碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病的作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1750

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (21): 3378-3385.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1750

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碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病的作用及机制

吴华拉，周湘乡，钟玉兰，淦鑫

南昌大学第一附属医院呼吸内科，江西省南昌市 330006

修回日期:2019-02-13 出版日期:2019-07-28 发布日期:2019-07-28
通讯作者: 淦鑫，博士，主任医师，南昌大学第一附属医院呼吸内科，江西省南昌市 330006
作者简介:吴华拉，女，1988年生，江西省新建县人，汉族，2016年南昌大学毕业，硕士，医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病及干细胞的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81660009)，项目负责人：淦鑫；国家自然科学基金项目(81260004)，项目负责人：淦鑫；江西省自然科学基金(20161ACB20012)，项目负责人：淦鑫

Basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for chronic obstructive pulmonary disease

Wu Huala, Zhou Xiangxiang, Zhong Yulan, Gan Xin

Department of Respiration, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Revised:2019-02-13 Online:2019-07-28 Published:2019-07-28
Contact: Gan Xin, MD, Chief physician, Department of Respiration, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
About author:Wu Huala, Master, Physician, Department of Respiration, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81660009 (to GX) and 81260004 (to GX); the Natural Science Foundation of Jiangxi Province, No. 20161ACB20012 (to GX)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
CC16：Clara细胞蛋白，由肺部Clara细胞分泌的一种特异性蛋白。Clara细胞是一种无纤毛上皮细胞，主要分布于终末细支气管和呼吸性细支气管上皮；Clara细胞具有活跃的增殖分化特性，参与支气管上皮损伤的修复过程。Clara细胞蛋白具有抗炎、抗纤维化的生物学特性。
肺表面活性物质：指由肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌的一种复杂的脂蛋白，其主要成分为二棕榈酰卵磷脂和表面活性物质结合蛋白，前者约占60%以上，后者约占10%。肺表面活性物质分布于肺泡液体分子层表面，具有降低肺泡表面张力的作用，能维持大小肺泡容量的相对稳定，阻止肺泡毛细血管中液体向肺泡内滤出。

摘要
背景：促炎与抗炎反应失衡在慢性阻塞性肺疾病发病过程中起到关键作用。课题组设想通过减轻肺内炎症反应、促进肺泡上皮或支气管上皮细胞再生修复，减轻或逆转慢性阻塞性肺疾病的病理过程，从而达到治愈疾病的目的。
目的：观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)移植慢性阻塞性肺疾病大鼠白细胞介素10、白细胞介素4的表达及其在体内的分化。
方法：采用全骨髓贴壁法提取、培养骨髓间充质干细胞，以脂质体转染法导入bFGF-pcDNA3.1质粒。选取健康SD大鼠150只，随机取30只大鼠为正常对照组，其余120只大鼠采用脂多糖联合熏烟的复合刺激法制备成慢性阻塞性肺疾病模型，然后随机分为慢性阻塞性肺疾病组、骨髓间充质干细胞组、pcDNA3.1-BMSCs组、bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组，每组30只。各组大鼠分别在第7，14，28天处死，苏木精-伊红染色观察肺组织病理学改变，ELISA检测外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平，qRT-PCR法检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA的表达；冰冻切片免疫荧光染色法检测骨髓间充质干细胞在肺组织中的分化情况。
结果与结论：①第28天，3个骨髓间充质干细胞治疗组均较慢性阻塞性肺疾病组病理改变明显改善；②在相同时间节点，3个骨髓间充质干细胞治疗组外周血及肺组织中的白细胞介素10、白细胞介素4表达高于慢性阻塞性肺疾病组(P < 0.05)，骨髓间充质干细胞组、pcDNA3.1-BMSCs组差别不大，但bFGF-pcDNA3.1- BMSCs组较之二者相对较高，差异有显著性意义(P < 0.05)；③第28天，在3个骨髓间充质干细胞治疗组的肺组织切片中观察到有部分 CM-Dil 阳性细胞，同时SPC或CC16表达阳性，bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组阳性细胞相对较多；④结果表明，携带碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植入慢性阻塞性肺疾病大鼠，可减轻病理改变，增强抗炎效果，并可促进骨髓间充质干细胞分化为肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2459-7150(钟玉兰)

