同种异体脂肪干细胞移植促进大鼠骨骼肌功能的恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1722

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
骨骼肌损伤的干细胞修复：胚胎的肌肉发育过程中，成肌细胞首先分化成一定数量的肌肉前体细胞，然后分化并融合形成多核肌肉细胞。附着于肌细胞表面的肌卫星细胞具有干细胞性质，当肌细胞受损后，肌卫星细胞可增殖分化，参与肌细胞结构和功能的修复。肌卫星细胞功能衰竭可导致肌肉损伤后修复迟缓或恢复失败，在老年人和进行性肌肉疾病患者中，这种退变问题越来越突出。最新研究进展阐明了干细胞的肌源性分化和影响骨骼肌损伤修复的可能分子机制，为骨骼肌损伤的干细胞治疗带来希望。
骨骼肌组织工程与再生：为解决骨骼肌不可逆损伤的临床问题，肌肉组织工程和再生的新策略和新技术已被深入研究。研究证实，使用组织再生的方法形成骨骼肌组织，植入后可增强体内剩余肌组织的新肌纤维形成。

摘要
背景：超过骨骼肌自我再生能力的广泛损伤可导致不可逆的纤维化、瘢痕形成和功能丧失。以往研究证实，脂肪来源干细胞可用于各种肌组织的再生，其对骨骼肌急性损伤后功能恢复的影响鲜有报道。
目的：观察同种异体脂肪干细胞移植对骨骼肌急性损伤大鼠骨骼肌再生与功能恢复的作用。
方法：从10只SD大鼠皮下脂肪组织中分离脂肪间充质干细胞，进行流式细胞术鉴定和多向分化能力鉴定。将72只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、胶原蛋白组和脂肪间充质干细胞移植组，后3组建立腓肠肌急性钝挫伤模型，胶原蛋白组分5个注射点在腓肠肌肌腹注射共1 mL大鼠胶原蛋白Ⅰ，脂肪干细胞移植组分5个注射点在腓肠肌肌腹注射含1×10⁶个脂肪干细胞的1 mL大鼠胶原蛋白Ⅰ。移植后7，14，28 d，苏木精-伊红染色观察腓肠肌结构并测量腓肠肌纤维横截面积；用张力传感器测量腓肠肌等长收缩肌力；称量腓肠肌湿质量并计算其与体质量比值；Western blot检测腓肠肌组织中Pax7、MyoG、MyoD的表达。
结果与结论：①大鼠脂肪干细胞表达CD29和CD90，不表达CD31和CD34，具有成脂、成骨和成软骨分化能力；②在移植后28 d，脂肪干细胞移植组大鼠腓肠肌损伤部位可观察到新生的骨骼肌纤维，4组大鼠腓肠肌损伤部位均未观察到明显的纤维增生；③在移植后28 d，脂肪干细胞组腓肠肌湿质量及其与体质量比值均高于模型组和胶原蛋白组(P < 0.01)，脂肪干细胞移植组腓肠肌中肌纤维横截面积大于模型组和胶原蛋白组(P < 0.01)；④移植后7，14，28 d，模型组、胶原蛋白组、脂肪干细胞移植组腓肠肌等长收缩肌力均低于正常对照组(P < 0.01)，移植后28 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌等长收缩肌力高于模型组和胶原蛋白组(P < 0.01)；⑤移植后14 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中Pax7和MyoD的表达高于模型组和胶原蛋白组(P < 0.05)，移植后28 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中MyoD和MyoG的表达高于模型组和胶原蛋白组(P < 0.05)；⑥结果表明，脂肪干细胞移植到急性受损骨骼肌中能促进肌纤维的再生和功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2926-0645(何理)

关键词: 急性骨骼肌损伤, 脂肪间充质干细胞, 细胞移植, 肌纤维再生, 腓肠肌, 同种异体移植, 骨骼肌细胞, ；成肌细胞

Abstract:

