1.4.2  脊髓损伤动物模型制备  实验采用右侧脊髓半切模型^[12]。含体积分数1.5%异氟烷的氧气麻醉小鼠，取俯卧位固定在手术台上。以T₁₂段背部正中为中心消毒并做切口，长30 mm，切开皮肤下组织，沿椎体逐层暴露至椎板，在T₁₂段水平行椎板切除术后暴露脊髓，使用显微外科剪横断右侧脊髓，然后选用11号刀片划过脊髓切口确保右侧脊髓彻底离断，最后逐层缝合皮肤并消毒。以上操作均在体视显微镜下进行，假手术组只进行椎板切除术，不损伤脊髓(图1A，B)。

LI，YANG等^[5]探讨了雷公藤甲素(剂量为0.2 mg/kg)对大脑中动脉闭塞的神经保护作用，实验参照该剂量，雷公藤甲素组术后立即腹腔注射雷公藤甲素溶液[0.2 mg/(kg·d)]，二甲基亚砜及假手术组小鼠术后立即腹腔注射等量5%二甲基亚砜-生理盐水溶液，连续处理7 d；根据国家急性脊髓损伤研究(NASCIS)脊髓损伤后激素冲击治疗指南和以前报道的剂量给药，甲基强的松龙组小鼠在术后30 min，6 h和24 h腹腔注射甲基强的松龙(30 mg/kg)^[5，12]。术后每天膀胱按摩2次，直至小鼠自主排尿功能恢复，术后3 d给予青霉素100 U/(g·d)腹腔注射防止感染。除行为学检测的小鼠外，其余小鼠均在术后第7天取材，以损伤处为中心取直径约0.5 cm的脊髓组织用于后续实验(图1C)。

2.2  雷公藤甲素促进脊髓损伤后运动功能  采用Basso Mouse Scale(BMS)评分评估术后不同时间点(0，1，3，7，14，30和60d)各组小鼠脊髓损伤后的右后肢功能恢复情况(图2)。组内比较：假手术组小鼠在手术后显示正常功能(BMS评分为9)；二甲基亚砜组、甲基强的松龙组及雷公藤甲素组损伤后不同时间点BMS评分均明显降低，随着时间延长，BMS评分逐渐升高，组内不同时间点比较差异有显著性意义(P值均< 0.001)。组间比较：二甲基亚砜，雷公藤甲素和甲基强的松龙组中的小鼠术后1 d显示右下肢完全瘫痪(BMS评分为0)。术后第3天，甲基强的松龙组有少量小鼠能够进行轻微踝关节活动，但各组间BMS评分差异无显著性意义(P > 0.05)。术后第7，14，30和60天，甲基强的松龙和雷公藤甲素组的BMS评分显著高于二甲基亚砜组(P均< 0.05)，但甲基强的松龙组和雷公藤甲素组的小鼠之间评分差异无显著性意义(表1)。BMS评分结果提示,脊髓损伤后运动功能明显降低，肢体运动障碍明显；甲基强的松龙及雷公藤甲素治疗均有助于脊髓损伤后神经功能恢复。

2.2  雷公藤甲素促进脊髓损伤后运动功能  采用Basso Mouse Scale(BMS)评分评估术后不同时间点(0，1，3，7，14，30和60d)各组小鼠脊髓损伤后的右后肢功能恢复情况(图2)。组内比较：假手术组小鼠在手术后显示正常功能(BMS评分为9)；二甲基亚砜组、甲基强的松龙组及雷公藤甲素组损伤后不同时间点BMS评分均明显降低，随着时间延长，BMS评分逐渐升高，组内不同时间点比较差异有显著性意义(P值均< 0.001)。组间比较：二甲基亚砜，雷公藤甲素和甲基强的松龙组中的小鼠术后1 d显示右下肢完全瘫痪(BMS评分为0)。术后第3天，甲基强的松龙组有少量小鼠能够进行轻微踝关节活动，但各组间BMS评分差异无显著性意义(P > 0.05)。术后第7，14，30和60天，甲基强的松龙和雷公藤甲素组的BMS评分显著高于二甲基亚砜组(P均< 0.05)，但甲基强的松龙组和雷公藤甲素组的小鼠之间评分差异无显著性意义(表1)。BMS评分结果提示,脊髓损伤后运动功能明显降低，肢体运动障碍明显；甲基强的松龙及雷公藤甲素治疗均有助于脊髓损伤后神经功能恢复。

2.3  雷公藤甲素促进脊髓损伤后组织恢复  苏木精-伊红染色和Nissl染色用于检测脊髓损伤后第7天各组间组织恢复情况。苏木精-伊红染色显示：与假手术组相比，雷公藤甲素、甲基强的松龙和二甲基亚砜组小鼠脊髓组织结构紊乱；与二甲基亚砜组相比，甲基强的松龙组和雷公藤甲素组损伤脊髓组织区域结构改善。Nissl染色显示：与假手术组相比，脊髓半切后小鼠脊髓前角运动神经元数量明显减少(P < 0.001)。此外，与二甲基亚砜组相比，甲基强的松龙和雷公藤甲素治疗组小鼠的神经元数量显着增加(P < 0.01)。见图3A，B。