关键词: 慢性阻塞性肺疾病, 骨髓间充质干细胞, 碱性成纤维细胞生长因子, 基因转染, 抗炎细胞因子, 肺泡上皮细胞, 支气管上皮细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The imbalance between pro-inflammatory and anti-inflammatory responses plays a key role in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. The research team attempted to cure the chronic obstructive pulmonary disease by reducing the intrapulmonary inflammatory response, promoting the regeneration and repair of alveolar epithelial or bronchial epithelial cells, and alleviating or reversing the pathological procession of the disease.
OBJECTIVE: To observe the expression of interleukin-10 and interleukin-4 after transplantation of basic fibroblast growth factor (bFGF)-transfected bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) and cell differentiation in rats with chronic obstructive pulmonary disease.
METHODS: BMSCs were isolated and cultured using the whole bone marrow adhesion method. 150 healthy Sprague-Dawley rats were randomly selected, 30 of which were randomly selected as normal controls and the remaining rats were used to make a chronic obstructive pulmonary disease model by lipopolysaccharide combined with fumigation. Model rats were then randomly divided into chronic obstructive pulmonary disease group (model group), BMSCs group, pcDNA3.1-BMSCs group, and bFGF-pcDNA3.1-BMSCs group (n=30 per group). The rats in each group were sacrificed at 7, 14 and 28 days. The pathological changes of the lung tissues were observed by hematoxylin-eosin staining. The levels of interleukin-10 and interleukin-4 in the peripheral blood were detected by ELISA. The mRNA levels of interleukin-10 and interleukin-4 in the lung tissues were detected by qRT-PCR. The differentiation of BMSCs in the lung tissues was detected by immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: On the 28^th day after modeling, the pathological changes of the lung tissues were significantly improved in the three BMSCs groups relative to the model group. The expressions of interleukin-10 and interleukin-4 in peripheral blood and lung tissues at the same observation time point were significantly higher in the three BMSCs groups than the model group (P < 0.05). Although there was no significant difference between the BMSCs and pcDNA3.1-BMSCs group, higher levels of interleukin-10 and interleukin-4 were detected in the bFGF-pcDNA3.1-BMSCs group than the other BMSCs groups (P < 0.05). On the 28^th day after modeling, some cells in the lung tissues in the three BMSCs groups were concurrently positive for CM-Dil and SPC or CC16. Moreover, there were more positive cells in the bFGF-pcDNA3.1-BMSCs group as compared with the other BMSCs groups. In conclusion, transplantation of bFGF-transfected BMSCs for chronic obstructive pulmonary disease in rats can reduce pathological changes of the lung tissue, enhance anti-inflammatory effects, and promote differentiation of BMSCs into alveolar epithelial cells and bronchial epithelial cells.

Key words: chronic obstructive pulmonary disease, bone marrow mesenchymal stem cells, basic fibroblast growth factor, gene transfection, anti-inflammatory cytokines, alveolar epithelial cells, bronchial epithelial cells, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

吴华拉，周湘乡，钟玉兰，淦鑫. 碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(21): 3378-3385.