BACKGROUND: An extensive damage beyond the ability of skeletal muscle to regenerate itself can lead to irreversible fibrosis, scarring and dysfunction. Previous studies have shown that adipose-derived mesenchymal stem cells can be used for the regeneration of various muscle tissues. The effect of stem cells on functional recovery after acute skeletal muscle injury has rarely been reported.
OBJECTIVE: To study the effect of allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation on skeletal muscle regeneration and functional recovery in rats with acute skeletal muscle injury.
METHODS: Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from subcutaneous adipose tissues of 10 Sprague-Dawley rats and identified by flow cytometry for multidirectional differentiation. Seventy-two Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group, model group, collagen group and adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation group. A rat model of acute blunt injury of the gastrocnemius muscle was established in the latter three groups. Then, 1 mL of type collagen I alone or containing 1×10⁶ adipose-derived mesenchymal stem cells was injected into the gastrocnemius muscle in the collagen and adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation groups, respectively, and there were five injection sites per rat. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the structure of gastrocnemius muscle and measure the cross-sectional area of gastrocnemius muscle fiber 7, 14 and 28 days after transplantation. The isometric contraction force of gastrocnemius muscle was measured. The wet weight of gastrocnemius muscle was measured and the ratio of wet weight to body weight was calculated. The expressions of Pax7, MyoG and MyoD in gastrocnemius muscle tissue were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Isolated rat adipose-derived mesenchymal stem cells were positive for CD29 and CD90, and negative for CD31 and CD34. These cells had the ability of adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis. Neonatal skeletal muscle fibers were observed in the injured site of the gastrocnemius muscles at 28 days after adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation, and no fibrogenesis was observed in the gastrocnemius muscles of the four groups. At 28 days after transplantation, the wet weight of gastrocnemius muscle and its ratio to body weight in the adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation group were higher than those in the model group and collagen group (P < 0.01), and the cross-sectional area of muscle fibers in the gastrocnemius muscle in adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation group was larger than that in the model group and collagen group (P < 0.05). At 7, 14, and 28 days after transplantation, the isometric contractile muscle strength of the gastrocnemius muscle in the model group, collagen group and adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation group were lower than that in the normal control group (P < 0.01). At 28 days after transplantation, the isometric contractile muscle strength of the gastrocnemius muscle in the adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation group was higher than that in the model group and collagen group (P < 0.01). The expressions of Pax7 and MyoD in the gastrocnemius muscle of adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation group were higher than those of the model group and collagen group at 14 days after transplantation (P < 0.05). The expressions of MyoD and MyoG in the gastrocnemius muscle of adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation group was higher than that of model group and collagen group at 28 days after transplantation (P < 0.05). To conclude, adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation for acute skeletal muscle injury can promote the regeneration of muscle fibers and functional recovery.

Key words: acute skeletal muscle injury, adipose-derived mesenchymal stem cells, cell transplantation, muscle fiber regeneration, gastrocnemius, allogeneic transplantation, skeletal muscle cells, myoblasts

中图分类号:

何理，郑小莉. 同种异体脂肪干细胞移植促进大鼠骨骼肌功能的恢复[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(17): 2739-2745.

He Li, Zheng Xiaoli. Transplantation of allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells promotes the recovery of skeletal muscle function[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(17): 2739-2745.

图/表（结果） 2

2.1 SD大鼠脂肪干细胞的鉴定结果 传代至第3代的脂肪干细胞形态均一，呈梭形或多角形，见图1A；流式细胞术检测结果显示，第3代大鼠脂肪干细胞表达间充质干细胞的表面标志物CD29和CD90，阳性率为96.4%和99.5%，不表达血管内皮细胞表面标志物CD31和造血干细胞标志物CD34，见图1B；油红O染色结果显示，脂肪干细胞胞质内有淡红色脂滴，大小不一，见图1C；阿利新蓝染色结果显示，细胞间可见浅蓝色块状组织，结构较致密，见图1D；茜素红S染色结果显示，细胞间可见暗红色结节，见图1E。上述结果提示，分离获得了脂肪干细胞。

