2  结果  Results

2.1  体外骨髓间充质干细胞培养及鉴定结果  采用全骨髓贴壁法分离培养1 d后即可观察到有细胞贴壁，2 d后可见许多成梭形的细胞贴壁生长，见图1A；在第3，4天出现分散的细胞集落，见图1B；采用骨髓间充质干细胞表面CD29抗体鉴定培养第3，4天的细胞，可见95%以上的细胞CD29染色阳性，见图1C，D。培养第5天时梭形细胞约可铺满瓶底，在第6天时吉姆萨染色可见绝大多数细胞融合，见图1E。传代细胞1 d之内基本贴壁铺展，并且可以迅速进行增殖，为典型的均一长梭形的骨髓间充质干细胞形态。

2.2  骨髓间充质干细胞的BrdU标记效果  BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，可竞争性掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，混入到单链DNA中的BrdU可通过免疫组化染色抗BrdU单克隆抗体在细胞爬片或组织切片上显示，从而对骨髓间充质干细胞进行识别和示踪。免疫组化染色检测BrdU标记的优点是易于区分阳性和阴性，检测的对比度和准确率较高，而且在低倍镜中也可检测到，见图2，因此适合于快速检查BrdU。

2.3  实验动物数量分析  参加实验大鼠30只，均进入结果分析，中途无脱落。

2.4  大鼠后肢神经功能评分变化  骨髓间充质干细胞移植治疗后1，2周采用BBB评分评价各组大鼠左后肢运动功能。实验成功造模后大鼠表现为左后肢立即瘫痪，BBB评分为0分。各组大鼠关节活动次数、运动负荷及范围、前后肢及尾巴的协调度均有不同程度恢复，各组大鼠BBB评分均有不同程度提高，移植治疗组在2个检测时间点BBB评分均较模型对照组明显提高且差异有显著性意义(P < 0.05)，与假手术组相比差异仍有显著性意义(P < 0.001)，见表1。

2.5  苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色结果  失神经损伤的肌纤维已经发生退化，具体表现为肌纤维肌膜慢慢消失，肌纤维相互融合在一起，融合的肌纤维很粗，但肌纤维数量减少，肌间隔变大，见图3A，B。正常组织的肌纤维则表现为肌间隔规整。移植治疗组苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色可见骨髓间充质干细胞进入肌纤维间隙，并对肌纤维间隔进行修复，肌纤维排列较为规整，肌间隙与正常无异，见图3C-F。

2.6  肌纤维直径和肌纤维横截面积测量结果  采用Image J图像分析系统对肌纤维横截面积及肌纤维直径进行测量，见表2。模型对照组融合的肌纤维横截面积增粗很明显，但是纤维数量减少也很明显；移植治疗组的肌纤维与假手术组没有差别。

周围神经损伤可造成感觉功能障碍和肌肉萎缩等一系列严重常见的临床症状^[1]，尤其肌肉萎缩引起的运动功能减弱或消失，严重地影响了人们的生活质量^[2]。首选治疗方法为外科显微镜手术治疗，而目前手术治疗方法也处于瓶颈期^[3-6]，一些辅助治疗方法的效果也差强人意^[7-10]。神经细胞是高度分化的成熟细胞，一般无再生能力，损伤之后不能再生修复，其所属的神经纤维亦随之消失、缺损，以至于只能通过周围的神经胶质细胞及其纤维填补而形成胶质瘢痕，所以无法通过修复损伤的神经来有效延缓或治疗失神经肌萎缩^[11-12]。研究发现骨髓间充质干细胞具有定向分化潜能，并且在一定环境因素下能对损伤的组织进行修复^[13-16]，作者猜想其可以对失神经萎缩肌肉起到一定的修复作用。目前已经证实间充质干细胞存在于机体的多种组织中，包括脐带、骨髓、脂肪、外周血、骨骼肌等^[17-19]。大量的体外研究证实了骨髓间充质干细胞有着高度的自我更新能力和较强的多胚层分化潜能^[20-21]，预计有望延缓或治疗失神经肌萎缩。LI等^[22-24]也同样认为骨髓间充质干细胞所产生的神经因子将对失神经萎缩肌肉具有一定的修复能力。研究证实间充质干细胞主要通过直接和间接2种方式发挥治疗作用，直接方式有归巢、促进外源干细胞植入患处、定向分化与多向分化等；间接方式有双向调节免疫反应和炎症反应、抗氧化应激、抗纤维化、抗凋亡、造血支持作用、参与或促进血管再生、激活内源干细胞增殖分化等。间充质干细胞移植治疗的作用机制十分复杂，迄今仍没有完全弄清楚，还需要进行深入研究^[25]。因此进行骨髓间充质干细胞移植对失神经肌萎缩作用效果的研究具有重要现实意义^[26-31]。该研究将骨髓间充质干细胞移植到失神经肌肉组织，观察其对失神经肌萎缩的修复效果，为骨髓间充质干细胞的临床应用提供理论依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  材料和方法  Materials and methods

