2.1  实验动物数量分析  实验用新西兰兔33只，全部造模成功，中途无死亡，无丢失，均进入数据分析。

2.2  急性钝挫伤模型建立  骨骼肌急性钝挫伤后，各模型组动物均出现行动受限，1 min驱赶移动未超出1 m²，远低于正常组动物25 m²之活动区域。各造模组动物损伤部位均有发热淤青表现，伤后1 h损伤区域肿胀程度开始增大，12 h达到最大，72 h后恢复。预实验解剖结果显示，骨骼肌损伤较严重，但未出现骨折现象，证实造模成功率为100%。

2.3  苏木精-伊红染色结果  见图2。正常组肌纤维为多边形，形态较规则，排列紧密；肌细胞核均匀分布于肌膜下，没有增生以及核固缩，肌膜完整性较好，未见水肿、充血、炎性细胞浸润等病理性变化。骨骼肌损伤后1 d各干预组可见肌纤维水肿，细胞间隙充血严重，肌细胞形态表现为圆形、面积增大，并有少量炎性细胞浸润；骨骼肌损伤后3 d各干预组有大量炎症细胞浸润，血管周围肌纤维溶解并存，部分胞浆完全被巨噬细胞浸润，白藜芦醇组炎症细胞少于自然恢复组；骨骼肌损伤后7 d各干预组炎性细胞逐渐减少，肌间隙充血消失，肌纤维水肿减轻，白藜芦醇组恢复优于自然恢复组；骨骼肌损伤后21 d各干预组逐渐恢复，炎症细胞几乎消失，可见再生肌纤维，中心核，白藜芦醇组优于自然恢复组，但仍不如正常组。骨骼肌损伤后白藜芦醇组恢复整体优于自然恢复组。

2.4  Masson染色结果  见图3，4。正常组织含有少量胶原纤维，随着损伤时间的延长，胶原纤维含量逐渐增加，但在损伤21 d时胶原纤维含量略有下降；组间比较，白藜芦醇组较自然恢复组胶原纤维少，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明白藜芦醇在骨骼肌损伤后能抑制胶原蛋白形成，促进新生毛细血管及肉芽组织形成，从而促进骨骼肌损伤后愈合。

2.5  免疫组化染色结果  碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白阴性染色结果为胞浆或细胞膜不着色，弱阳性表现为细胞胞浆内颗粒较细小，颜色呈现为淡黄色，其显色高于背景色，阳性染色结果表现为细胞胞浆和胞膜着色，颜色为黄色或棕色以及棕黄色颗粒，强阳性表现为胞浆内阳性颗粒多，呈现棕色甚至为棕褐色，其显色明显高于背景色。

通过Image-ProPlus8.0图像分析系统对两组蛋白含量变化进行分析：①骨骼肌损伤后，自然恢复组、白藜芦醇组碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白含量整体呈现先升后降趋势，但21 d时碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白含量仍高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)；②白藜芦醇组和自然恢复组均于7 d达峰值，但白藜芦醇组峰值高于自然恢复组，白藜芦醇组整体优于自然恢复组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5-8。

2.6  Western blot检测结果  通过Image-J图像分析软件对碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白表达变化进行分析，结果显示：①骨骼肌损伤后，碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白浓度整体呈现先升后降趋势，差异有显著性意义(P < 0.05)；②损伤后1，3，7 d，白藜芦醇组碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白表达均高于正常组，差异有显著性意义(P < 0.05)，损伤后14 d白藜芦醇组碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白表达开始低于自然恢复组，差异有显著性意义(P < 0.05)，损伤后21 d，自然修复组碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达仍高于正常组和白藜芦醇组，差异有显著性意义(P < 0.05)；而白藜芦醇组与正常组类似，差异无显著性意义(P > 0.05)。自然恢复组胰岛素样生长因子1蛋白表达与白藜芦醇组相似，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图9-11。