2.2 实验大鼠数量分析 共使用72只SD大鼠进行体内实验，其中正常对照组18只，54只用于造模和移植，整个实验过程顺利，72只大鼠的实验结果计入数据分析。

2.3 脂肪干细胞移植对骨骼肌纤维再生的影响 为了观察新生肌纤维出现的时间将观察时间点设定为7，14，28 d，由于骨骼肌组织修复时间较长，在移植后7，14 d没有观察到组织学结构变化，只有28 d后才出现差异，故实验对28 d观察结果进行描述。组织学观察结果显示，移植后28 d，正常对照组骨骼肌纤维排列整齐，结构正常，见图2A；模型组局部骨骼肌纤维排列紊乱，肌纤维间距离增大，见图2B；胶原蛋白组肌组织结果与模型组相似，见图2C；脂肪干细胞移植组大鼠腓肠肌损伤部位周围出现散在分布的新生骨骼肌纤维，新生的骨骼肌纤维直径小于原有骨骼肌纤维，且肌纤维直径大小不等，细胞核位于细胞中央，见图2D；4组大鼠腓肠肌损伤部位均未观察到明显的纤维增生。为了进一步证实肌纤维的再生，测量了腓肠肌的湿质量及其与体质量的比值，见图2E，F。在移植后28 d，脂肪干细胞移植组、模型组和胶原蛋白组大鼠腓肠肌湿质量及其与体质量比值均低于正常对照组(P < 0.01)，脂肪干细胞移植组腓肠肌湿质量及其与体质量比值则高于模型组和胶原蛋白组(P < 0.01)；移植后28 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌中肌纤维横截面积大于模型组和胶原蛋白组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2G。上述结果一致说明脂肪干细胞移植可促进骨骼肌纤维的再生，但不能明确新生骨骼肌纤维来源于移植的干细胞。

2.4 脂肪干细胞移植对骨骼肌收缩力的影响 移植后7，14，28 d，模型组、胶原蛋白组、脂肪干细胞移植组腓肠肌等长收缩肌力均低于正常对照组(P < 0.01)；移植后28 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌等长收缩肌力高于模型组和胶原蛋白组(P < 0.01)，提示脂肪干细胞移植可改善骨骼肌的收缩力，见图3。

2.5 脂肪干细胞移植影响肌纤维的再生修复的时期 为了深入研究移植的脂肪干细胞是否在肌纤维再生的不同阶段均发挥作用，进行Western blot半定量检测。移植后14 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中Pax7和MyoD的表达高于模型组、胶原蛋白组和正常对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；移植后28 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中MyoD和MyoG的表达高于模型组、胶原蛋白组和正常对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。以上结果提示，脂肪干细胞移植通过影响肌纤维的早期与晚期再生发挥修复作用。

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引言

骨骼肌是人体内最丰富的可再生组织，主要由多核肌纤维组成，通过收缩和舒张发挥作用^[1]。遗传、代谢和神经肌肉疾病等因素均可引起骨骼肌功能受损^[2]。骨骼肌功能的维持取决于肌纤维再生能力的保持，而肌纤维的再生能力易受到各种物理和生化因素的影响，从而造成骨骼肌结构与功能的损伤^[3]。肌卫星细胞具有干细胞性质，当肌细胞受损后，肌卫星细胞可增殖分化，参与肌细胞结构和功能的修复^[4-6]，但这种再生机制仅对较轻微的损伤有效，在较大损伤时，肌组织的丢失可能超过其再生能力，导致肌肉功能发生不可逆损伤^[7]。虽然临床上有可供选择的手术治疗方案，但在重大损伤的情况下，治疗结果并不尽如人意。

鉴于肌卫星细胞通过再生肌纤维发挥维持骨骼肌完整性的关键作用，这些细胞曾作为种子细胞在肌肉损伤无法自我修复的情况下用于治疗^[8]。以往的基础研究和临床试验，通过植入水平和再生效果来评价肌卫星细胞疗法对肌肉再生的作用，发现人类骨骼肌组织对移植细胞的接受能力有限，而且用于移植的细胞来源也直接影响移植效果^[9]。随后的研究发现，大多数骨骼肌细胞治疗试验都采用体外扩增的成肌细胞，而不是纯化的肌卫星细胞，移植效果不良可能与成肌细胞的高度分化状态有关，分化细胞越多，移植后的细胞再生能力越低^[10]。而且，肌卫星细胞的来源有限。因此，寻找分化程度低、来源丰富的细胞作为移植种子细胞有望提高移植治疗效果。

