2  结果  Results

2.1  人牙髓干细胞的鉴定结果  免疫荧光和流式细胞仪检测结果显示，第1代培养的人牙髓干细胞表达CD29、CD44、CD90标志抗原，不表达CD34、CD45、CD133标志抗原，见图1，表明实验分离、培养的人牙髓干细胞纯度较高。

2.2  PGE1、bFGF对人牙髓干细胞增殖的影响  与空白对照组相比，PGE1及bFGF单独处理都能提高人牙髓干细胞的相对增殖率(P < 0.05)，并且20 μg/L的PGE1及20 μg/L的bFGF在干预第2天时人牙髓干细胞的相对增殖率最高，见图2，3。因此，实验选择PGE1及bFGF质量浓度均为   20 μg/L，作用时间为2 d来进行后续实验。

2.3  PGE1联合bFGF对人牙髓干细胞增殖的影响  与对照组相比，PGE1组、bFGF组和PGE1+bFGF组细胞相对增殖率均显著升高(P < 0.05)；与PGE1组、bFGF组相比，PGE+bFGF组细胞相对增殖率进一步升高(P < 0.05)，见图4。

2.4  PGE1联合bFGF对人牙髓干细胞分泌血管内皮生长因子、内皮抑素的影响  与对照组相比，PGE1组、bFGF组和PGE1+bFGF组人牙髓干细胞培养基中血管内皮生长因子水平显著升高(P < 0.05)，内皮抑素水平显著降低(P < 0.05)；与PGE1组、bFGF组相比，PGE+bFGF组细胞培养基中血管内皮生长因子水平进一步升高(P < 0.05)，内皮抑素水平进一步降低(P < 0.05)，见图5。

2.5  PGE1联合bFGF对人脐静脉血管内皮细胞血管生成能力的影响  与对照组相比，PGE1组、bFGF组和PGE1+bFGF组人牙髓干细胞条件培养基干预后人脐静脉血管内皮细胞成管长度均显著增加(P < 0.05)；与PGE1组、bFGF组相比，PGE+bFGF组人牙髓干细胞条件培养基干预后人脐静脉血管内皮细胞成管长度进一步增加(P < 0.05)，见图6，7。

人牙髓干细胞是2000年GRONTHOS等首先发现的一种具有间充质干细胞典型生物学特征的干细胞，具有高度增殖和自我更新分化的特性，不仅乳牙牙髓组织中存在牙髓干细胞，而且发育完成的恒牙牙髓组织中也存在该细  胞^[1-2]。体外培养的人牙髓干细胞可以向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞分化^[3]，与成牙本质细胞的发生相关，同时还可促进牙髓内血管再生，介导并重建牙髓血运^[4]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一种肝素黏合多肽，也是一种重要的潜在有丝分裂原，具有很强的促细胞生长作用^[5]，研究发现牙髓中的成纤维细胞能表达bFGF，在体外明显促进人牙髓干细胞增殖^[6]；人牙髓干细胞还可通过分泌血管生成相关因子促进血管内皮细胞的增殖和迁移^[7]，并预测bFGF可增强人牙髓干细胞促人脐静脉血管内皮细胞体外小管形成的作用，进而间接增强其血管生成能力。前列腺素E1 (prostaglandin E1，PGE1)是广泛存在于体内的一种生物活性物质，具有舒张血管、稳定细胞膜及抗炎等作用^[8]，可促进骨髓间充质干细胞和神经干细胞的增殖、迁移^[9]，促进细胞分泌血管内皮生长因子，进而促进血管生成^[10]，但其对人牙髓干细胞的作用目前还未知。

该实验联合使用PGE1和bFGF处理体外培养的人牙髓干细胞，探索其对人牙髓干细胞增殖和血管生成能力的影响。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods

1.1  设计  细胞学体外实验。

1.2  时间及地点  2019年3至6月在河北医科大学第二医院完成。

1.3  材料

1.3.1  实验材料与试剂  人脐静脉血管内皮细胞(CRL-1730)(美国ATCC公司)；PGE1(P8908)、bFGF (372040)、DAPI(D9542)、血管内皮生长因子(RAB0507) ELISA试剂盒、内皮抑素(RAB0095)ELISA试剂盒(Sigma公司)；胎牛血清(11011-8611)、DMEM高糖培养基(11995)、PBS(P1022)、中性蛋白酶Dispase(D6430)、胶原酶Ⅰ(C8140)、胰蛋白酶-EDTA消化液(T1300)、100×青链霉素混合液(P1400)(Solarbio公司)；APC-CD34(clone 581)、PE-CD29(HUTS-21)、FITC-CD44(G44-26)、PE-CD45 (HI30)、FITC-CD90(5E10)(BD Biosciences公司)；APC-CD133(AC133-1)(Miltenyi Biotec公司)；CD29 (ab179471)、CD44(ab216647)、CD90(ab133350)、CD34 (ab81289)、CD45(ab214437)、CD133(ab19898)一抗、 Alexa Fluor 488标记的羊抗兔二抗(ab199091)(Abcam公司)；Matrigel(354248)(BD Biocoat公司)。

1.3.2  实验仪器  酶标仪(Model 680)(美国Bio-Rad公司)；倒置相差显微镜(CKX53)、自动荧光显微镜(BX63)(日本Olympus公司)；低温高速离心机(Centrifuge 5424R)(德国Eppendorf股份公司)。

1.4  实验方法

1.4.1  培养基配制、细胞培养及条件培养基的提取

(1)人脐静脉血管内皮细胞、人牙髓干细胞完全培养基：在500 mL DMEM高糖基础培养基中加入体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的混合液(100×)混匀。

(2)人牙髓干细胞的体外分离、培养：参照文献[11]，收集志愿者因正畸减数或阻生而新鲜拔除的健康完整恒牙，超净台中用含1%青霉素和链霉素混合液的PBS漂洗干净，在无菌条件下用拔髓针取出牙髓，将牙髓剪成小组织块(约1 mm³)，转移至离心管中，加入10倍量的Dispase酶、胶原酶Ⅰ混合液(比例为1∶1)混匀后37 ℃消化1 h，加入胎牛血清终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入人牙髓干细胞完全培养基混匀，使用细胞筛网过滤得到单细胞悬液，计数后调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，接种于25 cm²培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养，每   3 d更换1次培养液(弃去未贴壁细胞)，取对数生长期的原代细胞加入胰酶消化后，采用有限稀释法接种于96孔培养板，使每孔细胞数少于3个，常规培养12 h后标记出单个细胞的孔，待单细胞克隆生长至孔底80%时加入胰酶消化，合并多个克隆培养的细胞扩大培养，即为第1代。

(3)人脐静脉血管内皮细胞的培养：取出冻存细胞，在39 ℃水浴中快速融化，以1 000 r/min的转速离心5 min，去除上清，加入人脐静脉血管内皮细胞完全培养基重悬接种在25 cm²培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%CO₂条件下培养，当细胞增至85%左右时加入胰酶消化，以1∶3的比例进行传代培养。

(4)人牙髓干细胞条件培养基的提取^[12]：将生长状态良好的人牙髓干细胞接种在25 cm²培养瓶中进行常规培养，待细胞长至80%时更换为DMEM高糖基础培养基继续培养24 h，收集培养液，1 000 r/min离心10 min，收集上清备用。

1.4.2  人牙髓干细胞鉴定  CD29、CD44、CD90是人牙髓干细胞的标志抗原^[13]，CD34、CD45、CD133是造血干/祖细胞的标志抗原^[14]，采用细胞免疫荧光和流式细胞技术检测上述抗原的表达，可用来鉴定人牙髓干细胞。取对数期第1代人牙髓干细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-1，吸取1 mL细胞悬液置于EP管中，以300×g的转速离心5 min后弃去上清，加入300 mL Buffer，分别加入适宜浓度的抗体APC-CD34、PE-CD29、FITC-CD44、PE-CD45、FITC-CD90、APC-CD133于4 ℃下避光孵育30 min，然后上流式细胞仪检测并使用FlowJo软件对结果进行分析。