Wu Huala, Zhou Xiangxiang, Zhong Yulan, Gan Xin. Basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for chronic obstructive pulmonary disease[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(21): 3378-3385.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞的形态、鉴定和标记、转染结果 原代骨髓间充质干细胞为典型的纺锤形、梭形或三角形，局部可见小集落形成。提取、培养的第4代细胞经流式细胞术检测显示CD29、CD44高表达，而基本不表达造血干细胞的标记CD34、CD45，见图1。碱性成纤维细胞生长因子质粒转染骨髓间充质干细胞24-48 h，在荧光显微镜下观察可见部分细胞呈绿色荧光，提示质粒成功转染，见图2。对照组未见绿色荧光。

2.2 肺组织病理学改变 各实验组分别在干预第28天留取部分右肺中叶进行病理苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察病理改变，慢性阻塞性肺疾病组病理改变相对于正常对照组：肺泡腔不规则扩大，可见部分肺间隔断裂，数个肺泡融合成一个肺大疱；支气管、肺间质血管周围可见炎症细胞浸润，见图3B，符合典型慢性阻塞性肺疾病的病理改变。BMSCs组、pcDNA3.1-BMSCs组、bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组：均有典型的慢性阻塞性肺疾病病理改变。在相同视野下，肺泡腔不规则扩大，可见部分肺泡间隔断裂，肺大疱形成，气管管壁及肺间质血管管壁有少数炎性细胞浸润。BMSCs组、pcDNA3.1-BMSCs组之间无明显差异；与BMSCs组、pcDNA3.1-BMSCs组比较，bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组病变较轻，见图3C-E。

2.3 各组大鼠外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平 各组在干预第7，14，28天留取外周血，通过双抗夹心ELISA法检测外周血中白细胞介素10、白细胞介素4水平，结果显示：在相同时间节点，3个治疗组外周血中白细胞介素10、白细胞介素4水平高于慢性阻塞性肺疾病组(均P < 0.01)，BMSCs组、pcDNA3.1-BMSCs组外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平差别不大，但bFGF-pcDNA3.1- BMSCs组较之二者相对较高，差异有显著性意义(均P < 0.05)，见表1。

2.4 各组大鼠肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA的表达 各组分别在干预第7，14，28天留取部分右肺中叶，匀浆研磨后通过qRT-PCR检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA表达。在相同时间节点，3个治疗组肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4表达高于慢性阻塞性肺疾病组(均P < 0.01)，BMSCs组、pcDNA3.1-BMSCs组肺组织中的白细胞介素10、白细胞介素4表达差别不大，但bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组较之二者相对较高，差异有显著性意义(均P < 0.05)，见图4。

2.5 骨髓间充质干细胞在肺组织中的分化 各实验组分别在干预第28天留取部分右肺中叶进行新鲜冰冻切片，在荧光显微镜下观察CM-Dil染色阳性细胞分布情况，选择CM-Dil阳性细胞较多的切片进行免疫荧光染色，观察骨髓间充质干细胞在肺组织中分化情况。荧光显微镜下3个治疗组的肺组织切片中均有少数橙红色荧光的细胞，同时显淡绿色荧光(CM-Dil和SPC/CC16双染色标记)，见图5-10。肺泡壁有少量显橙红色荧光的细胞(CM-Dil标记)，同时显淡绿色荧光(SPC-FIFC标记)，支气管壁有少量显橙红色荧光的细胞(CM-Dil标记)，同时显淡绿色荧光(CC16-FIFC标记)，相对于BMSCs组、pcDNA3.1-BMSCs组，bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组可发现双染的阳性细胞较多。

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引言

慢性支气管炎和肺气肿是慢性阻塞性肺疾病的主要病理改变，促炎与抗炎反应失衡在这一过程起到关键作用。设想通过减轻肺内炎症反应、促进肺泡上皮或支气管上皮细胞再生修复，可能减轻或逆转慢性阻塞性肺疾病的病理进程，从而达到治愈慢性阻塞性肺疾病的目的^[1]。

多项研究表明，肺外干细胞移植是一种治疗慢性阻塞性肺疾病很有前景的新方法。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类具有分化潜能的多功能干细胞，能修复受损组织，同时具有抗炎及免疫调节作用^[2-3]。研究表明骨髓间充质干细胞能减轻急性肺损伤的炎症反应，改善肺纤维化和肺气肿^[4-6]。同时，骨髓间充质干细胞通过促进内源性肺干细胞增殖，通过旁分泌机制减轻气道炎症，从而减少肺泡壁细胞凋亡^[7-8]。