为了克服无法获得足够数量低免疫原性供体细胞的问题，多项研究试图从多种干细胞中获得可用于移植的骨骼肌前体细胞，取得了较大进展^[11]。脂肪来源干细胞因其易获得性成为近年来备受关注的干细胞^[12]。脂肪干细胞具有间充质干细胞的特性，可以通过抽脂从皮下脂肪组织中大量分离，生物学特性与骨髓间充质干细胞相似，具有广泛的可塑性和分化潜能^[13]。此外，脂肪组织具有比骨髓更高的干细胞密度。已有研究报道了脂肪干细胞在体外和体内的肌源性分化，但关于修复后肌组织的功能评价较少^[14]。此外，研究还证实，脂肪干细胞可通过分泌促进细胞存活的可溶性因子以旁分泌的形式促进组织再生^[15]。因此，该实验通过建立腓肠肌急性钝挫伤大鼠模型，移植同种异体脂肪干细胞进行骨骼肌组织再生治疗，评估脂肪干细胞在骨骼肌功能恢复中的治疗潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年6月至2018年6月在西南医科大学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂和仪器 大鼠脂肪干细胞完全培养基(中国，卫凯公司)；成脂诱导分化培养基、成软骨诱导分化培养基、成骨诱导分化培养基(中国，赛业公司)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国，Hyclone公司)；胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶(美国，Sigma公司)；大鼠胶原蛋白Ⅰ(美国，Corning公司)；改良Krebs-Henseleit溶液(中国，极威公司)；兔抗大鼠CD29、CD31、CD34、CD90抗体、同型对照(美国，BD公司)；鼠抗α-actinin、Pax7、MyoG、MyoD单克隆抗体、兔抗β-actin多克隆抗体、山羊抗鼠IgG (美国，Abcam公司)；二氧化碳培养箱(美国，Thermo Fisher公司)；倒置相差显微镜、光学显微镜、荧光显微镜(日本，Olympus公司)；超薄石蜡切片机(德国，Leica公司)；张力传感器(美国，Aurora公司)；电刺激器(中国，艾研公司)；凝胶成像系统(美国，Bio-Rad公司)。

1.3.2 实验动物 8周龄清洁级雄性SD大鼠82只，体质量(260±40) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，其中10只用于细胞培养，72只用于动物体内实验。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠脂肪干细胞的分离与培养 参照文献[16]方法，用10%水合氯醛麻醉SD大鼠10只，无菌条件下取大鼠腹部皮下脂肪组织，称取1.5 g用眼科剪剪碎，PBS漂洗3次，每次3 min，用0.1%Ⅰ型胶原酶37 ℃孵育1 h， 1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞，过100 μm无菌细胞筛，在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中常规培养，24 h后换液，去除未贴壁的细胞，以后每隔2 d换液1次，待细胞在培养瓶底融合至80%-90%后传代，取第3代细胞进行鉴定与移植。

1.4.2 大鼠脂肪干细胞的鉴定 参照文献[17]，收集第3代脂肪干细胞，进行流式细胞术鉴定和多向分化能力鉴定。

流式细胞术鉴定细胞表型：用PBS将脂肪干细胞制成细胞浓度为1×10⁹ L^-1的细胞悬液，向专用试管中各加100 μL细胞悬液，然后加入10 μL FITC标记的兔抗大鼠CD29、CD31、CD34和CD90单克隆抗体及同型对照，4 ℃避光孵育40 min， PBS洗涤，上流式细胞仪检测，用FACS DIVA软件收集数据。

多向分化能力的鉴定：①成脂分化能力：将脂肪干细胞接种于6孔板内，用成脂诱导分化培养基在37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中培养10 d，40 g/L多聚甲醛固定10 min，PBS洗涤后用油红O溶液染色1 h，脱色后封固，显微镜下观察；②成软骨分化能力：用成软骨诱导分化培养基培养脂肪干细胞28 d，40 g/L多聚甲醛固定软骨球6 h，制作石蜡切片，阿利新蓝溶液染色30 min，显微镜下观察；③成骨分化能力：用成骨诱导分化培养基培养脂肪干细胞21 d，40 g/L多聚甲醛固定6 h，茜素红S溶液染色1 h，显微镜下观察。

1.4.3 腓肠肌急性钝挫伤大鼠模型建立参照文献[18]方法，10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，使大鼠俯卧于实验台上，右后肢呈屈膝90°，踝关节拉直并固定，充分暴露腓肠肌，用自制打击器具(自由下落的铁球，质量350 g，自由降落高度45.7 cm，打击动能1.57 J)击打大鼠小腿内侧腓肠肌中部。