骨骼肌是维持人体正常活动之重要器官，各种原因引起的骨骼肌损伤是临床常见疾患之一，严重影响患者的生活质量与工作^[1]。调查显示，10%-55%的钝挫伤与扭伤将形成慢性持久性损伤，给社会经济与医疗机构造成严重负担^[2]。骨骼肌愈合包括急性反应期、修复期和塑型期3个时期^[3-4]。骨骼肌损伤后在经历最初的炎症、坏死阶段后，肌组织的修复主要以肌细胞再生和瘢痕组织化修复2种方式进行，趋向何种方式取决于创面受损程度、骨骼肌再生能力、有无主动干预治疗等因素的综合作用^[5]。

骨骼肌损伤后其再生需多种细胞因子共同参与修复过程，其中以碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和胰岛素样生长因子1(insulinlike growth factor 1，IGF-1)最为重要。碱性成纤维细胞生长因子是调节细胞增长与分化的重要生长因子，骨骼肌生长、发育及成熟后的各阶段均有碱性成纤维细胞生长因子表达与分泌^[6-7]。在骨骼肌损伤后，碱性成纤维细胞生长因子可改善损伤周围环境并抑制纤维化，促进神经修复和毛细血管形成^[8]。胰岛素样生长因子1与骨骼肌合成代谢相关^[9-10]，骨骼肌损伤后胰岛素样生长因子1表达量显著增加。此外，研究表明外源性注射碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1均可促进骨骼肌愈合^[11]。

课题组在前期研究中发现骨骼肌损伤与碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1等因子变化有关。因此，作者推测上述因子在肌损伤中有异常表达，在后续研究工作中侧重于寻找改善局部微环境状态、促进新生毛细血管形成等相关药物。

白黎芦醇，别名3，4'，5-三羟基芪、虎杖甙元，是相关植物在受到病菌侵染或环境恶化时产生的植物抗毒素，主要存在于葡萄、虎杖、决明、花生、桑葚等植物^[12]，见图1。白藜芦醇在动物研究和临床应用中都是一个值得深究的领域^[13]。目前，白藜芦醇被证实具有抗动脉粥样硬化、预防冠心病、缺血性心脏病、高血脂症以及降低老人髋关节骨折的作用^[14-17]。研究发现补充白藜芦醇可抑制皮下组织、脏器周围、器官内部的纤维化进程，减轻组织纤维化引起的损伤性变化，其作用机制与减轻胶原硬蛋白沉积、维护局部细胞结构与功能的稳定有关^[18-19]，另有研究表明，白藜芦醇通过上调胰岛素样生长因子1表达，促进生长代谢^[20]。

目前，碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1存在价格昂贵、半衰期短等缺点，难以规模化应用于临床。依据既往实验研究，推测白藜芦醇能减少组织感染和坏死范围，促进局部血液循环和胶原纤维排列，利于骨骼肌损伤后修复。为证实这一假说，该研究拟复制兔骨骼肌钝挫伤模型，在此基础之上给予白藜芦醇干预治疗，使用分子生物学、免疫组化等技术，从动物整体-分子层面观察白藜芦醇对肌组织损伤重构的影响，从新视角阐明骨骼肌损伤发生机制，并为其防治提供新思路，以及阐述白藜芦醇在骨骼肌损伤修复过程中的药物效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2018年8月至2019年3月在昆明医科大学科研实验楼二栋完成。

1.3  材料 

1.3.1  实验动物  普通级健康成年雄性新西兰兔33只，体质量2.5-3.0 kg，由昆明医科大学实验动物学部提供，分笼喂以普通饲料，自由进食、饮水，室温饲养，湿度(50±5)%，每日自然光照。该实验符合实验动物伦理委员会相关规定。

1.3.2  实验试剂和仪器  白藜芦醇(西安天本生物科技有限公司，纯度≥98%)；3%戊巴比妥钠(昆明医科大学动物实验中心)；兔抗碱性成纤维细胞生长因子多克隆抗体(北京Bioss公司)；鼠抗胰岛素样生长因子1单克隆抗体(Cell Signaling Technology)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物分组  33只新西兰兔被随机分为正常组(n=3)、自然恢复组(n=15)、白藜芦醇组(n=15)。