2.4  雷公藤甲素促进脊髓损伤后自噬表达  为探究雷公藤甲素对脊髓损伤后自噬的影响，研究了自噬相关蛋白Beclin-1，LC3B和p62的表达。结果表明，雷公藤甲素和甲基强的松龙组的LC3B蛋白表达水平高于二甲基亚砜组(P < 0.01)，雷公藤甲素组的p62表达低于二甲基亚砜组(P < 0.01)；假手术组、二甲基亚砜组、雷公藤甲素组和甲基强的松龙组的Beclin-1表达水平差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4A，B。免疫荧光分析显示雷公藤甲素治疗组LC3B蛋白表达上调(P < 0.05)，该结果与免疫印迹实验结果一致，雷公藤甲素可能促进脊髓损伤后自噬表达，见图4C，D。

2.5  雷公藤甲素可降低脊髓损伤后细胞凋亡  与假手术组相比，二甲基亚砜组凋亡相关蛋白Bcl-2，caspase-3和Bax的表达增加。雷公藤甲素和甲基强的松龙治疗显着抑制Bax和caspase-3表达增加，同时促进脊髓损伤诱导的Bcl-2表达(P < 0.05)，见图5A，B。在脊髓切片中进行caspase-3的免疫荧光染色，结果显示雷公藤甲素和甲基强的松龙组的caspase-3表达低于二甲基亚砜组(P < 0.05)，见图5C，D。雷公藤甲素可能降低脊髓损伤后细胞凋亡。

脊髓损伤是由于外伤、炎症、肿瘤等原因引起脊髓破坏而导致运动、感觉、括约肌和自主神经功能障碍的神经系统疾病，是临床常见损伤性疾病^[1]，因缺乏有效的治疗方式，病死率及致残率高。引起继发性损伤的主要原因包括局部缺血、兴奋毒性及氧化应激等，有研究表明脊髓损伤后大量神经细胞发生凋亡，因此明确减轻继发性损伤的有效疗法可以显着改善脊髓损伤后的恢复^[2]。

自噬是一种细胞的自我保护机制，通过自噬体-溶酶体途径降解和再循环受损细胞器、有毒物质、错误折叠蛋白质等，在维持细胞稳态方面具有重要作用。在脊髓的继发性损害过程中，细胞自噬是重要环节，越来越多的研究发现自噬与脊髓损伤后的恢复密切相关，但至今尚未得到明确的结论^[3-4]。

雷公藤甲素从传统中药雷公藤中提取，具有抗炎、神经保护、抗肿瘤等药理作用。在脑卒中大鼠模型中，雷公藤甲素治疗减少了缺血性病变区域面积、水含量和神经细胞死亡^[5]。此外，雷公藤甲素通过抑制星形胶质细胞增生、小胶质细胞活化和抑制炎症反应促进脊髓损伤修复^[6]。甲基强的松龙是一种有争议的急性脊髓损伤药物。高剂量甲基强的松龙可能增加伤口感染、败血症、肺栓塞、胃肠道出血和死亡的风险^[7]。尽管高剂量甲基强的松龙的治疗仍存在争议，但许多与脊髓损伤相关的试验表明甲基强的松龙具有神经保护作用^[8-9]。实验是在甲基强的松龙具有神经保护作用的相关研究基础上，探究雷公藤甲素与甲基强的松龙相比促进脊髓损伤恢复的疗效。

雷公藤甲素通过调节自噬促进脊髓损伤恢复的相关研究尚未见报道。大剂量甲基强的松龙在大量脊髓损伤试验中显示出神经保护作用，在此用于评价雷公藤甲素的治疗效果^[9-11]。此次研究检测了雷公藤甲素对Thy-YFP转基因小鼠脊髓损伤后运动功能恢复的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  细胞学实验观察。

1.2  时间及地点  实验于2018年4月至2019年4月在浙江大学完成。

1.3  材料

1.3.1  动物  8-10周雌性Thy-YFP转基因小鼠60只，体质量(20±2)g鼠由浙江大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(浙)2018-0006。Thy-YFP转基因小运动神经元及感觉神经元高度表达黄色荧光。动物伦理获得河北北方学院批准(W20200002)。