评估造模成功的标准：骨骼肌急性闭合性损伤，击打部位局部肿胀，但皮肤无破损，胫腓骨无骨折。

1.4.4 实验分组与脂肪干细胞移植 将72只SD大鼠用随机数字表法分为正常对照组、模型组、胶原蛋白组、脂肪干细胞移植组，每组18只。模型组不做处理；胶原蛋白组分5个注射点在腓肠肌肌腹注射共1 mL大鼠胶原蛋白Ⅰ；脂肪干细胞移植组分5个注射点在腓肠肌肌腹注射含1×10⁶个脂肪干细胞的1 mL大鼠胶原蛋白Ⅰ。移植后7，14，28 d进行组织学与功能检测。

1.4.5 苏木精-伊红染色观察骨骼肌形态结构 根据文献[19]报道的方法进行改良，移植后7，14，28 d各组分别处死3只大鼠，取右腿腓肠肌，切取一部分放入40 g/L多聚甲醛固定48 h，脱水透明后石蜡包埋，4.0-5.0 μm连续切片，苏木精染液染色5 min，流水冲洗，伊红染液染色2 min，中性树胶封固，光学显微镜下观察并摄片，应用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测量腓肠肌中肌纤维横截面积的和，求平均值。另一部分骨骼肌组织放于液氮中保存备用。

1.4.6 Western blot检测骨骼肌组织中相关蛋白的表达 根据文献[20-21]报道，取上述液氮冻存的骨骼肌组织，加入组织裂解液用玻璃匀浆器裂解15 min，10 000 r/min离心5 min，吸各管上清液用考马斯亮蓝法检测提取蛋白浓度，沸水浴变性蛋白样品，SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜，5%血清白蛋白37 ℃封闭20 min，用鼠抗α-actinin(1∶300)、MyoG(1∶100)、MyoD(1∶100)、Pax7(1∶200)单克隆抗体和β-actin多克隆抗体(工作浓度1∶1 000)孵育，4 ℃过夜，滴加山羊抗鼠IgG(1∶400)孵育45 min，应用增强化学发光法在凝胶成像系统中显影，以β-actin为内参，应用Image Pro 6.0软件比较条带灰度。

1.4.7 等长收缩肌力的测量 移植后7，14，28 d各组分别取3只大鼠，10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉，参照文献[22]方法，迅速游离右侧小腿腓肠肌并称质量，用0号手术缝合线在近心端结扎肌腱，将整块肌肉水平放置于5 mL容量的肌槽内，将近心端肌腱固定于等长张力传感器上，将肌肉远心端夹在弹簧夹中。用改良Krebs-Henseleit溶液以6 mL/min剂量在27 ℃进行灌流，以体积分数为95%O₂和5%CO₂充分氧合，pH 7.40±0.20，铂金丝电刺激器刺激参数为：输出脉宽500 μs，间隔20 s，电压20 V，方波脉冲；平衡约1 h，随后以0.1 mm增量，拉伸腓肠肌至等长收缩张力最大时的肌肉初长度记为L_max位置，平衡10 min，用BL-410生物机能实验系统记录骨骼肌收缩力(N)。

1.4.8 腓肠肌湿质量与大鼠体质量的比值 肌力测量之前称取腓肠肌质量，根据公式：肌肉质量(mg)/体质量(g)×100%计算腓肠肌与大鼠体质量的比值。

1.5 主要观察指标 ①腓肠肌光镜结构；②腓肠肌纤维横截面积；③等长收缩肌力；④腓肠肌湿质量与体质量比值；⑤腓肠肌组织中Pax7、MyoG、MyoD的表达。

1.6 统计学分析 采用SPSS 23.0软件对数据进行分析，计量数据采用x(_)±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

发展同种异体干细胞移植治疗较大的骨骼肌损伤将有利于骨骼肌急性损伤患者肌肉功能的改善^[23]。在再生医学研究中，脂肪干细胞是间充质干细胞的理想来源^[24]。该实验在骨骼肌急性损伤后立即将脂肪干细胞移植到损伤的腓肠肌，显著加速肌纤维的再生与修复。脂肪干细胞移植部位较早的出现有核肌纤维的再生和受损肌纤维修复，这使骨骼肌功能的恢复得以实现。虽然脂肪干细胞在体内向骨骼肌纤维转分化的可能性已有报道，但关于移植后功能的研究较少，机制尚不明确^[25]。该研究发现，虽然移植脂肪干细胞后促进新的肌纤维形成，但数量较少，速度较慢，可能不是受损骨骼肌功能早期改善的主要机制，或许脂肪干细胞通过旁分泌发挥对结构与功能损伤的改善作用。以往的多项研究均证实，脂肪干细胞在发挥修复作用时，旁分泌的调节作用强于直接分化再生作用^[26-28]。

