2.1  大负荷离心运动后骨骼肌超微结构的变化  实验使用透射电镜观察到一次大负荷离心运动后不同时刻骨骼肌超微结构的变化，见图1：安静对照组超微结构整齐，Z线(白色箭头)均匀地分布于肌纤维两侧，线粒体有序地定位于Z线两侧；在500倍视野内可见，运动后即刻部分位置肌节变宽，Z线断裂，肌原纤维断裂、扭曲；运动后3 h同运动后即刻的表现，部分位置Z线模糊；运动后6 h可见肌节大面积紊乱，Z线呈水波状、断裂；运动后12 h，整个500倍视野均出现骨骼肌超微结构的紊乱，肌原纤维间隙增加，肌丝相互缠绕，Z线消失，很难看清整齐的肌原纤维和肌节；运动后24 h情况有所好转，紊乱的面积减少，但Z线仍然模糊不清，肌原纤维弯曲，不规律排列，间隙依然比较大；运动后48 h超微结构基本恢复，能看到新生成的肌纤维插入到原来的肌节中；运动后72 h，骨骼肌超微结构紊乱完全恢复。



2.2  运动诱导损伤骨骼肌中聚集体的生成情况  免疫印迹结果显示，大负荷诱导骨骼肌损伤后蛋白聚集体总体呈先升高后降低的趋势，见图2。泛素的分子质量为16 kD，安静对照组和运动后72 h组条带仅16 kD位置出现蛋白印迹。运动后即刻除了泛素本身分子质量位置，蛋白印迹出现新的2条，分别在150 kD和37 kD左右。运动后3 h，90 kD左右位置多了一条印迹，而运动后12 h，印迹几乎分布于整个条带，之后的时间点印迹减少，运动后72 h完全恢复。

2.3  运动诱导损伤骨骼肌中结蛋白聚集体生成  实验使用免疫荧光共定位的方法计算结蛋白聚集体量。结蛋白(绿色荧光)和聚集体(红色荧光)双染骨骼肌组织切片，黄色和橘色荧光表示结蛋白聚集体，黄色和橘色荧光面积表示结蛋白聚集体发生程度，见图3。

统计结果显示方差不齐(P < 0.05)，采用Tamhane’s T2法比较不同时间点结蛋白聚集体的变化差异，发现大负荷运动后不同时刻骨骼肌结蛋白聚集体总体上呈现先升高后降低的趋势，见图4。安静对照组结蛋白聚集阳性面积平均为7.34 μm²，表明几乎没有结蛋白聚集体存在。除运动后72 h组，其他运动时刻结蛋白聚集阳性面积均高于安静对照组30倍以上(P < 0.01)，运动后12 h达到峰值，是安静对照组的103倍(P < 0.01)。运动后即刻结蛋白聚集体显著升高(P < 0.01)，运动后3 h继续升高，相比运动后即刻不显著；运动后6 h较运动后即刻显著降低47.3%(P < 0.05)，运动后12 h后结蛋白聚集体显著升高，48 h显著低于运动后即刻(P < 0.05)，72 h恢复到安静对照组水平。

运动诱导骨骼肌损伤会引起延迟性肌肉酸痛和最大自主收缩肌力下降^[1-4]，直接影响运动训练和运动成绩^[5]，还可能加剧运动损伤风险^[6]。因此，了解运动诱导骨骼肌损伤的机制在运动科学领域具有重要意义。结构蛋白和收缩蛋白降解是运动诱导骨骼肌损伤发生的重要原因^[7-12]，其中结蛋白是维持肌原纤维Z线稳定和骨骼肌正常结构的重要蛋白^[13-15]。近几年的研究发现一次47 min的亚最大强度运动3 h后，易发生肌横纹溶解的阿拉伯马骨骼肌出现结蛋白聚集^[16]，患有外周动脉疾病患者的腓肠肌活检中也出现结蛋白聚集现象^[17]，提示剧烈运动、缺氧可能会引起骨骼肌结蛋白聚集体生成增加。以往运动诱导骨骼肌损伤后结蛋白变化情况的研究结果有所不同，徐玉明^[11]使用免疫印记方法检测发现，一次大负荷离心运动后calpain引起结蛋白降解；而袁建琴^[10]发现运动后骨骼肌出现微损伤，此时结蛋白的免疫组织化学测试结果则有增加的趋势。目前来看，研究结果不同很可能是由于大负荷运动后结蛋白聚集体生成导致的。由于蛋白聚集体是蛋白未折叠或错误折叠，形成大分子量的蛋白低聚复合物^[18]，不能采用普通免疫印迹法检测出来。因此作者提出假设：运动诱导骨骼肌超微结构损伤时会伴随着结蛋白聚集体的增加。实验首先通过透射电镜检验骨骼肌微结构判断损伤模型成功与否，第二步通过检测骨骼肌难溶蛋白中泛素蛋白的分布，了解损伤的骨骼肌中所有蛋白聚集体的发生情况^[19]；最后检测稳定Z线的蛋白-结蛋白在骨骼肌微损伤不同恢复时刻聚集体的变化情况，探讨和完善运动诱导骨骼肌微损伤机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年4至11月在北京体育大学动物房和运动人体科学学院骨骼肌实验室完成。