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是血管生长因子家族重要成员之一，在大鼠胚胎肺发育过程中碱性成纤维细胞生长因子及其受体的表达主要定位于气道上皮细胞、基底膜和细胞外基质，是肺发育必不可少的因子之一^[9]，Morino等^[10-11]通过气管内给予碱性成纤维细胞生长因子治疗弹性蛋白酶诱导的狗肺气肿模型，发现肺气肿病变程度明显减轻，肺功能恢复。

因此，实验拟将骨髓间充质干细胞作为载体，使其携带碱性成纤维细胞生长因子基因移植到慢性阻塞性肺疾病大鼠体内，观察肺组织的病理改变、抗炎症因子表达水平变化以及骨髓间充质干细胞在肺组织中的分化情况，为干细胞用于慢性阻塞性肺疾病的治疗提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年12月至2016年2月在南昌大学第一附属医院呼吸科重点实验室、检验科、病理科完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 选取6周龄健康SD大鼠，雌雄不限，提取骨髓间充质干细胞。选取2月龄健康SD大鼠150只，雌雄不限，体质量200-230 g，随机取30只大鼠为正常对照组，其余120只大鼠制备成慢性阻塞性肺疾病模型。实验动物均购买于南昌大学医学院实验动物科学部。

1.3.2 实验试剂 DMEM-LG培养基(Hyclone公司)；胎牛血清(美国BI公司)；Opti-MEM培养基(Gibco公司)；质粒抽提试剂盒(美国OMEGA公司)；活细胞染色剂CellTracker CM-Dil(美国Life Technologies公司)；兔抗大鼠SPC多抗(美国Santa Cruz公司)；兔抗大鼠CC16多抗(美国Abcam公司)；庐山牌香烟(焦油含量13 mg，尼古丁含量1.2 mg，江西南昌卷烟厂)；特制烟箱(50 cm×40 cm×40 cm，侧壁有两烟孔)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定与碱性成纤维细胞生长因子基因转染 取6周龄健康SD大鼠的股骨和肱骨，无菌状态下冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞悬液，采用密度梯度离心-贴壁培养法提纯大鼠骨髓间充质干细胞，接种于塑料培养皿，使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM-LG培养基，在37 ℃、体积分数为5%CO₂、100%饱和湿度条件下培养，每3 d或4 d按1∶3传代，流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志物表达，并用CM-DIL标记。

当骨髓间充质干细胞覆盖率达90%左右时，按0.5 μL/cm²加入Lipofectamine2000，按1 μg/cm²加入bFGF-pcDNA3.1质粒，于原培养箱孵育6 h，弃去旧培养基，加入完全培养基，放入原培养箱相同条件培养24 h；通过荧光显微镜观察可见绿色荧光，则证实碱性成纤维细胞生长因子转染成功，用G418筛选稳转细胞，稳定转染24 h内移植。

1.4.2 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型制备及实验分组 选取健康2月龄SD大鼠150只，雌雄不限，体质量200-230 g，随机取30只大鼠为正常对照组，其余120只大鼠采用脂多糖联合熏烟的复合刺激法制备成慢性阻塞性肺疾病模型。

慢性阻塞性肺疾病模型制备：第1天、第14天经气管内注入脂多糖(200 μg/次)，第2-30天(除外第14天)将大鼠放入特制的烟箱内(50 cm×40 cm×40 cm，侧壁有两烟孔)，注入庐山牌香烟(焦油含量13 mg，尼古丁含量1.2 mg，江西南昌卷烟厂)烟雾，2次/d，每次40 min(每次8支烟，分4次燃，每次烟燃尽约需9 min，换烟30 s)，为期1个月。