通过对移植后损伤骨骼肌的功能分析发现，肌内移植脂肪干细胞有助于急性损伤腓肠肌在28 d内改善肌力。此结果与Gorecka等^[29]的报道一致，但该研究并未发现脂肪干细胞向肌纤维和内皮细胞分化，故将脂肪干细胞植入后的积极效果归因于脂肪干细胞的旁分泌作用。该研究观察到散在分布的再生骨骼肌纤维，未经脂肪干细胞治疗和仅注射胶原蛋白的肌组织在28 d内未观察到功能改善和新生的肌纤维，提示脂肪干细胞移植入体内后可能促进了肌纤维的再生并改善了功能。

不可逆的肌纤维化是骨骼肌损伤后功能障碍的主要原因之一^[30]。组织学观察结果显示，在损伤后的28 d内，各组大鼠损伤肌组织周围未见结缔组织增生，说明在骨骼肌急性损伤时，脂肪干细胞移植并不是通过抑制组织纤维化发挥再生修复与功能改善作用的。研究报道，肌原纤维的数量与骨骼肌的功能直接相关，成熟骨骼肌纤维的细胞核位于细胞膜下方，不分布在细胞中心，新生肌纤维的细胞核由细胞中部转移到细胞膜下方分布^[31-32]。腓肠肌横切面形态结构显示，脂肪干细胞组损伤腓肠肌部位的骨骼肌纤维数量较模型组和胶原蛋白组多，肌纤维内可见位于细胞中央的细胞核，说明脂肪干细胞移植在修复骨骼肌时可产生含细胞核的新生肌纤维，有发育为成熟肌纤维的可能。此外，测量腓肠肌纤维的横截面积结果显示，移植后14 d和28 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌的肌纤维横截面积总和均值大于模型组和胶原蛋白组。以上结果提示，脂肪干细胞移植可能促进了骨骼肌纤维再生。

肌纤维的再生在骨骼肌损伤修复中发挥重要作用，修复过程受Ki67、Pax7等多种细胞因子的调控^[33-34]。研究表明，在胚胎时期，骨骼肌的形成过程包括多能干细胞分化为祖细胞、祖细胞分化为成肌细胞、肌管融合形成初级肌纤维、次级肌纤维形成并附着、具有收缩功能的骨骼肌形成等阶段，肌源性祖细胞和肌卫星细胞高表达Pax7，成肌细胞高表达MyoD，肌管融合与成肌细胞分化则高表达MyoG，说明在骨骼肌纤维再生过程中，Pax7与骨骼肌纤维的增殖密切相关，而促进成肌细胞分化的MyoD是骨骼肌纤维发育的早期标志基因，MyoG则是晚期分化标志^[35-37]。在成体，肌卫星细胞一般处于静息状态，只有运动或创伤等病理刺激发生肌纤维修复时细胞才被激活，从而先后表达Pax7、MyoD和MyoG，新生的肌纤维取代受损肌纤维，肌组织再生修复完成^[38]。应用Western blot进行蛋白半定量检测结果显示，移植后14 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中Pax7和MyoD的表达高于模型组和胶原蛋白组，移植后28 d，脂肪干细胞移植组腓肠肌组织中MyoD和MyoG的表达高于模型组和胶原蛋白组，说明模型组和胶原蛋白组在骨骼肌损伤后可能也有自发修复，但出现时间较晚，在14-28 d期间才表达Pax7；而脂肪干细胞移植组则在损伤后7 d即开始出现肌纤维再生，14 d开始进入再生早期，28 d时已有肌纤维进入再生晚期。以上结果提示，脂肪干细胞移植在肌纤维再生早期即发挥促进作用，且促进作用直至肌纤维再生晚期。

总之，实验发现脂肪干细胞移植促进了骨骼肌纤维再生并加速了骨骼肌的功能恢复，但脂肪干细胞确切的作用机制尚需进一步研究。脂肪干细胞如何通过旁分泌发挥作用以及通过哪种因子发挥作用，也将继续进行体外实验研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程