1.4.2  骨骼肌损伤模型建立及白藜芦醇干预治疗  3%戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉麻醉动物，待麻醉生效后，将自然恢复组和白藜芦醇组新西兰兔采用侧卧位姿势(右侧在上)固定于造模台，右后肢于伸膝、踝背屈约90°状态，小腿部剃毛，取医用纱布垫于目标肌肉群下起缓冲作用，以避免铁质平台接触到动物皮肤，暴露腓肠肌，在腓肠肌距跟骨后缘   8 cm左右做为打击部位并标记，将腓肠肌置于自制重力致伤机下，打击锤重0.4 kg，底面圆形，直径3.0 cm，自由落体高度为50 cm，在不移动位置的情况下，连续打击4次。打击后，用25 g/L安尔碘溶液处理创面，1次/d，并保持创面干燥避免感染。经预实验证实其力度可致骨骼肌中度(2度)损伤，即绝大部分肌纤维损伤，肌肉力量明显下降。

白藜芦醇用0.5%羧甲基纤维素溶解，白藜芦醇质量浓度为15 g/L，配置好的白藜芦醇溶液置于4 ℃冰箱保存，建立骨骼肌急性钝挫伤模型后，白藜芦醇组每天给予白藜芦醇灌胃直至21 d，剂量为15 mg/kg，自然恢复组灌胃等体积生理盐水。

1.4.3  取材  自然恢复组和白藜芦醇组于损伤后1，3，7，14，21 d各选出3只实验动物耳缘静脉注射过量麻药致死(戊巴比妥钠100 mg/kg)，然后在腓肠肌损伤局部取材，用剃毛刀去除腿毛，并用手术刀划开皮肤，暴露出筋膜并分离腓肠肌，采用双面刀片切取腓肠肌肌腹损伤较为严重区域，将其平分为6份，4份用生理盐水冲洗干净后置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，其余2份标本即刻放于冻存管中，于液氮中保存。正常组在第7天进行取材，具体方法如上。

1.5  主要观察指标

1.5.1  苏木精-伊红染色观察炎症细胞浸润情况  将组织从40 g/L多聚甲醛中取出，切成合适大小，放入一次性包埋盒，做好标记，流水冲洗12 h，然后放入自动脱水机中程序脱水、脱蜡，然后包埋制成蜡块，切片厚5 μm，常规脱蜡、至水染色、盐酸乙醇分化、透明剂透明、吹干后中性树胶封固，光学显微镜下观察其正常形态及病理学改变。

1.5.2  Masson染色观察胶原纤维形成情况  取5 μm厚组织切片，脱蜡至水，使用Masson染色试剂盒进行染色：用配置好的Weigert苏木精液染核7 min；酸性乙醇分化液分化10 s，水洗；Masson蓝化液蓝化4 min，水洗；蒸馏水洗3次，每次1 min；丽春红品红染液染色8 min；弱酸工作液染1 min；磷钼酸溶液洗2 min；弱酸工作液洗1 min；苯胺蓝染色液染色1 min；弱酸工作液洗1 min；体积分数为95%乙醇快速脱水；无水乙醇脱水3次，每次7 s；透明剂透明10 min；中性树胶封固。用图像分析软件Image-ProPlus6.0分析计算其胶原容积分数，胶原容积分数=同一视野中的胶原面积/所测视野面积。

1.5.3  免疫组化染色观察碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白的表达  蜡块制成5 μm切片，甲苯脱蜡，乙醇脱水，体积分数为3%H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活性10 min，将组织玻片置于枸橼酸盐缓冲液(pH值6.0)中于高压锅内修复，并放置室温待其冷却，冷却后用5%BSA孵育30 min，一抗于湿盒内4 ℃孵育过夜(兔抗碱性成纤维细胞生长因子多克隆抗体1∶500；鼠抗胰岛素样生长因子1单克隆抗体1∶1 000)，二抗IgG室温孵育  90 min；PBS冲洗；DAB显色；苏木精复染、脱水、透明、封固，显微镜下观察并拍摄，Image-Pro Plus 8.0图像分析软件进行图像分析处理。