以上剩余的单细胞悬液接种于24孔板中(以0.2%明胶铺板)培养，待细胞长至80%时弃去培养基，PBS漂洗，加入5% BSA室温封闭1 h，分别加入CD29、CD44、CD90、CD34、CD45、CD133一抗4 ℃孵育过夜，PBS漂洗3次，加入Alexa Fluor 488标记的羊抗兔二抗室温避光孵育2 h，PBS漂洗3次，加入DAPI孵育30 min，PBS漂洗3次，在荧光显微镜下观察以上标志蛋白表达。

1.4.3  CCK-8实验及细胞分组  取对数期第2代人牙髓干细胞接种于96孔板中(5×10⁸ L^-1)，分别以5，10，20，50，100 μg/L的PGE1及5，10，20，50，100 μg/L的bFGF单独处理人牙髓干细胞，以未加药物处理的细胞作为空白对照组，每组设4个孔，分别在培养第1，2，3天加入CCK-8试剂，继续培养2 h，在全自动酶标仪中测定450 nm波长下各孔吸光度值，计算各组细胞的相对增殖率。公式为：相对增殖率(%)=药物处理组吸光度值/空白对照组吸光度值×100%。

根据CCK-8实验结果选择最佳药物质量浓度及作用时间进行后续实验。取1.4.1中的对数期第3代人牙髓干细胞接种于60 mm培养皿中，细胞浓度为5×10⁸ L^-1，分为4组：对照组、PGE1组、bFGF组和PGE1+bFGF组，培养24 h后用药物处理各组细胞，然后收集细胞进行CCK-8实验。

1.4.4  ELISA检测血管内皮生长因子、内皮抑素水平  参照1.4.1中的步骤提取上述各组人牙髓干细胞条件培养基，采用ELISA测定试剂盒根据制造商说明书检测培养基中血管内皮生长因子、内皮抑素水平。

1.4.5  小管形成实验  将移液枪枪头、24孔板等实验中接触Matrigel基质胶的物品预冷，Matrigel基质胶置于4 ℃冰箱中过夜融化，以每孔300 µL加入24孔板中，在37 ℃静置1 h以成胶，取对数期传代人脐静脉血管内皮细胞接种于24孔板中，分为4组：对照组、PGE1组、bFGF组和PGE1+bFGF组，细胞浓度为2×10⁸ L^-1，待细胞贴壁后将人脐静脉血管内皮细胞完全培养基更换为对应的上述各组人牙髓干细胞条件培养基继续培养6 h，取出细胞培养板，在倒置显微镜下观察并拍照，采用Image-Pro Plus软件分析形成小管的长度。

1.5  主要观察指标  ①PGE1、bFGF干预后人牙髓干细胞的相对增殖率；②PGE1、bFGF干预后人牙髓干细胞条件培养基中血管内皮生长因子、内皮抑素水平；③PGE1、bFGF干预后人牙髓干细胞条件培养基对人脐静脉血管内皮细胞体外血管生成能力的影响。

1.6  统计学分析  数据以统计学软件SPSS 22.0进行分析，计量资料以x(_)±s表示，两组间比较行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

人牙髓干细胞具有自我更新及多向分化潜能，诱导其分化可获得多种功能细胞，在牙髓的损伤修复及再生过程中发挥着重要作用^[15-16]。该实验分离、培养恒牙牙髓组织中的人牙髓干细胞，采用流式细胞和细胞免疫荧光技术检测人牙髓干细胞表面抗原，结果显示细胞表达CD29、CD44、CD90人牙髓干细胞标志抗原，不表达CD34、CD45、CD133造血干/祖细胞标志抗原，表明从牙髓组织中分离、培养的细胞确实为人牙髓干细胞，且纯度很高，为后续研究打下了良好的基础。