1.3  材料

实验动物：64只SPF级雄性健康SD大鼠，8周龄，体质量(219.62±9.23)g，购于北京维通利华实验技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。饲养和训练地点为北京体育大学科研中心实验动物房，分笼饲养，每笼4只，自由进食和饮水，室内温度26 ℃，相对湿度40%-70%，12 h日夜交替。适应性喂养3 d后，将64只成年雄性SD大鼠随机分为安静对照组(n=8)和运动组(n=56)，运动组又按运动后时相分为0，3，6，12，24，48，72 h组，每组8只。实验获得北京体育大学运动科学实验伦理委员会批准(2016030A)。

实验用主要试剂：RIPA裂解液(P0013B，碧云天)；SDS强裂解液(P0013G，碧云天)；BCA蛋白定量试剂盒(23225，Thermo Fisher)；Anti-Ubiquitin抗体(ab7254，Abcam)；Anti-Desmin抗体(ab152000，Abcam)；Anti-GADPH抗体(TA08，中杉金桥)；ProteoStat蛋白聚集体检测试剂盒(ProteoStat^® aggresome detaction kit，Enzo life science)。

1.4  实验方法

1.4.2  样本收集  在运动后相对应的时间点麻醉大鼠(10%水合氯醛。3.5 mL/kg)，腹主动脉取血，之后迅速分离比目鱼肌，用刀片去除两侧肌腱及多余的脂肪和筋膜，过程中避免拉扯肌肉。将肌腹肌肉切成1 mm³的立方体，放入2.5%戊二醛中4 ℃固定，待测骨骼肌超微结构；另切3 mm×3 mm×5 mm的肌腹肌肉，包埋在OCT中，-80 ℃保存，待测结蛋白聚集体的荧光积分吸光度值；剩余肌腹肌肉放入液氮迅速降温，之后保存于-80 ℃冰箱。

1.4.3  透视电镜检测骨骼肌超微结构  取出固定在戊二醛中的肌肉，用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗，再用1%锇酸固定，在用0.1 mol/L的磷酸缓冲液冲洗后乙醇脱水(梯度为50%，70%，90%，100%)。接着用环氧树脂包埋，切片，用醋酸双氧轴、柠檬酸铅将制作好的切片双染色，待样品干燥后置于透射电镜下观察骨骼肌超微结构，并拍片。每一张组织切片，先在低倍视野下确定观察整体结构变化，后在高倍视野下观察其超微结构。

1.4.4  激光共聚焦显微镜检测结蛋白聚集体  ProteoStat^® dry(红色)是一种特异性检测聚集物(体)的染料，已被证实能反映哺乳动物和植物细胞中聚集体和包涵体^[23-24]。将包埋于OCT中的肌肉冰冻切片(8 μm)，复温20 min后，固定在40 g/L多聚甲醛中30 min；之后用1×PBS摇床洗3次；0.5%TritonX-100，3 mmol/L EDTA的PBS透化30 min；PBS洗3次；体积分数5%山羊血清室温封闭30 min；加入稀释的结蛋白一抗(1∶500)过夜；第2天用PBS洗3次；稀释的ProteoStat染料(1∶2 000)和荧光二抗(1∶200)，室温染色30 min，封固，用激光共聚焦显微镜拍片。使用Image- Pro Plus V ersion 6.0 (IPP6.0)软件分析荧光共定位的面积值并进行统计分析。