实验分组：将制成的慢性阻塞性肺疾病大鼠随机分为4组：慢性阻塞性肺疾病组、BMSCs组、pcDNA3.1-BMSCs组、bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组，每组30只。上述分组后(包括正常对照组)立即进行下列干预，期间正常喂养。正常对照组：健康SD大鼠经尾静脉注射1 mL PBS；慢性阻塞性肺疾病组：模型大鼠经尾静脉注射1 mL PBS；BMSCs组：模型大鼠尾经静脉注射CM-Dil标记的第3代骨髓间充质干细胞1×10⁷/1 mL PBS；pcDNA3.1-BMSCs组：模型大鼠经尾静脉注射CM-Dil标记的转染pcDNA3.1质粒的第3代骨髓间充质干细胞1×10⁷/1 mL PBS；bFGF-pcDNA3.1- BMSCs组：模型大鼠经尾静脉注射CM-Dil标记的转染bFGF-pcDNA3.1质粒的第3代骨髓间充质干细胞1×10⁷/1 mL PBS。

留取标本：各组在干预7，14，28 d后各处死10只大鼠。①留取部分右肺中叶，经体积分数为10%甲醛溶液固定后，制备石蜡切片，切片约4 μm厚度，行苏木精-伊红染色；②留取部分右肺中叶-80 ℃冰箱保存，用于qRT-PCR实验检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4的表达；③留取外周血，以2 500 r/min离心10 min，取上层淡黄色血清，保存于-80 ℃冰箱，用于ELISA实验检测外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平；④取部分右肺中叶，制备新鲜冰冻切片，切片约5 μm，在荧光显微镜下观察冰冻切片CM-Dil染色阳性细胞分布情况，选择CM-Dil阳性细胞较多的切片进行免疫荧光染色，观察骨髓间充质干细胞在肺组织中的分化情况。

1.4.3 肺组织白细胞介素10、白细胞介素4 mRNA的表达 取右肺中叶，匀浆研磨后，通过qRT-PCR法检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4的表达，反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，循环40次，得到产物即cDNA，-20 ℃保存。内参β-actin引物F：5'-AGC GAG CAT CCC CCA AGT T-3'，R：5'-GGG CAC GAA GGC TAC ATC ATT-3'，扩增产物大小为101 bp；白细胞介素10引物F：5'-AAG GGT TAC TTG GGT TGC CA-3'，R：5'-AGA CAC CTT TGT CTT GGA GCT T-3′，扩增产物大小为241 bp；白细胞介素4引物F：5'-TCT GTA GAG GTG TCA GCG GT-3'，R：5'-AGT GTT GTG AGC GTG GAC TC-3'，扩增产物大小为70 bp。采用2^-ΔΔCt法计算各实验组相对于正常对照组基因表达的相对倍数。

1.4.4 骨髓间充质干细胞在肺组织中的分化 CM-Dil阳性细胞较多的新鲜冰冻切片经一抗(兔抗鼠SPC和CC16多抗1∶200稀释)4 ℃孵育过夜，37 ℃复温孵育30 min；经二抗(羊抗兔FIFC 1∶200稀释)37 ℃孵育40 min，观察同一视野下双染色细胞个数。

1.5 主要观察指标 ①各实验组肺组织病理改变；②qRT-PCR实验检测肺组织中白细胞介素10、白细胞介素4mRNA的表达；③ELISA实验检测外周血白细胞介素10、白细胞介素4水平；④在荧光显微镜下观察冰冻切片CM-Dil染色阳性细胞分布情况；⑤骨髓间充质干细胞在肺组织中的分化情况。

1.6 统计学分析 实验中涉及到计量资料用x(_)±s表示，采用SSPS 17.0软件进行统计学分析，检验水平为α=0.05。样本均数间的多重比较，方差行F 检验判断方差齐性，方差齐性检验合格时用LSD-t 检验，方差不齐时采用秩和检验，P < 0.05为有差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