1.3.2  试剂、药品及仪器设备  雷公藤甲素、甲基强的松龙(上海阿拉丁生物化学技术公司)，二甲基亚砜(Sigma公司)；抗体：GAPDH、LC3B、Beclin-1及caspase -3(Cell Signal Technology)，p62(NOVUS)，Bax(BOSTER)，Bcl-2(Abcam)，Dylight 649山羊抗兔IgG抗体(Earthox)，山羊抗兔/抗小鼠IgG抗体(宝科)；BCA试剂盒及RIPA裂解液(艾佳生物科技股份有限公司)；蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(ROCHE公司)；化学发光成像仪及电泳仪(伯乐生命医学产品有限公司)，水平高速离心机(赛默飞世尔科技中国有限公司)，体视显微镜(美佳朗)，共聚焦显微镜(日本尼康)，NanoZoomer显微镜；ImageJ Pro PLUS 图像分析软件(美国Meyer Instruments 公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  实验动物分组  将60只小鼠随机分成4组：假手术组、二甲基亚砜组、甲基强的松龙组和雷公藤甲素组。每组15只小鼠，各组中随机选取6只用于行为学检测，3只进行组织学染色，3只进行免疫荧光分析，3只进行Western blot分析。

1.4.2  脊髓损伤动物模型制备  实验采用右侧脊髓半切模型^[12]。含体积分数1.5%异氟烷的氧气麻醉小鼠，取俯卧位固定在手术台上。以T₁₂段背部正中为中心消毒并做切口，长30 mm，切开皮肤下组织，沿椎体逐层暴露至椎板，在T₁₂段水平行椎板切除术后暴露脊髓，使用显微外科剪横断右侧脊髓，然后选用11号刀片划过脊髓切口确保右侧脊髓彻底离断，最后逐层缝合皮肤并消毒。以上操作均在体视显微镜下进行，假手术组只进行椎板切除术，不损伤脊髓(图1A，B)。

LI，YANG等^[5]探讨了雷公藤甲素(剂量为0.2 mg/kg)对大脑中动脉闭塞的神经保护作用，实验参照该剂量，雷公藤甲素组术后立即腹腔注射雷公藤甲素溶液[0.2 mg/(kg·d)]，二甲基亚砜及假手术组小鼠术后立即腹腔注射等量5%二甲基亚砜-生理盐水溶液，连续处理7 d；根据国家急性脊髓损伤研究(NASCIS)脊髓损伤后激素冲击治疗指南和以前报道的剂量给药，甲基强的松龙组小鼠在术后30 min，6 h和24 h腹腔注射甲基强的松龙(30 mg/kg)^[5，12]。术后每天膀胱按摩2次，直至小鼠自主排尿功能恢复，术后3 d给予青霉素100 U/(g·d)腹腔注射防止感染。除行为学检测的小鼠外，其余小鼠均在术后第7天取材，以损伤处为中心取直径约0.5 cm的脊髓组织用于后续实验(图1C)。

1.4.3  行为学检测  分别于术后第0，1，3，7，14，30和60天，将各组小鼠放置于空旷平面，采用Basso Mouse Scale(BMS)评分评估脊髓损伤后小鼠右侧后肢运动功能的恢复情况^[13]。无踝关节运动、后肢完全瘫痪为0分；轻微踝关节运动为1分；轻微躯干不稳定为8分和无运动功能障碍得分9分。所有实验均以双盲方式进行。

1.4.4  蛋白质提取和Western blot检测  术后第7天取材。注射体积分数5%水合氯醛溶液麻醉小鼠(20 μL/g)，用手术剪及镊子快速剥取小鼠脊髓，取材范围如图1所示。高压灭菌研砵、研锤及镊子等实验用器具并干燥。将新鲜小鼠脊髓放入研砵，按照500 μL RIPA/0.05 g脑组织的剂量加入约   500 μL裂解液(含1%蛋白酶抑制剂、1%磷酸酶抑制剂)，加入少量液氮，充分研磨至无大块颗粒，转入1.5 mL离心管，4 ℃ 12 000 r/min离心30 min, 取上清至新的1.5 mL离心管。使用BCA试剂盒定量蛋白质浓度。取新的1.5 mL离心管，将各组蛋白浓度稀释为2 g/L，然后按照比例加入蛋白上样缓冲液(5×SDS Loading Buffer)，充分混匀，100 ℃水浴加热10 min使蛋白变性，短暂离心后-20 ℃保存。实验采用一步制胶法(购自弗德生物)配置。在15%SDS-PAGE凝胶上电泳，电压为200 V，电泳时间为70 min。将转膜槽放置在冰盒中，并倒入预冷的转移缓冲液，将蛋白转移至PVDF膜，转膜为恒流300 mA，时间为70 min。