1.4.5  免疫印迹法检测骨骼肌中蛋白质聚集情况  将肌肉复温，剪下需要质量的肌肉，剪碎、匀浆。按照说明书要求裂解匀浆后的肌肉组织，分离出上清液，使用10 mmol/L Tris-HCl和1%SDS将沉淀再次重悬，冰上静置30 min，每  10 min涡旋振动一次，4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清液待测难溶蛋白。用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，根据蛋白浓度使用上样缓冲液和裂解液将所有样本调至统一浓度，煮蛋白5 min使其固定。配置12%浓度的分离胶和5%浓度的浓缩胶，以每孔50 μg上样，电泳条件为：浓缩胶80 V恒压电50 min，分离胶120 V恒压电25 min。电转条件为：300 mA恒流电，60 min。5%BSA-TBST封闭PVDF膜上非特异性结合位点，并用5%BSA-TBST稀释一抗泛素(1∶2 000，过夜)和二抗(1∶2 000，90 min)。之后显影、定影、曝光蛋白条带。使用Image Lab软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参，结果用“目的蛋白/内参”与对照组的比值表示。

1.5  主要观察指标  各组肌肉损伤程度及肌肉泛素蛋白与蛋白聚集体的表达。

1.6  统计学分析  采用单因素方差分析(One-way ANOVA)评价各定量指标在各组中的变化情况。若方差齐，用LSD法；若方差不齐，用Tamhane’s T2法。所有数据以x(_)±s表示，差异有显著性意义水平为P < 0.05，差异有非常显著性意义水平为P < 0.01。数据分析软件为SPSS 22.0。

骨骼肌损伤和恢复机制一直以来都是运动科学研究的热点问题之一。无论是普通人还是运动员，进行了一次不适应的运动(包括运动方式或强度)后都会导致骨骼肌纤维超微结构的损伤，称之运动诱导骨骼肌损伤^[25]，外在表现为延迟性肌肉酸痛和肌力下降^[26]，给人们的正常生活带来诸多不 便^[27]，更影响了运动员的正常训练^[28-29]，易发生运动损伤。前期研究证实发生运动诱导损伤的骨骼肌中，收缩蛋白α-actin^[7]、肌节内骨架蛋白肌联蛋白、伴肌动蛋白和肌节外骨架蛋白抗肌营养不良蛋白、结蛋白表达一过性降低^[9，11]，认为蛋白降解是运动诱导骨骼肌损伤的原因。此次实验结果显示，在运动诱导骨骼肌损伤发生和恢复的整个过程中出现蛋白聚集体一过性增高的现象，说明运动诱导骨骼肌损伤伴随着骨骼肌蛋白，尤其是结蛋白的聚集现象，并且随着聚集体的降解，运动后72 h骨骼肌能够恢复到未损伤状态。

一次大负荷的离心运动已被证实能够建立运动诱导骨骼肌损伤模型^[20，30-31]。与以往的研究结果一致^[29，31-34]，此次实验中大鼠比目鱼肌超微结构在一次大负荷离心运动后即刻出现局部紊乱，肌节变宽，Z线断裂，呈水波状；随时间的推移，微细结构损伤面积扩大，运动后12 h最为严重，肌原纤维间隙增加，肌丝相互缠绕，Z线流失，很难看清整齐的肌原纤维和肌节；之后逐渐恢复，72 h完全恢复。Z线流失和结蛋白的降解是目前诊断运动诱导骨骼肌损伤的金标准。电镜结果显示运动诱导骨骼肌损伤造模成功，随着运动后休息时间的推移，骨骼肌超微结构一过性损伤。