1.1  设计  细胞学和动物模型实验。

1.2  时间及地点  2016年5月至2018年5月在沈阳医学院中心实验室和实验动物中心完成。

1.3  材料  健康初断乳的SD大鼠2只，体质量50-60 g，雌雄不限，用于骨髓间充质干细胞的分离；8周龄SD大鼠30只，体质量 210-310 g，雌雄不限，用于构建模型。动物生产许可证SCXK(辽)2015-0001，动物使用及处死均通过沈阳医学院实验动物福利伦理委员会的审批，批准文号为SYYXY2016030301。

1.4  实验方法

1.4.1  骨髓间充质干细胞的培养  全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。用颈椎脱臼法将初断乳的2只大鼠处死，体积分数为75%乙醇浸泡3 min，然后无菌条件下分离出双侧股骨、胫骨；去除骨表面附着的软组织并用DMEM培养液浸泡清洗；眼科剪切除两端骨骺，暴露出大鼠股骨及胫骨的骨髓腔，用5 mL注射器吸取DMEM培养液反复冲洗骨髓腔；为确保将骨髓冲出，需反复冲洗待骨髓腔变白后停止，收集细胞冲洗液并过200目筛网制成单细胞悬液；将悬液置于15 mL离心管中，以1 000 r/min离心  5 min；去除上清液，用5 mL新鲜含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，吹打混匀后接种于25 cm²培养瓶中；将培养瓶放入37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中静止培养，隔天全量换液；每隔24 h光学显微镜下观察细胞形态及其贴壁状态，待原代细胞生长至约铺满瓶底时进行传代，吸除培养液，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化细胞，显微镜下观察到绝大多数细胞皱缩变圆时加入DMEM完全培养液以终止消化；将细胞悬液转移至离心管中以1 500 r/min离心    10 min，弃去上清液并添加DMEM完全培养液重悬细胞。

1.4.2  骨髓间充质干细胞的鉴定  待细胞长至70%融合后，吸去培养液，PBS冲洗3次，每次3 min，加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，加入1% Triton X-100 30 μL室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；除去PBS，用油笔圈定细胞范围；加入内源性过氧化酶阻断剂1滴，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；加入非特异性阻断剂1滴，室温孵育10 min；加入1∶200比例稀释的兔抗鼠CD29抗体，置于湿盒中4 ℃过夜，次日PBS洗涤3次，每次3 min；滴加生物素标记的羊抗兔IgG聚合物，室温孵育1 h，PBS冲洗二抗；滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；滴加DAB显色试剂，显微镜下控制反应时间，待细胞着浅棕色时，吸去显色液，用流水冲洗5 min；苏木精复染细胞核，1%盐酸乙醇分化几秒，自来水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。

吉姆萨染色：另取第3代90%融合的细胞爬片，多聚甲醛固定，吉姆萨母液按1∶10的倍数加入蒸馏水混合滴在染色片上染色20 min，弃染色液，PBS漂洗干净，系列乙醇脱水，每次3 min，二甲苯透明，中性树脂封固。

1.4.3  骨髓间充质干细胞的BrdU标记  取培养的第3代骨髓间充质干细胞，将细胞浓度调整为1×10⁸ L^-1，接种于预先放置细胞爬片的6孔板中，在细胞生长至50%融合时加入10 μmol/L BrdU标记液，孵育24 h^[13]。