慢性阻塞性肺疾病主要特征是肺结构破坏，这与炎症反应、肺泡上皮细胞凋亡、内皮功能障碍、蛋白酶和抗蛋白酶失衡等有关。目前慢性阻塞性肺疾病的主要治疗方式是药物治疗，但并不能有效地阻止症状持续恶化和肺功能进行性下降，因此需要探索新的治疗方法^[12]。骨髓间充质干细胞具有修复损伤组织的潜能，能够向受损组织细胞定向分化，同时具有免疫调节特性和抗炎作用。研究表明，使用骨髓间充质干细胞治疗由吸烟诱导的慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，骨髓间充质干细胞可以通过抑制肺泡巨噬细胞COX-2/PGE2，部分通过p38 MAPK和ERK通路介导，减轻慢性阻塞性肺疾病大鼠气道炎症和肺气肿^[13]，同时可以通过促进内源性肺干细胞的增殖，减轻慢性阻塞性肺疾病模型肺损伤，减少肺泡壁凋亡^[12-15]。而且，移植入肺内的骨髓间充质干细胞可以分泌一种重要的上皮生长因子，提示滞留在肺内的骨髓间充质干细胞可能分化成肺泡上皮细胞并以旁分泌的方式调节其他肺泡上皮细胞^[16]。这使骨髓间充质干细胞成为慢性阻塞性肺疾病的一种治疗策略变得可能。

实验结果显示骨髓间充质干细胞对慢性阻塞性肺疾病大鼠损伤的肺组织具有修复作用。实验通过气道内注入脂多糖联合烟熏法制备慢性阻塞性肺疾病大鼠模型^[17-20]，肺组织苏木精-伊红染色后呈现典型慢性阻塞性肺疾病病理改变，即肺泡壁断裂、肺气肿、周围炎症细胞浸润。骨髓间充质干细胞干预28 d后，病理学改变与慢性阻塞性肺疾病组相比较，肺气肿、肺泡壁断裂、炎症细胞浸润的程度较轻。骨髓间充质干细胞组新鲜冰冻免疫荧光染色显示肺泡壁处可见少量显橙红色荧光的细胞(CM-Dil标记)，同时显淡绿色荧光(SPC-FIFC标记)，支气管壁处可见少量显橙红色荧光的细胞(CM-Dil标记)，同时显淡绿色荧光(CC16-FIFC标记)。因此推测骨髓间充质干细胞可在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺内分化为肺泡上皮细胞或支气管上皮细胞，达到修复肺实质的作用，改善肺功能。

碱性成纤维细胞生长因子是一种有效的肺泡Ⅱ型细胞有丝分裂原^[21]，是血管生长因子家族重要成员之一，是人体内重要的创伤愈合因子之一，可调节多种组织的创伤修复过程，促进细胞增殖和分化。有研究证明，博莱霉素诱导小鼠肺损伤后，碱性成纤维细胞生长因子对损伤的肺上皮细胞起到保护作用^[22]；而碱性成纤维细胞生长因子经肺内动脉给药后，犬肺气肿模型肺泡间隙变小，微血管密度增高^[23]。这使碱性成纤维细胞生长因子有望成为一种有效治疗肺气肿的方法。

有研究表明，碱性成纤维细胞生长因子基因成功转染入大鼠骨髓间充质干细胞中并可大量表达目的基因及目的蛋白，且碱性成纤维细胞生长因子能促进骨髓间充质干细胞定向分化^[24-26]。已有多项动物实验证明，碱性成纤维细胞生长因子修饰骨髓间充质干细胞后在治疗如肺动脉高压、急性肾损伤、糖尿病、颅脑损伤、失神经萎缩等疾病方面均较优于单纯骨髓间充质干细胞组^[27-30]。因此，作者将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至骨髓间充质干细胞，再通过尾静脉注射将携带碱性成纤维细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞移植入慢性阻塞性肺疾病大鼠。结果显示骨髓间充质干细胞干预28 d后，bFGF-pcDNA3.1- BMSCs组病理学改变与骨髓间充质干细胞组相比较，肺气肿、肺泡壁断裂、炎症细胞浸润程度较轻。bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组新鲜冰冻免疫荧光染色显示肺泡壁或支气管壁双染色阳性细胞较多于骨髓间充质干细胞组；因此作者推测碱性成纤维细胞生长因子能促进骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞或支气管上皮细胞分化；携带碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞能够更有优势地减轻慢性阻塞性肺疾病的病理改变。