1.5.4  Western blot检测碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白的表达  将组织从液氮中取出，常温解冻，选取适量组织超声破碎提取蛋白，利用分光光度计测蛋白浓度；清洗玻璃板，制12%分离胶、4%压缩胶，根据蛋白浓度计算上样量，电泳，转膜，剪膜和漂洗，封闭，一抗4 ℃过夜(兔抗碱性成纤维细胞生长因子多克隆抗体1∶1 000；鼠抗胰岛素样生长因子1单克隆抗体1∶2 000)，敷二抗，化学发光、显影、定影，运用Image-J图像分析软件进行图像分析。

1.6  统计学分析  使用SPSS 23.0软件对资料进行统计分析，首先对多组数据采用Shapiro-Wilk检验以及Levene检验判断其是否为正态、方差齐否，该实验数据为正态分布且方差齐，组间比较用单因素ANOVA分析，进一步通过Tukey HSD法进行两两比较，检验水准为α= 0.05(双侧)。

骨骼肌损伤是常见的运动性损伤^[21]，其修复主要以肌细胞再生和瘢痕组织化修复2种方式进行，趋向何种方式取决于创面受损程度、骨骼肌再生能力、有无主动干预治疗等因素的综合作用^[22]，近年来研究包括针刺疗  法^[23]、中草药疗法^[24]、干细胞疗法以及各种生长因子疗法等^[25-26]。

在前期研究中发现骨骼肌损伤后肌组织出现炎症反应、瘢痕修复明显，而这些变化与碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1等因子的波动变化有关。因此，作者推测上述因子在肌损伤中有异常表达，在后续研究工作中侧重于找寻改善局部微环境状态、防治瘢痕过度增生的相关药物。近年来国内外对白黎芦醇抑制机体组织纤维化方面的作用进行大量相关性研究，但对其在肌组织损伤修复方面的研究却鲜有报道。

碱性成纤维细胞生长因子主要通过促进细胞分裂、增殖，参与损伤区域局部炎性反应、修复期肉芽组织形成^[27]、组织重建等来促进损伤组织的再生和修复、细胞增殖、血液循环、预防胶原蛋白沉积等作用^[28]，通过调控细胞生长，改善其微环境，从而促进组织的再生与修复^[29]。胰岛素样生长因子1作为一种重要的生长因子，其广泛存在于机体的多种组织内，胰岛素样生长因子1表达增加可促进蛋白质合成，并有效减少骨骼肌纤维化、瘢痕组织形成，参与损伤后骨骼肌组织的再生与修复。研究表明：安静状态下骨骼肌中胰岛素样生长因子1表达量较低，损伤后胰岛素样生长因子1表达量显著增加，且具规律性^[20-31]。

从该实验整体来看，骨骼肌损伤后实验动物活动受限，3 d后略恢复正常。苏木精-伊红染色结果显示骨骼肌损伤或即刻出现出血水肿，损伤1 d时出血最为严重并伴有炎症细胞浸润，3 d时炎症细胞浸润最为明显，7 d时相对3 d时较少。Masson染色结果显示，损伤后14 d胶原纤维含量达峰值，白藜芦醇组低于自然恢复组。研究表明，骨骼肌损伤修复过程中，适量胶原纤维沉积利于缩小创面形成初步纤维连接，增加伤口抗拉伸力以及连接伤口两端肌纤维，促进组织愈合^[32]。若胞外大量胶原沉积，则肌纤维再生会被抑制，形成机械屏障延迟，阻碍其连接及创口愈合，并增加患肢二次损伤概率，加重肌肉萎缩和痉挛^[33]。