1.4.4  失神经肌萎缩模型制备  将30只健康8周龄SD大鼠随机分成3组：假手术组、模型对照组和移植治疗组，每组10只。模型对照组和移植治疗组制备失神经肌萎缩模型，采用10%水合氯醛按3 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉，在无菌条件下进行手术。大鼠取俯卧位，固定四肢，在左侧后肢股骨体表投影区域剪毛，碘伏消毒，切开1 cm皮肤，深入肌肉钝性分离，可见大鼠坐骨神经主干，用镊子夹持5 s，逐层缝合，造模手术完成。假手术组以上述相同的制作方法完成，只是在寻找到左后肢坐骨神经主干后，不用镊子夹持神经。

1.4.5  骨髓间充质干细胞的移植  造模后第14天，在无菌条件下于移植治疗组大鼠后肢左侧腓肠肌内注射1.5×  10⁸ L^-1的骨髓间充质干细胞悬液0.2 mL，向模型对照组和假手术组左后肢腓肠肌内注入同等剂量DMEM培养液(不含细胞及胎牛血清)，3 s内完成注射，留针5 min。注射后大鼠常规分笼饲养，以便对大鼠进行抗感染等护理。

1.4.6  行为学BBB评分  骨髓间充质干细胞移植后1，2周，采用BBB评分评价各组大鼠左后肢运动功能。BBB评分共22级。0分为后肢完全瘫痪，21分为功能正常。由2名独立观察者按照BBB运动评定量表观察关节活动的次数和范围、运动负荷及范围、后肢的协调性，采用双盲法对大鼠后肢运动功能进行评分和记录，评分观察时间为4 min，得分范围从0分(无肢体运动或体质量支持)到21分(正常运动)，取2名观察者评分的平均值进行统计学处理。

1.4.7  肌纤维横截面积测量  骨髓间充质干细胞移植后14 d，大鼠常规处死，腓肠肌标本放置于40 g/L多聚甲醛溶液固定24-48 h，沉入30%蔗糖48 h，常规制作冷冻切片。纵向垂直肌纤维的方向将腓肠肌标本制成5 μm切片，进行苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察。采用Image J图像分析系统对肌纤维横截面积及肌纤维直径进行测量^[32]。

1.4.8  腓肠肌免疫组化染色  制作失神经肌萎缩腓肠肌组织冰冻切片。①切片用PBS冲洗2次，每次5 min；②滴加体积分数为3%过氧化氢酶灭活内源性酶，室温下孵育20-30 min，PBS洗3次，每次5 min；③用抗原修复液37 ℃修复抗原30 min，PBS洗3次，每次5 min；④滴加山羊血清封闭液20 min，PBS清洗3次，每次5 min；⑤滴加一抗，即羊抗鼠BrdU单克隆抗体4 ℃过夜，PBS洗3次，每次    5 min；⑥滴加二抗即偶联辣根过氧化酶的羊抗兔二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；⑦DAB显色液显色5 min，显微镜观察至检测指标出现棕色；⑧苏木精复染2 min，自来水冲洗5 min，蒸馏水洗涤，系列乙醇脱水；⑨二甲苯Ⅰ与Ⅱ各5 min，使用中性树胶封固；⑩应用显微镜观察BrdU阳性标记骨髓间充质干细胞在大鼠腓肠肌中的生长情况。

1.5  主要观察指标  ①BBB评分评估失神经肌肉的功能；②苏木精-伊红染色镜下观察并用Image J测量肌纤维直径和面积；③免疫组化染色检测腓肠肌组织中BrdU的表达。

1.6  统计学分析  实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析，SNK法进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

