2.1   白蛋白和白藜芦醇对HK-2细胞活力的影响   相比于正常对照组，白蛋白处理24 h，可抑制HK-2细胞的活力，白蛋白质量浓度为10 g/L时，细胞活力下降不显著，白蛋白质量浓度为20，40 g/L时，细胞活力显著下降(P < 0.01)，见图1。

预先1 h加入不同浓度的白藜芦醇处理，可上调白蛋白(20 g/L)诱导的细胞活力下降，白藜芦醇浓度为10 μmol/L时，作用不显著，而白藜芦醇浓度为50 μmol/L和100 μmol/L时，作用显著(P < 0.01)，见图2。因此，后续实验中，白蛋白质量浓度选择20 g/L，白藜芦醇浓度选择50 μmol/L。



2.2   白藜芦醇对白蛋白诱导的HK-2细胞中SIRT1蛋白表达的影响   在白蛋白处理前分别应用SIRT1抑制剂EX527及其激活剂白藜芦醇进行预处理，与空白对照组相比，白蛋白组SIRT1蛋白水平显著降低(P < 0.01)，而用白藜芦醇处理后，SIRT1蛋白水平显著升高(P < 0.01)，用SIRT1特异性抑制剂处理后则显著下降(P < 0.01)，见图3。



2.3   白藜芦醇对白蛋白诱导的HK-2细胞中NLRP3炎性小体蛋白表达的影响    与空白对照组相比，白蛋白组的NLRP3、ASC和cleaved caspase-1 蛋白水平显著升高(P < 0.01)。与白蛋白组相比，白蛋白+白藜芦醇组NLRP3蛋白水平显著降低(P < 0.05)，白蛋白+SIRT1抑制剂组NLRP3蛋白水平显著升高(P < 0.01)；ASC和cleaved caspase1蛋白水平表达变化与NLRP3一致，见图4。

进一步对HK-2细胞进行免疫荧光双染，NLRP3蛋白标记为绿色，ASC蛋白标记为红色，DAPI标记细胞核显示蓝色，荧光显微镜观察结果见图5。与免疫印迹法结果一致，免疫荧光结果分析表明，空白对照组HK-2细胞中只检测到微弱的NLRP3表达，而白蛋白组NLRP3高表达。空白对照组HK-2细胞中ASC和NLRP3弥漫分布于肾小管细胞质中，白蛋白组HK-2细胞形成ASC斑点，且细胞质中NLRP3和ASC斑点高度共定位，提示HK-2细胞中NLRP3募集ASC蛋白形成炎性小体。用白藜芦醇处理能够大幅度降低细胞质中ASC蛋白的表达及ASC斑点的形成。



2.4   白藜芦醇对白蛋白诱导的HK-2细胞焦亡的影响   用Hoechst 33342和PI进行双染后，荧光显微镜下观察，弱红色和弱蓝色荧光组合为正常细胞，弱红色和强蓝色荧光组合为凋亡细胞，强红色和强蓝色荧光组合则为焦亡或坏死细胞。由图6可见，空白对照组红色荧光强度较低，与空白对照组相比，白蛋白组红色荧光强度增加，而白蛋白+白藜芦醇组红色荧光强度则降低，表明白藜芦醇能够改善细胞膜的通透性，抑制细胞焦亡，用SIRT1抑制剂处理后，红色荧光大量进入细胞。



2.5   白藜芦醇降低HK-2炎性损伤细胞炎症因子水平   HK-2细胞上清中炎症因子白细胞介素1β和白细胞介素18水平呈现一致的变化。与空白对照组相比，白蛋白组白细胞介素1β和白细胞介素18水平显著上升(P < 0.01)，与白蛋白组相比，SIRT1激活剂白藜芦醇处理组的白细胞介素1β和白细胞介素18水平显著下降(P < 0.01)，白蛋白+SIRT1抑制剂组则没有显著变化，见表2。