丁海丽等^[22]的研究中发现，大强度运动或超过习惯负荷的运动应激会引起骨骼肌内质网应激，骨骼肌内质网应激会引起内质网腔内未折叠、错误折叠的蛋白蓄积^[35-36]。错误折叠的蛋白质把本该包裹在内部的疏水残基暴露在蛋白结构表面，易于与其他蛋白相互作用聚集在一起形成难溶难降解的大分子蛋白聚集体^[37]。聚集的蛋白会被泛素标记，形成多聚泛素链发生级联反应对其降解。此次实验用Western Blot方法分析整个条带上泛素的分布情况，来确定运动后不同恢复时间点上聚集体的产生状况^[19，38-39]，结果发现：安静状态下的泛素在整个条带上只有1条，出现在16 kD左右的位置，说明此时表达的泛素均为正常而未结合目标聚集物的泛素，证明安静状态下没有聚集物的生成。运动后即刻泛素分散在不同分子质量的位置，说明在运动后即刻骨骼肌细胞中就开始出现蛋白聚集现象。运动后  12 h，泛素的分散分子质量达到峰值，72 h恢复到安静时水平，这与电镜下超微结构的组织学变化时相保持一致，说明运动诱导骨骼肌损伤后骨骼肌超微结构紊乱伴随着蛋白聚集现象的发生。此次实验首次发现在运动诱导骨骼肌损伤模型中，蛋白聚集体表达量随时间变化趋势与骨骼肌超微结构改变高度一致，提示运动诱导骨骼肌损伤的发生伴随着蛋白质聚集物的发生，蛋白质聚集物的产生很可能是运动诱导骨骼肌损伤的发生机制之一。

结蛋白作为骨骼肌肌节外骨架蛋白，连接相邻肌原纤维Z线和肌纤维膜，是维持Z线稳定的重要蛋白^[40]，同时也是易发生聚集的蛋白^{[16-17，41-42]}。此次实验比较了安静状态下和发生运动诱导骨骼肌损伤后不同恢复时刻肌细胞中结蛋白聚集体的发生面积，结果显示发生运动诱导骨骼肌损伤后结蛋白聚集体一过性的增加，在运动后3 h和12 h出现2个峰值，72 h恢复。此变化趋势基本上与蛋白聚集体和超微结构损伤恢复的趋势一致，说明运动诱导骨骼肌损伤伴随着结蛋白聚集体的生成，结蛋白作为维持Z线和骨骼肌正常结构的重要蛋白，形成聚集体很可能是导致运动诱导骨骼肌损伤的主要原因之一，但是还需进一步实验证明。此次实验证实了运动诱导骨骼肌损伤的骨骼肌中存在蛋白聚集现象，且结蛋白是易聚集的蛋白之一，同时在一定程度上解释了前期研究的矛盾，使用Western Blot检测结蛋白表达在运动诱导骨骼肌损伤后降低^[11]，而免疫组织化学观察结果显示结蛋白有不降反升的趋势^[10]。原因是结蛋白结构损伤，使之形成了大分子聚集体，分子质量的改变导致Western Blot在原有的分子质量位置检测不到结蛋白，而免疫组织化学的检测原理是通过特异性抗体与蛋白特殊位点结合，所以能够检测出大分子结蛋白。此次实验结果完善了运动诱导骨骼肌微损伤的机制，为下一步如何进行有效干预提供了崭新的思路。

实验证实了运动诱导骨骼肌损伤发生诱导骨骼肌蛋白聚集，并证明了聚集蛋白中包括结蛋白，完善了运动诱导骨骼肌损伤的蛋白降解理论。

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文题释义：
蛋白聚物：在某些生理或是病理生理情况下，蛋白质折叠异常，暴露出本应包裹在蛋白中心的疏水核团，暴露在外的疏水核团之间容易相互吸引，形成的大分子、具有细胞毒性的蛋白聚集物。
蛋白聚集体：蛋白聚集物被泛素标记，并通过组蛋白去乙酰化酶6经微管dynein蛋白运输至微管组织中心，被波形蛋白和角蛋白构成的笼状结构包裹，形成蛋白聚集体。蛋白聚集体的形成是对细胞的保护，一方面隔离储存了毒性的蛋白聚集物，以免攻击其他细胞器；另一方面是自噬降解的前提步骤，有助于毒性蛋白的降解。

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蛋白降解学说是运动性骨骼肌损伤的经典原因之一，以往的研究侧重于哪些蛋白降解及通过何种途径降解。此次实验以蛋白质结构破坏的角度为切入点，假设运动后为未折叠和错误折叠蛋白一过性增加，泛素蛋白酶体途径超负荷工作，导致错误折叠蛋白聚集，并以损伤的标志性蛋白结蛋白为例，检测了结蛋白聚集的发生。实验首次证实了发生运动诱导骨骼肌损伤的肌肉中存在蛋白聚集现象，丰富和完善了蛋白降解理论，为今后预防和缓解运动诱导骨骼肌损伤，治疗延迟性肌肉酸痛提供了新的方向。