目前骨髓间充质干细胞的鉴定主要根据其形态学特征、表面抗原、超微结构以及多向分化能力等。现在很多研究报道，骨髓间充质干细胞的表面抗原标志具有非专一的特性，主要包括CD106、CD29、CD34、CD36、CD71等，但到目前为止还没有发现骨髓间充质干细胞的特异性表面抗原标志。它具有分化成多种中胚层和神经外胚层来源组织细胞的能力，易于体外培养扩增以及外源基因的转染和表达，其移植后的免疫排斥反应比较微弱，是基因与细胞工程的理想载体。目前的细胞标记示踪技术除了BrdU免疫组织化学法，还包括绿色荧光蛋白、染色体示踪、增强GRP报告基因的转染、激光捕获显微镜及β半乳糖苷酶基因转染细胞标记技术等。BrdU作为胸腺嘧啶的衍生物，其可以替代新合成的DNA单链中的胸腺嘧啶，可选择性地掺入到复制细胞中新合成DNA，这种掺入可以随DNA复制进入子细胞，所以可以稳定存在^[33-35]。骨髓间充质干细胞增殖及分化潜力随供体年龄增大而降低^[36]，因此实验选用初断乳大鼠进行全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，培养至第2代时，观察骨髓间充质干细胞以单层贴壁集束样生长，以梭形细胞为主，呈漩涡状或花簇状，骨髓间充质干细胞生长活跃，增殖能力强，CD29免疫组化染色结果呈阳性，初步判定培养细胞为骨髓间充质干细胞，可继续用于BrdU标记和移植实验。由于BrdU的标记受多种因素影响，例如细胞的增殖、分裂可能对BrdU有稀释作用，移植细胞死亡后释放出来的BrdU被邻近细胞摄取等可导致假阳性，如能用绿色荧光蛋白标记可能更为可靠，但BrdU免疫组织化学法被认为是操作简单易行、技术可靠、结果可信，便于检测的细胞标记示踪技术，无论在体外或者在体内环境下，均能全面、动态地追踪和辨识骨髓间充质干细胞^[37]。因此该实验选用BrdU免疫组织化学法鉴定和评估骨髓间充质干细胞移植后生长情况。为尽可能减少影响，该研究在利用BrdU示踪技术时，依照MEYER等^[38]的经验处理标本。

CUEVAS等^[39]取供体成年大鼠骨髓间充质干细胞，用BrdU进行培养和预标记，注入大鼠坐骨神经横断端，对照组大鼠坐骨神经横断端注入培养液。与对照组相比，骨髓间充质干细胞移植大鼠在第18天和第33天的行走轨迹测试有显著改善；双重免疫荧光标记显示BrdU标记细胞在植入后至少33 d内存活在切断的坐骨神经注射区，近5%的BrdU细胞表达许旺细胞样表型。由于骨髓间充质干细胞注入受损外周神经后能促进功能恢复，可能成为神经系统疾病细胞治疗的重要来源。许旺细胞来自于神经脊细胞的胚胎时期，作为周围神经的一种独特的神经胶质细胞，对神经系统具有重要的影响，尤其是神经再生。许旺细胞可以在神经损伤部位分泌表达一系列的活性物质，如神经生长因子可以诱导髓鞘的形成和神经的再生^[40-43]。

研究发现，在脊髓损伤后即有细胞凋亡，伤后24 h为第1个高峰，伤后7 d出现第2个高峰，无论是神经细胞还是胶质细胞都有凋亡出现。因此造模术7 d后腓肠肌已失去神经支配，开始出现肌肉萎缩现象，待造模14 d左右时失神经肌萎缩效果基本形成。因此该实验选择在造模14 d时进行骨髓间充质干细胞移植治疗。当机体发生失神经损伤时，微循环被破坏，毛细血管的退化比肌纤维的退化更加迅速，从而导致肌纤维与毛细血管的数量较之前更少。随着失神经损伤的时间延长，胶原纤维将变得更加明显，而此时增生的胶原纤维也将阻断肌肉的血液供给。肌肉血供显著减少以及微循环改变是阻碍神经重新支配失神经损伤骨骼肌的重要原因。NAKAMURA等^[44]采用骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗心脏毒素损伤的大鼠胫骨前肌，发现外泌体促进成肌分化与血管再生，虽然成纤维细胞生长因子2、粒细胞集落刺激因子、血小板衍生因子等肌肉修复相关因子水平较低，但却有大量与肌肉修复相关的miRNA产生，进一步研究发现骨髓间充质干细胞来源外泌体促进成肌分化和血管再生的作用一部分是由miR-494介导的^[45]。