Western blot及免疫组化结果显示，碱性成纤维细胞生长因子在正常肌组织表达量极少，一旦骨骼肌损伤，其表达量显著增加，并于损伤后7 d左右达峰值，随着损伤情况的相对好转，其蛋白表达量逐渐减少。损伤早期白藜芦醇组碱性成纤维细胞生长因子表达量较自然恢复组高，而中后期则相对较低，说明白藜芦醇组恢复情况优于自然恢复组，表明白藜芦醇通过干预碱性成纤维细胞生长因子的表达，从而有效预防骨骼肌细胞变性、坏死，并提高受损部位局部血供，从而促进损伤局部肌组织修复、新生血管形成。胰岛素样生长因子1蛋白为胞浆表达，其结果类似于碱性成纤维细胞生长因子蛋白，从整体来看，给予白藜芦醇治疗后胰岛素样生长因子1表达量在前7 d相对高于自然恢复组，随着损伤情况的相对好转，白藜芦醇组较自然恢复组下降快，且差异有显著性意义，表明白藜芦醇可通过干预胰岛素样生长因子1蛋白的表达，从而促进骨骼肌损伤后神经、血管再生，进而促进损伤后骨骼肌修复。

骨骼肌损伤与修复在特殊染色方面应用较少，实验用Masson染色分析其胶原纤维含量占总面积百分比，因染色和软件分析方面不够熟练可能会存在少许误差。碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白表达水平并非于损伤最严重的第3天及胶原纤维高表达的第14天达高峰，而是于第7天达高峰，说明碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1主要是通过促进新生毛细血管形成、细胞增殖等促进骨骼肌损伤后修复，白藜芦醇能抑制骨骼肌损伤后纤维化程度可能与其他因子有关。由于实验动物为新西兰兔，考虑到动物伦理及费用问题，每组每次取材仅有3只，因此可能会因为实验样本量太小而造成误差。白藜芦醇对骨骼肌损伤修复作用的研究还比较少，白藜芦醇又有明显的浓度和时间依赖性，因此白藜芦醇最佳的作用浓度和作用时间还需要进一步实验探索。增生性瘢痕组织虽是最常见的病理性瘢痕之一，但其发生机制不完全清楚，因此白藜芦醇对骨骼肌损伤修复更深层次的作用机制也有待更多研究去揭示。综合来看，白藜芦醇可以说是一种比较高效、安全的促骨骼肌损伤修复药物，有望未来在临床上造福更多患者。

结论：①碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白在骨骼肌修复过程中呈现先升高后降低的变化规律，与骨骼肌修复的一般规律相类似；②碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白表达量变化与新生毛细血管出现有关，新生毛细血管出现较多时，碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白含量也到达最大值；③白藜芦醇通过上调碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1蛋白表达水平来促进骨骼肌损伤后修复，但其并不改变骨骼肌损伤修复过程中蛋白表达量的整体变化规律。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

白藜芦醇：非黄酮类的多酚化合物，分子式为C₁₄H₁₂O₃，相对分子质量228.25，为白色针状晶体，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸、乙酯等有机溶剂。别名：3，4'，5-三羟基芪、虎杖甙元，是相关植物在受到病菌侵染或环境恶化时产生的植物抗毒素，主要存在于葡萄、虎杖、决明、花生、桑葚等植物中。

骨骼肌急性钝挫伤：钝挫伤指在钝器作用下，造成以皮内或皮下及软组织出血为主要改变的闭合性损伤。骨骼肌急性钝挫伤指钝器在短时间内伤到肌肉层造成皮下及软组织出血，肌肉没有断裂或者撕裂的闭合性损伤。临床上90%的骨骼肌损伤属于钝挫伤与扭伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

近年来国内外对白黎芦醇抑制机体组织纤维化方面的作用进行大量相关性研究，但对其在肌组织损伤修复方面的研究却鲜有报道。该实验前期研究发现骨骼肌损伤修复与移植部位微环境适时状态有关；白藜芦醇能减少组织感染和坏死范围，促进局部血液循环，胶原纤维排列规整。为证实此假说，该研究复制兔骨骼肌钝挫伤模型，在此基础之上采用白藜芦醇干预治疗方案，使用分子生物学、免疫组化等技术，从动物整体-蛋白水平2个层次，观察白藜芦醇对肌组织损伤重构的影响及相关因子作用，从新视角阐明骨骼肌损伤发生机制，并为其防治提供新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程