慢性阻塞性肺疾病的特点是持续的气流限制，通常是渐进性的。它与呼吸道和肺部的慢性炎症反应增强有关，促炎与抗炎失衡在这一过程起到关键作用^[31-32]。研究表明骨髓间充质干细胞能通过减少促炎因子和增加抗炎因子的表达减轻慢性阻塞性肺疾病的炎症反应^[23]。白细胞介素10是一种有效的抗炎细胞因子，最初被标记为CSIF/细胞因子合成抑制因子，能够抑制T辅助1(Th1)细胞产生促炎细胞因子^[33-35]。白细胞介素10可以通过对巨噬细胞和树突状细胞的抑制作用，抑制机体对病原菌和微生物菌群的免疫反应，从而抑制相关疾病的病理改变^[36-37]。研究表明白细胞介素10在慢性阻塞性肺疾病治疗方面中也可能具有促进改善作用^[38-39]，可以抑制促炎趋化因子和蛋白酶，而这些趋化因子和蛋白酶可能参与肺实质弹性蛋白的破坏，影响疾病的预后，因此作者推测白细胞介素10减少可能导致慢性阻塞性肺疾病加重。实验结果显示，骨髓间充质干细胞组肺组织及外周血白细胞介素10水平高于慢性阻塞性肺疾病组，而bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组较骨髓间充质干细胞组高；所以作者推测骨髓间充质干细胞也可能通过提高抗炎因子白细胞介素10水平来减轻慢性阻塞性肺疾病炎症反应，而碱性成纤维细胞生长因子促进骨髓间充质干细胞参与这一过程。

白细胞介素4是一种多效细胞因子，在B细胞对IgE合成的2型T-helper应答和同型class开关中起着关键作用^[40]。有研究表明，急性加重慢性阻塞性肺疾病血浆中白细胞介素4水平降低，白细胞介素4与第1秒用力呼气量呈正相关^[41-42]。作者推测在慢性阻塞性肺疾病进展中，白细胞介素4作为抗炎因子参与这一过程，从而减轻慢性阻塞性肺疾病的炎症反应，减轻肺组织的结构破坏。实验结果显示，骨髓间充质干细胞组肺组织及外周血白细胞介素4水平较慢性阻塞性肺疾病组高，而bFGF-pcDNA3.1-BMSCs组较骨髓间充质干细胞组高；恰好印证了白细胞介素4在慢性阻塞性肺疾病的病理改变中可能起到抗炎作用；所以作者同样推测骨髓间充质干细胞也可能通过提高抗炎因子白细胞介素4水平来减轻慢性阻塞性肺疾病炎症反应，而碱性成纤维细胞生长因子促进骨髓间充质干细胞参与这一过程。

综上所述，骨髓间充质干细胞可能通过提高抗炎因子白细胞介素10、白细胞介素4的表达，减轻慢性阻塞性肺疾病肺内炎症；在肺内分化成肺泡上皮细胞或支气管上皮细胞，减轻或逆转慢性阻塞性肺疾病的病理改变。与单纯骨髓间充质干细胞比较，碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞的治疗作用更优势。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

碱性成纤维细胞生长因子转染骨髓间充质干细胞移植治疗慢性阻塞性肺疾病的作用及机制

Basic fibroblast growth factor-transfected bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for chronic obstructive pulmonary disease

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