然后用5%脱脂奶粉封闭膜3 h。孵育一抗，4 ℃摇床孵育过夜。次日回收一抗，并用TBST清洗条带4次，每次5 min。孵育二抗(山羊抗兔/抗小鼠IgG抗体，1∶5 000)，室温摇床孵育2.5 h。二抗孵育结束后，用TBST洗条带4次，每次5 min。膜表面滴加超敏ECL(Electro-Chemi- Luminescence)反应液后用Bio-Rad化学发光成像仪采集图像，并用Image-Lab软件分析图片。抗体：GAPDH(1∶1 000)；LC3B(1∶1 000)、p62(1∶1 000)、Beclin-1(1∶1 000)、caspase 3(1∶1 000)、Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶1 000)、山羊抗兔/抗小鼠IgG抗体(1∶5 000)。自噬相关蛋白LC3II/LC3I可表示自噬泡数目，Beclin-1表达与自噬体活性相关，LC3B表达水平降低同时p62升高通常被认为是自噬活性受到抑制。Caspase 3、Bax表达升高，Bcl-2表达降低通常被认为是凋亡激活。

1.4.5  免疫荧光检测LC3B及caspase-3  小鼠麻醉后心脏灌注生理盐水直至流出液澄清，然后用40 g/L多聚甲醛进行灌注直至小鼠颈部强直、四肢及尾部僵硬。取材后浸泡于40 g/L多聚甲醛，48 h后于浸泡于30%蔗糖溶液直至悬浮的组织沉底。脊髓组织用OTC包埋后，脊髓取冠状面切片，厚度为15 μm。冰冻切片在37 ℃烘箱中加热1 h，在破膜液中孵育20 min，继而用5%BCA封闭1.5 h，然后滴加一抗(LC3B /caspase-3 Rabbit mAb，1∶500)以及二抗(Dylight 649山羊抗兔IgG，1∶500)孵育。最后用含DAPI染液的封片剂封固，并通过尼康共聚焦显微镜观察脊髓前角区域。通过Image Pro PLUS软件分析荧光表达情况。

1.4.6  组织学染色  术后7 d，腹腔注射体积分数5%水合氯醛(20 μL/g)过量麻醉小鼠，心脏灌注后取材，40 g/L多聚甲醛固定24 h后石蜡包埋。每个蜡块标本从损伤中心向头端、尾端方向分别各自连续切片6张，厚度为7 μm。每个标本蜡块共计切取12张，每2张连续的切片定为一组,共计12组；每组第1张为尼氏染色，第2张苏木精-伊红染色。

(1)尼氏染色：石蜡切片去石蜡化和再水合后，用0.1%甲酚紫溶液中染色。切片在蒸馏水中洗涤后浸入体积分数95%乙醇中30 s，在无水乙醇，无水乙醇，二甲苯和二甲苯中各5 min。最后用中性树脂封闭并在NanoZoomer显微镜下观察脊髓前角运动神经元。Image Pro PLUS软件计数两侧脊髓前角运动神经元数目。

(2)苏木精-伊红染色：石蜡切片去石蜡化和再水合后，用苏木精溶液染色6 min，然后浸入1%酸性乙醇(1%HCl的体积分数70%乙醇溶液)中几秒钟，继而在水中漂洗   10 min。将切片用伊红溶液染色5 min，梯度脱水后二甲苯透明。最后用中性树脂封闭并在NanoZoomer显微镜下观察脊髓前角区域。

1.5  主要观察指标  ①各组小鼠脊髓损伤后运动功能；②小鼠脊髓组织学观察；③免疫印迹及免疫荧光检测LC3B、p62、Beclin-1、Bcl-2、caspase-3、Bax的表达。

1.6  统计学分析  使用SPSS进行统计分析。数据表示为 x(_)±sx(_)。组间差异比较采用Fisher’s LSD单因素方差分析，  P < 0.05表示差异有显著性意义。

总之，实验发现雷公藤甲素能通过上调自噬、抑制凋亡进而促进脊髓损伤后运动功能恢复。在今后的研究中，打算探讨雷公藤甲素治疗在不同术后时期的时间效应，也将利用Thy-YFP转基因小鼠自带黄色荧光的优势尝试使用活体成像技术来可视化小鼠脊髓轴突。

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文题释义：

细胞自噬：自噬是一种细胞的自我保护机制，通过自噬体-溶酶体途径降解和再循环受损细胞器、有毒物质、错误折叠蛋白质等，在维持细胞稳态方面具有重要作用

转基因小鼠：1974年，Rudolf Jaenisch通过将SV40 病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中，创造了第一只携带外源基因的小鼠。后来又有研究人员把Murine leukemia病毒注射到小鼠胚胎得到了能通过生殖系统稳定遗传的小鼠，并且外源基因能在后代中稳定表达。这些能稳定遗传且表达外源基因的小鼠即现在一般意义上所说的转基因小鼠。

脊髓损伤是脊髓被破坏而导致运动、感觉、括约肌和自主神经功能障碍的神经系统疾病，至今仍无法治愈，脊髓损伤的机制研究已成为脊柱外科和神经学科等领域的热点和难点。

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