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细胞焦亡是一种新发现的程序性细胞死亡类型，是由细菌、病原体或其内毒素激活的炎症形式，伴随着细胞肿胀、细胞膜孔形成、细胞膜破裂、细胞渗透性溶解、炎症小体激活以及细胞内容物和炎症递质的释放，出现强烈的炎症反应[1-2]。已发现2种途径引发细胞焦亡：caspase-1介导的炎性体途径和caspase-4/5/11介导的炎性体途径[3]，caspase-1依赖性细胞死亡是经典的细胞焦亡途径[4]。caspase-1是由NOD样受体家族3(NOD-like receptors，NLRP3)炎性小体所介导的。NLRP3炎性小体由感受器蛋白NLRP3、接头蛋白即凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和效应蛋白caspase-1组成[5]。典型的NLRP3炎性小体激活介导的细胞焦亡可促进多种肾脏疾病的生理病理发展[6]。最新研究表明，NLRP3介导的细胞焦亡在糖尿病肾病[7]、横纹肌溶解诱导的急性肾损伤[8]、缺血再灌注肾损伤以及急性肾损伤向慢性肾损伤转变等过程中都发挥关键作用[9-10]，为各种肾脏疾病的防治提供了新的靶点。

白藜芦醇作为沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuins，SIRT1)的天然激动剂[11]，是否可以通过激活SIRT1并靶向调节NLRP3炎性小体参与肾小管上皮细胞的炎症反应，尚缺乏系统研究，且白藜芦醇对肾脏的保护作用已逐渐在各种肾病模型中得到了验证，但白藜芦醇对蛋白尿负荷的肾小管上皮细胞焦亡及其炎性损伤的保护机制却鲜有研究。因此，基于前人研究[12-14]，建立模拟蛋白尿负荷的肾小管上皮细胞炎性损伤模型，探讨白藜芦醇对肾小管上皮细胞焦亡相关蛋白的影响及抗炎作用的机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   体外细胞干预实验，先通过MTT实验筛选出后续研究所需的白藜芦醇浓度，再通过形态学、Western blot和ELISA实验阐明其作用及机制，组间两两比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。
1.2   时间及地点   实验于2021年8-12月在河南师范大学省部共建细胞分化调控国家重点实验室完成。
1.3   材料   人近端肾小管上皮细胞株(HK-2细胞)购自北京亿鸣复兴生物科技有限公司；MEM(Gibco，11095-080)；胎牛血清(Gibco，10091-148)；0.25%Trypsin(Gibco，15050065)；MTT(Sigma)；白藜芦醇(MCE，HY-16561)；牛血清白蛋白(Sigma，A1933-5G)；Selisistat (EX527)(MCE，HY-15452)；白细胞介素1β ELISA试剂盒(Biofine)；白细胞介素18 ELISA试剂盒(Biofine)；Hoechst 33342/PI双染试剂盒(Solarbio，CA1120)。抗体及稀释浓度为：SIRT1兔多克隆抗体(Affinity，DF6033，1∶1 000)；NLRP3兔多克隆抗体(Affinity，DF7438，1∶1 000)；ASC鼠多克隆抗体(Santa，sc-51441，1∶500)；GAPDH兔多克隆抗体(杭州贤至生物有限公司，AB-P-R001，1∶1 000)；caspase-1兔单克隆抗体(Affinity，AF5418，1∶1000)；NF-κB p65兔多克隆抗体(Abcam，ab16502，1∶1 000)；荧光(Cy3)标记羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司，BA1031，1∶100)；荧光(FITC)标记羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司，BA1102，1∶100)；显影定影试剂盒(天津市汉中摄影材料厂)。
1.4   实验方法   
1.4.1   细胞处理   将HK-2细胞从液氮中取出后迅速放入37 ℃恒温水浴锅，完全溶解后转移细胞至含5 mL MEM培养基的离心管中，室温1 000 r/min离心3 min，弃上清，收集细胞；用含体积分数10%胎牛血清的MEM培养基悬浮细胞，接种到培养皿中，轻轻吹打混匀，并于37 ℃和体积分数5%CO2饱和湿度条件下培养；当HK-2细胞密度达到80%时，对细胞进行传代：弃去培养基，PBS洗1遍；用1 mL 0.25%胰酶消化细胞，显微镜下观察可看到细胞相互分离变圆，即消化完成，加入2.0-3.0 mL MEM完全培养基，轻轻吹打细胞制成单细胞悬液，然后按1∶3的比例传代，在37 ℃和体积分数5% CO2饱和湿度条件下扩大培养，见表1。 