大量的研究表明肌肉在失神经后8个月左右，有近4/5的毛细血管发生完全退变^[46]。研究发现体外培养的骨髓间充质干细胞可以产生干细胞因子、基质细胞衍生因子和白细胞介素7等可以改善神经再生的微环境，与许旺细胞共同参与修复受损的神经细胞^[47]。

据有关文献报道，骨髓间充质干细胞移植可抑制脊髓损伤后的神经炎症，减少了炎症前细胞因子的产生，从而促进了损伤的神经再生。然而由于炎症和不利的微环境，这个促再生作用是有限的^[9-10]。在神经炎症中，小胶质细胞和神经胶质细胞十分活跃，释放促炎因子和细胞毒素(前列腺素E2、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β)来造成神经进一步损伤。此外，小胶质细胞和星形胶质细胞在神经炎症过程中被激活，导致病变部位有胶质瘢痕的形成。

骨骼肌的收缩是神经冲动在运动终板传至肌膜时，肌膜发生去极化，冲动传入肌纤维，肌浆网内的钙离子释放，钙离子与Thc结合，经过一系列的传导引发骨骼肌收缩。肌卫星细胞是一类源于中胚层的干细胞，主要存在于基底膜与肌膜之间。在失神经损伤后，肌卫星细胞可以被激活，从而进一步发生增殖。伴随年龄的增长，肌卫星细胞的丰度减少，肌源性的分化和自我更新潜能依旧可以保留，但更新能力随之降低。因此，推测出移植骨髓间充质干细胞通过改善微环境，使纤维间隔变得规整，肌原纤维完整，从而减轻和延缓失神经肌肉组织萎缩。但是，该实验中仍然存在不足，如BrdU标记的时间不足(24 h)，观察时间较为短暂，由于在移植2周后对大鼠进行了处死，所以缺乏对大鼠后续运动功能的研究。

该研究的创新之处在于应用BrdU标记的骨髓间充质干细胞对失神经损伤肌肉进行修复，移植治疗组大鼠BBB评分高于模型对照组，但与假手术组仍有差距。肌纤维苏木精-伊红染色中可以看到移植治疗组肌纤维排列更规整、肌间隔更均匀，肌纤维数量接近假手术组。因此作者推测骨髓间充质干细胞移植后改善了神经、肌肉、血管生长的微环境。骨髓间充质干细胞不仅可通过定向分化为腓肠肌细胞这种直接方式促进肌肉收缩和舒张能力的恢复，还可以通过抑制炎症反应、促进神经细胞再生、促进血管再生等间接方式帮助失神经支配的骨骼肌功能恢复，进而提高大鼠BBB运功功能评分，为今后骨髓间充质干细胞的应用提供了一定的理论基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

失神经肌萎缩：骨骼肌的发生、功能和结构的维持都受到运动神经的支配和调节，神经一旦受损，肌肉失去神经支配，神经传导信号中断，肌肉丧失收缩功能，导致肌肉主动收缩活动障碍，神经受损的同时骨骼肌失去神经的营养作用，逐渐出现骨骼肌的质、量和形态改变，肌肉体积减小，肌纤维逐渐萎缩，并逐渐被结缔组织替代，肌细胞同时也发生一系列变化。

BrdU：细胞增殖是细胞在周期调控因子的作用下，通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等一系列复杂反应而进行的分裂过程，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，可竞争性掺入S期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶，混入到单链DNA中的BrdU可通过免疫组化染色抗BrdU单克隆抗体在细胞爬片或组织切片上显示，从而对骨髓间充质干细胞进行识别和示踪。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

间充质干细胞可通过直接和间接2种方式发挥治疗作用，直接作用方式包括归巢、促进外源干细胞植入患处以及定向分化与多向分化等；间接作用方式有双向调节免疫反应和炎症反应、抗氧化应激、抗纤维化、抗凋亡、造血支持作用、参与或促进血管再生、激活内源干细胞增殖分化及患病组织器官已分化的正常细胞去分化等。间充质干细胞旁分泌作用所产生的血管表皮生长因子、基质细胞衍生因子、碱性纤维细胞生长因子、促血小板生成素、血小板源性生长因子都与血管生成有关。通过自体移植骨髓间充质干细胞来促进失神经肌萎缩结构及功能的恢复将有望成为治疗失神经肌萎缩的主要方式。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程