成纤维细胞生长因子最早是在牛脑和垂体的提取物中发现的一类细胞生长因子家族，来源于中胚层和神经外胚层细胞，具有广泛的生物学活性，成纤维细胞生长因子家族成员之间有一定的同源性和结构相似性，种属之间具有高度保守性，均能诱导多种细胞增殖和分化，可刺激细胞迁移、促进血管生成、组织器官损伤修复等^[17]。PGE1由BERGSRTOEM等在1960年首先分离并详细得出其分子结构，在临床上别名为前列地尔，用于治疗心肌梗死、血栓性脉管炎、闭塞性动脉硬化等疾病，可促进髓系祖细胞的增殖^[18]，但PGE1联合bFGF对人牙髓干细胞增殖的作用目前还不清楚，该研究的CCK-8实验结果显示，PGE1及bFGF单独处理均能促进人牙髓干细胞增殖，在0-20 μg/L时随剂量升高促进增殖作用增强，到达20 μg/L时趋于稳定，并且在2 d内随作用时间延长促进增殖作用增强，在第2天时趋于稳定，因而该研究选择的PGE1、bFGF最佳作用质量浓度均为20 μg/L，最佳作用时间为2 d。以PGE1和bFGF联合处理人牙髓干细胞，其相对增殖率高于PGE1、bFGF单独处理，表明PGE1和bFGF联合对人牙髓干细胞具有协同作用。

研究表明，人牙髓干细胞可合成分泌促进血管形成的血管内皮生长因子，进而促进体外培养的血管内皮细胞成管^[19-20]，因此理论上bFGF可以通过促进人牙髓干细胞增殖来增强其血管生成相关因子的分泌，进而增强其血管形成能力。PGE1能够有效地预防和治疗显微外科术后血管危象^[21]，并促进血管内皮细胞产生血管内皮生长因子和内皮型一氧化氮合酶，修复心力衰竭患者血管内皮细胞功能^[22]，但PGE1对人牙髓干细胞的作用还不清楚。结果显示以PGE1、bFGF分别处理人牙髓干细胞，其细胞培养基中血管内皮生长因子水平以及人脐静脉血管内皮细胞体外血管生成能力均显著升高，而内皮抑素水平显著降低，表明PGE1、bFGF均能促进人牙髓干细胞增殖、分泌血管内皮生长因子，抑制其分泌内皮抑素，增强人牙髓干细胞对人脐静脉血管内皮细胞的血管形成能力，以PGE1和bFGF联合处理人牙髓干细胞，其细胞培养基中血管内皮生长因子水平以及人脐静脉血管内皮细胞体外血管生成能力均高于两者单独处理，而内皮抑素水平低于两者单独处理，表明PGE1及bFGF联合具有协调作用，可进一步促进人牙髓干细胞增殖，进而提高人脐静脉血管内皮细胞体外成管能力，且PGE1、bFGF对人牙髓干细胞诱导人脐静脉血管内皮细胞血管形成能力的促进作用可能是通过影响血管内皮生长因子、内皮抑素的分泌实现的，但PGE1、bFGF两者之间的相互作用及具体联系尚未研究清楚，是后续需要深入研究的内容。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

前列腺素E1：是一种生物活性物质，广泛存在于体内各组织细胞，由BERGSRTOEM等于1960年首先分离获得，并详细研究了其分子结构，具有舒张血管、稳定细胞膜降低血小板黏附率、改善血液黏度及抗炎等作用，可促进骨髓间充质干细胞和神经干细胞的增殖、迁移，并促进细胞分泌血管内皮生长因子，进而促进血管生成。

碱性成纤维细胞生长因子：是一种肝素黏合多肽，也是一种重要的潜在有丝分裂原，属于成纤维细胞生长因子家族，对细胞有丝分裂及分化具有很强的调节作用，特别是对中胚层和神经外胚层来源的细胞作用更强，可促进细胞生长，研究发现牙髓中的成纤维细胞可表达碱性成纤维细胞生长因子，在体外能明显促进人牙髓干细胞增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人牙髓干细胞作为一种具有高度增殖和自我更新分化的特性，在牙齿的发育、形成及牙髓的修复再生过程中发挥重要的作用，是牙本质形成、牙髓内血管再生、牙髓血运重建的关键。前列腺素E1、碱性成纤维细胞生长因子等多种细胞生长因子可相互作用构成功能性网络，形成细胞生存、血管形成的微环境，促使牙齿的发育及牙本质的形成，该实验联合使用前列腺素E1和碱性成纤维细胞生长因子处理体外培养的人牙髓干细胞，两者对人牙髓干细胞增殖和血管生成能力均有促进作用，且两者联合具有协同作用，但两者之间的相互作用及具体分子机制还需要深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程