1.4.2   实验分组和处理   ①对照组：按常规细胞培养条件培养HK-2细胞；②白蛋白组：用不同质量浓度(10，20，40 g/L)白蛋白处理HK-2细胞24 h；③白蛋白+白藜芦醇组：不同浓度白藜芦醇(10，50，100 μmol/L)提前1 h加入HK-2细胞进行预处理后，加入20 g/L白蛋白继续处理24 h；④白蛋白+SIRT1抑制剂组：提前1 h加入10 μmol/L的SIRT1抑制剂EX527进行预处理后，再用20 g/L白蛋白处理HK-2细胞24 h。
1.4.3   MTT法测定细胞活力   取处于对数生长期、生长状态良好的第3代HK-2细胞，用完全培养基调整细胞浓度为5×107 L-1，接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬液，设置空白组，在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS，37 ℃培养过夜；根据实验分组处理细胞，每组5个复孔，干预后每孔加入10 μL MTT，37 ℃培养4 h；吸出培养基，加入150 μL二甲基亚砜振荡10 min；酶标仪测定各孔568 nm处吸光度值，计算细胞活力=(实验组吸光度值-空白组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%。
1.4.4   Western blot检测SIRT1、NLRP3、ASC、caspase-1的蛋白表达   取处于对数生长期的第3代HK-2细胞，调整细胞浓度为5×107 L-1，接种于6孔板，每孔100 μL细胞悬液，按实验分组进行相应干预后，吸掉6孔细胞板培养上清，每孔加入1 mL预冷的PBS清洗细胞3次；RIPA裂解获得总蛋白，BSA法测定蛋白浓度，放入沸水中进行沸水浴10 min使蛋白变性，变性完后冷却至室温再放入-20 ℃保存。制备电泳胶，电泳分离，电转移，转膜条件：GAPDH(37 kD)，200 mA，90 min；NLRP3(118 kD)，200 mA，120 min再300 mA，30 min；SIRT1(82 kD)，200 mA，120 min再300 mA，15 min；ASC(24 kD)，200 mA，70 min；caspase-1(45 kD，20 kD)，200 mA，70 min。转膜完成后用含5%脱脂奶粉的封闭液浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h，用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜，TBST充分洗涤PVDF膜五六次，5 min/次，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗(1∶50 000)稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h；洗去多余二抗，显色曝光，晾干胶片，扫描胶片，用IPP分析胶片灰度值。
1.4.5   免疫荧光双染检测蛋白共定位   取处于对数生长期的第3代HK-2细胞，用胰酶消化后计数重悬于完全培养基中，将玻片放置于24孔板内，将计数好的HK-2细胞以5×103个/孔接种于24孔板内，根据实验分组处理细胞，在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min；用40 g/L多聚甲醛固定爬片15 min，PBS浸洗玻片3次，每次3 min；在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min，加一抗NLRP3(稀释比为1∶100)，放入4 ℃湿盒孵育过夜；PBST浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗(荧光FITC标记羊抗兔IgG，1∶100)，湿盒中37 ℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；重复上述操作，血清封闭，加一抗ASC(稀释比为1∶100)，加荧光二抗(荧光Cy3标记羊抗小鼠IgG，1∶100)；滴加 DAPI避光孵育5 min进行染核，PBST浸洗5 min，重复4次，洗去多余的DAPI；用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封固，然后在荧光显微镜下观察，采集图像。
1.4.6   Hochest33342/PI染色检测细胞焦亡   将已爬好细胞的玻片浸入用PBS配制的0.1% TritonX-100溶液中15 min(冰上操作)，随后用PBS洗涤2次，每次5 min；用细胞染色缓冲液按1∶100的比例稀释Hoechst和PI染色液。 每个玻片滴加50 μL稀释后的Hoechst与PI染色液，使其全部覆盖待检区域，4 ℃孵育20-30 min，PBS洗涤3次，每次3 min；用吸水纸擦干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封固，然后在荧光显微镜下观察，采集图像。
1.4.7   酶联免疫吸附法检测炎症因子水平   用无菌管收集各组细胞培养上清液，离心机3 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清。ELISA检测白细胞介素1β和白细胞介素18水平，严格按照试剂盒说明书进行。
1.5   主要观察指标   ①MTT法检测白蛋白和白藜芦醇对HK-2细胞活力的影响；②Western blot检测SIRT1、NLRP3、ASC和caspase-1在蛋白水平的表达；③免疫荧光双染观察NLRP3和ASC蛋白在肾小管的共定位；④Hoechst33342/PI染色法观察细胞焦亡情况；⑤ELISA检测细胞培养上清中炎症因子白细胞介素1β和白细胞介素18水平。
1.6   统计学分析   实验结果用x±s表示，使用SPSS 21.0统计软件进行分析，组间两两比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过河南师范大学生物统计学专家审核。

