞仪检测。

1.4.6  AnnexinV-FITC标记流式细胞术检测细胞凋亡率 收集不同质量浓度大蒜素(0，25，50，100 mg/L)处理24 h后的成纤维细胞，2 000 r/min离心5 min，预冷PBS洗涤2次，PBS重悬细胞并计数，收集1×10⁵个细胞，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，依次加入5 μL的AnnexinV-FITC、5 μL的Propidium lodide混匀，室温下避光反应15 min上流式细胞仪检测。

1.4.7  Western Blot检测PCNA、Bax及Bcl-2蛋白表达  用不同质量浓度大蒜素(0，25，50，100 mg/L)处理成纤维细胞24 h后，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液裂解细胞，   12 000 r/min离心30 min取上清，即为细胞总蛋白。用BCA法进行蛋白定量，加入5×Loading Buffer按照体积4∶1的比例混匀，煮沸5 min使蛋白变性，进行SDS-PAGE电泳(12%分离胶、5%浓缩胶)，电泳结束后转膜，转膜结束后放入5%脱脂奶粉封闭1 h，敷一抗PCNA、Bax、Bcl-2于4 ℃冰箱过夜，次日敷二抗，室温1 h，用ECL发光液显色并曝光照相，结果用凝胶成像系统分析软件测灰度值。以GADPH作内参对各样本进行标准化定量，计算各组蛋白的表达水平以各样本与其内参灰度比值(相对灰度值)。

1.4.8  实时定量PCR检测PCNA、Bax及Bcl-2 mRNA表达  根据PCNA、Bax、Bcl-2和GADPH基因的序列，设计PCR引物，见表1。用不同质量浓度大蒜素(0，25，50，100 mg/L)处理成纤维细胞24 h后，使用Trizol试剂盒提取总RNA，并按照反转录试剂盒说明书合成cDNA。以反转录合成的cDNA为模板，GADPH为内参,进行实时定量PCR检测。体系参数如下：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次。每组实验重复3遍，用2^-∆∆Ct计算所得数据，得到PCNA、Bax和Bcl-2 mRNA的相对表达量。

1.5  主要观察指标  ①大蒜素干预后成纤维细胞增殖、细胞形态、细胞迁移、细胞周期分布、细胞凋亡情况；②大蒜素干预后成纤维细胞中PCNA、Bax和Bcl-2蛋白和基因的表达。

1.6  统计学分析  数据通过SPSS 19.0统计学软件分析处理后，数据以x(_)±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法，均以P < 0.05为差异有显著性意义。

纤维环、后纵韧带及腰骶区的过度纤维瘢痕形成，是椎板和椎间盘切除术后腰腿痛的主要原因^[23]。切口愈合过程包括局部炎性反应、成纤维细胞增殖分化和迁移、细胞外基质合成和组织重建^[2]。当前防治硬膜外瘢痕的方法包括非类固醇抗炎药、新兴生物材料和微创手术等，然而以上方法均为对症治疗，疗效欠佳且有明显的副反应，并没有从根本上解决成纤维细胞过度增殖问题^[12，24-25]。这促使人们探寻新的能抑制成纤维细胞过度增殖的方法，以预防硬膜外瘢痕过度增生。

大蒜素存在于无毒副作用的大蒜中，在捣碎大蒜时化合产生，在亚致死剂量以下，其具有广泛的促健康生物活性作用，且目前尚未报道关于大蒜素的任何毒副作用^[26]。研究表明，大蒜素不仅能抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡，抑制肺、肝脏和心肌过度纤维化^[20-22]，而且最近研究发现大蒜素能抑制人牙周膜成纤维细胞及心肌成纤维细胞增殖分化^[27-28]。然而目前关于大蒜素抑制硬膜外瘢痕的相关研究及临床应用较少，此次实验通过选择不同质量浓度的大蒜素对成纤维细胞增殖、迁移及凋亡的影响以及可能的作用机制，为大蒜素防治硬膜外瘢痕提供依据。

此次研究通过不同质量浓度大蒜素处理成纤维细胞后，结果发现成纤维细胞形态不规则，细胞活性及迁移能力降低，PCNA在蛋白及基因水平表达均下降，并呈药物浓度依赖性(P < 0.01)。PCNA是细胞核中DNA聚合酶的附属蛋白^[29]，其主要生物学作用是促进细胞核中DNA链的合成与延伸，促进细胞生长和增殖，因此是评价细胞增殖状态的可靠指标^[30]。而细胞增殖过程由细胞周期来完成，严格受细胞周期调控机制调控。S期检测点可检测DNA是否发生损伤及损伤的DNA分子是否得到修复，阻止DNA受损的细胞进行DNA合成，从而避免DNA得以复制传代；G₂期检测点可以防止受损和未复制的DNA进入有丝分裂，保证细胞完整、准确地复制^[31-32]。此次研究发现不同质量浓度大蒜素干预后，被阻滞在S期及G₂期的细胞比率增加，从而增加受损DNA的修复，减少染色体畸变，阻滞细胞有丝分裂，促使细胞凋亡，因此说明大蒜素能抑制成纤维细胞增殖及迁移。多项研究表明，大蒜素对瘢痕成纤维细胞及多种肿瘤细胞的增殖均有抑制作用^[33-34]，且呈药物浓度依赖性，此次研究中发现大蒜素抑制成纤维细胞增殖同样具有剂量依赖性，与前人的研究结果一致。

细胞凋亡是细胞生理性的自发死亡，受多个基因相互协调和制约。Bcl-2家族是发现较早的抗凋亡基因之一，主要分布于核膜、线粒体膜和内质网膜上，维持膜的完整性，并抑制细胞凋亡^[35-36]。与其作用相反的促凋亡蛋白Bax则主要位于细胞质中，当细胞受到凋亡刺激时，Bax发生构象变化，移位并插入线粒体外膜后形成Bax大孔道，破坏线粒体膜的完整性，改变线粒体渗透性，释放细胞色素C，激活促凋亡蛋白而发挥促细胞凋亡作用^[37-38]。近年研究发现, Bax/Bcl-2蛋白比值增高是促进细胞凋亡的重要原因之一^[39-40]。此次研究发现不同质量浓度大蒜素干预后，Bcl-2在蛋白及基因水平表达下调，Bax表达上调，Bax/Bcl-2比例增加，且在一定范围内呈剂量依赖性，因此说明大蒜素通过调控Bax及Bcl-2表达诱导成纤维细胞凋亡。

综上所述，大蒜素可能通过下调成纤维细胞PCNA及Bcl-2表达，上调Bax表达，发挥抑制成纤维细胞增殖、迁移及诱导其凋亡的作用。因此，大蒜素在预防硬膜外瘢痕过度增生方向有潜在应用价值，但是其潜在分子生物学机制尚不完全明确，其给药方式、剂量及是否有显著副反应等尚需大量动物实验探索。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

大蒜素：是从葱科葱属植物大蒜的鳞茎(大蒜头)中提取的一种有机硫化合物，也存在于洋葱和其他葱科植物中。学名二烯丙基硫代亚磺酸酯。

成纤维细胞：是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分为成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。

大蒜素：是从葱科葱属植物大蒜的鳞茎(大蒜头)中提取的一种有机硫化合物，也存在于洋葱和其他葱科植物中。学名二烯丙基硫代亚磺酸酯。

成纤维细胞：是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分为成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质嗜弱碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。

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