细胞焦亡是先天免疫的双刃剑，一方面，它有助于保护多细胞免受感染或损伤，另一方面，过度激活的焦亡进一步促进炎症发展。许多肾脏疾病的发生和进展都与细胞焦亡有关，最近的研究进一步明确了细胞焦亡以及相关炎症信号通路在多种肾脏疾病中的作用，包括急性肾损伤、糖尿病肾病、晶体诱导的肾病和肾移植损伤等[15]。根据相关研究报道，在对比剂引起的急性肾损伤和肾功能损害过程中肾小管上皮细胞存在焦亡[16]，提示肾小管细胞焦亡参与了肾脏损伤的发生和发展。在糖尿病患者和db/db小鼠中，肾小管损伤和肾小管上皮细胞焦亡伴随着NLRP3炎性小体和白细胞介素1β表达的增加；同时，在db/db小鼠中，肾小管上皮细胞中的 mtROS持续过量产生，并可能激活 ROS/TXNIP/NLRP3炎性体信号通路，表现为肾小管损伤和肾小管上皮细胞焦亡[17]。最近的研究表明，近端肾小管细胞的蛋白质超载可通过先天免疫激活促进间质损伤，但具体机制尚不明确[18]。蛋白尿是危害肾功能的独立危险因素，在蛋白尿导致肾损伤的发生发展过程中，促炎因子过度释放是否是导致肾小管损伤的关键因素，损伤发生过程中是否有细胞焦亡参与，尚缺乏系统研究。因此，该研究选择白蛋白诱导模拟体内蛋白尿环境，探究NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡在蛋白尿诱导肾小管上皮细胞炎症反应中的作用。在该研究中，将不同质量浓度的白蛋白在体外作用于HK-2细胞24 h，用MTT法检测HK-2细胞活力，结果表明白蛋白降低HK-2细胞活力，且呈现一定的浓度依赖性，在进一步的研究中用20 g/L白蛋白刺激HK-2细胞，结果表明促炎细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素18水平升高，说明白蛋白可以降低细胞活力并提高白细胞介素1β和白细胞介素18水平，可促进HK-2细胞的炎症级联反应。为进一步探究蛋白尿环境对肾小管上皮细胞的损伤作用机制，该研究检测了细胞焦亡情况，由于细胞焦亡和凋亡的相似性，如何在形态上区别二者有一定难度。有研究通过使用电子显微镜发现新的结构，称为“化脓性囊泡”结构[19]，
但在实质细胞中很难发现，更多的研究提出了通过使用AO/EB染色或Hoechst 33342/PI染色焦亡细胞。该研究使用Hochest33342/PI染色法观察了肾小管上皮细胞焦亡的变化，通过荧光显微镜发现有大量红色荧光进入白蛋白诱导的细胞中，表明肾小管细胞炎性损伤后出现典型的细胞焦亡特征。

典型的NLRP3炎性小体介导白细胞介素1β和白细胞介素18的成熟以及诱导细胞焦亡，活化的caspase-1提示存在细胞焦亡[20]。在没有外部刺激的情况下，炎性小体以非活性形式存在于细胞中，当细胞受到特定刺激时，NLRP3炎性小体就会被激活，活化caspase-1[21]，激活的caspase-1不仅调节促炎细胞因子白细胞介素1β、白细胞介素18的成熟和分泌，还介导细胞焦亡[22]，从而导致剧烈的促炎反应。该研究采用白蛋白诱导模拟蛋白尿环境，建立HK-2细胞损伤模型，以NLRP3炎性小体和炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素18为指标，采用体外培养方法，观察白蛋白负荷HK-2细胞中NLRP3炎性小体的变化，探究NLRP3炎性小体是否活化并参与白蛋白诱导的肾小管急性损伤。研究结果表明NLRP3炎性小体参与了白蛋白诱导的HK-2细胞炎性损伤，这由白蛋白处理组NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表达水平升高和肾小管上皮细胞中NLRP3和ASC共定位所证实。该研究结果与SHEN等[23]报道在HK-2细胞系中由对比剂诱导的急性肾损伤模型中NLRP3参与并加重损伤的结果一致。活化的caspase-1及白细胞介素1β、白细胞介素18的显著升高和细胞焦亡检测的联合应用，进一步证实了细胞焦亡参与损伤。总之，这些数据表明NLRP3炎性小体参与肾小管上皮细胞炎症反应，由NLRP3激活诱导的caspase-1依赖性细胞焦亡加重了损伤。

白藜芦醇是一种二苯乙烯类化合物，主要来源于葡萄和其他浆果的皮。大量研究证明了白藜芦醇在多种疾病模型中的生物活性潜力。最近的研究表明白藜芦醇是一种NLRP3炎性小体天然抑制剂[24]。白藜芦醇已显示出在不同种类肾小管上皮细胞病理模型中的作用，其对肾脏的保护机制多与SIRT1蛋白的激活有关。研究表明，白藜芦醇处理小鼠近端肾小管细胞可通过增加SIRT1蛋白的表达，最终减少顺铂诱导的损伤和细胞凋亡[25]。在XIAO等[26] 的研究中，白藜芦醇处理可增加HK-2细胞的SIRT1蛋白水平，减轻肾脏损伤和纤维化。在课题组前期研究中，白藜芦醇可激活SIRT1并减轻了力竭运动致大鼠肾脏的炎症反应[27]。然而白藜芦醇发挥肾脏保护作用的具体机制尚不明确，为研究白藜芦醇的保护机制，分别应用了SIRT1激活剂白藜芦醇和抑制剂EX527干预，给予白藜芦醇可使SIRT1的蛋白表达显著增加，炎症因子水平降低，加入SIRT1抑制剂EX527后，炎症因子白细胞介素1β、白细胞介素18水平显著增加，抵消了白藜芦醇激活SIRT1带来的有利作用，以上研究结果表明，白蛋白诱导的损伤HK-2细胞中，白藜芦醇可能通过SIRT1发挥抗炎作用。此外，给予白藜芦醇使HK-2细胞中SIRT1过表达后，NLRP3炎性小体蛋白表达显著降低，而使用SIRT1特异性抑制剂后，NLRP3炎性小体蛋白表达则显著升高，这与白藜芦醇在多项不同损伤模型中的调控机制是一致的，如LI等[28]报道SIRT1可以通过调节血管内皮细胞中的NLRP3炎性小体来抑制炎症反应。ZHANG等[29]揭示Arctigenin也可以通过SIRT1依赖性抑制NLRP3炎性小体来减轻缺血性卒中。TUFEKCI等[30]发现白藜芦醇通过 SIRT1通路抑制小胶质细胞中 NLRP3 炎症小体诱导的细胞焦亡。以上证据表明SIRT1可以通过影响NLRP3、ASC、caspase-1等细胞焦亡相关蛋白的表达，进而减轻肾小管上皮细胞炎症损伤。

综上，该研究揭示了NLRP3炎性小体激活及其引起的细胞焦亡在白蛋白诱导肾小管上皮细胞炎性损伤中发挥关键作用，白藜芦醇可能通过SIRT1途径抑制HK-2细胞焦亡相关蛋白的表达，从而改善白蛋白诱导的HK-2细胞炎性损伤。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
白蛋白：是血液中的正常蛋白质，在生理状态下，尿液中仅有极少量的白蛋白，在肾功能异常情况下，白蛋白异常渗漏导致尿液中白蛋白大量增加。白蛋白尿不仅仅是反映肾小球滤过改变的重要指标，还可能引起肾小管上皮细胞和间质的损伤，进而进一步引起肾功能的改变，是危害肾功能的独立危险因素。
细胞焦亡：又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。一方面，它有助于保护多细胞免受感染或损伤；另一方面，过度激活的焦亡进一步促进炎症发展。

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近年来大量数据表明细胞焦亡在肾脏疾病中发挥关键作用，NLRP3炎性小体激活是肾脏疾病细胞焦亡的重要触发因素。细胞焦亡过程中主要效应蛋白是具有膜成孔活性的gasdermin家族成员。因此，细胞焦亡也被称为gasdermin介导的程序性坏死，已被证明在各种肾脏疾病中发挥核心作用并具有作为治疗靶点的潜力。在基因和/或药理学上调节细胞焦亡相关蛋白可能为某些肾脏疾病提供潜在的治疗益处。然而，当前对肾脏疾病中的细胞焦亡理解仍然有限，目前已发表的关于肾脏疾病细胞焦亡的研究大多是基于数量有限的动物和细胞实验，需要更可靠的实验和临床试验来证实细胞焦亡在肾脏疾病中的作用。

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