2.1  自噬抑制剂处理后的标本及手术大体观察  经过72 h 3-甲基腺嘌呤处理后的神经片段在大体观察下和普通培养基处理组没有明显区别，见图1A，B；将3 mm处理后的神经段移植入损伤动物模型(图1C)饲养8周后，大体观察对照组移植部分再生神经直径略细，其余无明显差异，见图1D，E。

2.2  组织学观察

2.2.1  苏木精-伊红染色结果  将术后8周再生神经片段中段横切面及纵切面冰冻切片进行苏木精-伊红染色，横切面中可观察到实验组神经组织完整，未出现明显组织空洞，见图2A，纵切面中可观察到完整髓鞘结构及大量细胞核，见图2B；对照组可观察到明显的组织崩解行程的大面积空洞，依稀可见残留的髓鞘组织结构，细胞核数量明显少于实验组，见图2C，D。

2.2.2  免疫荧光染色结果  将术后8周神经中段切面及纵切面冰冻切片进行免疫荧光染色，神经丝蛋白标记轴突，碱性髓鞘蛋白标记髓鞘。

实验组可观察到大量完整的碱性髓鞘蛋白阳性环状髓鞘结构(图3A2)包裹神经丝蛋白阳性轴突(图3A1)形成神经束(图3A3)，同时在纵切面染色中也可观察到较为完整的轴突(图3B1)及髓鞘结构(图3B2)沿神经纵轴走形，髓鞘围绕轴突，周围有大量有核细胞(图3B3)。对照组不论是横切还是纵切切片中都可观察到大量空洞的形成，有部分轴突及少量髓鞘组织碎片，但难以观察到完整的神经束结构，有核细胞数量较少，见图3C1-C3、D1-D3。

2.2.3  甲苯胺蓝染色结果  取术后8周的术侧及健侧神经组织，截取神经中段做半薄切片进行甲苯胺蓝染色。健侧结果可见均匀分布的有髓神经纤维，髓鞘厚度及轴突直径也较为均一，未见明显神经束膜，见图4A。实验组可见有髓神经纤维和部分再生无髓神经纤维，由神经束膜分割包裹，结构紧密无明显空洞，见图4B。

对照组有少量有髓神经纤维及新生无髓轴突，同样有神经束膜包裹分隔，但数量较少，再生神经束分布稀疏，有大量空洞区域，见图4C。

2.2.4  透射电镜观察  将术后8周双侧神经组织做超薄切片，柠檬酸铅染色后透射电镜下观察。健侧神经组织有髓神经纤维直径大，髓鞘较厚，分布均匀，许旺细胞胞体较小，未见神经束膜结构，见图5A。

实验组可见较多有髓轴突及大量新生无髓轴突，轴突大小直径不一，髓鞘厚度有较明显差异，许旺细胞胞体较大，有多层的神经束膜将数个轴突包绕、分隔形成神经束，神经束之间排列紧密，见图5B。对照组有髓纤维直径较小，分布密度低，髓鞘厚度薄，再生轴突数量少，切神经束之间分布分散，可观察到不明组织碎片，见图5C。

应用ImageJ软件对电镜下的髓鞘厚度、有髓神经纤维直径进行测量，见图5D，E，3组髓鞘厚度分别为(1.267± 0.151)，(0.877±0.231)，(0.628±0.242) μm，健侧髓鞘厚于实验组、对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组厚于对照组(P < 0.05)。3组有髓神经纤维直径分别为(5.590±1.170)，(3.580±1.233)，(2.112±1.546) μm，健侧直径大于实验组、对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组直径大于对照组(P < 0.05)。

2.3  功能学检测  通过术后2，4，6，8周小鼠的足印测量计算出小鼠的坐骨神经指数变化，评估其功能恢复情况，见图6。

图6A-C分别为术后8周时健侧、对照组及实验组的足印示例，可见实验组内趾间距及外趾间距均显著大于对照组，但仍与健侧有较大差距。图6D为两组小鼠坐骨神经指数变化曲线，均随时间延长逐渐增高，前6周两组之间并无差异，第8周时实验组坐骨神经指数高于对照组(-48.51± 4.36，-60.84±4.40，P < 0.05)。

自体神经移植尽管作为周围神经损伤修复的金标准^[1]，其应用仍有许多限制，包括来源有限、供区感觉及功能缺失、神经瘤及瘢痕的形成^[2]、移植物坏死等，且其术后神经功能恢复率仍不足50%^[3-4]，如何提高移植物的成活率及术后功能恢复成为整形修复外科的难点问题之一。

华勒氏变性是周围神经损伤后轴突及髓鞘崩解、细胞碎片吸收的过程，继而调节后续的一系列神经生长因子分泌、细胞免疫反应、损伤后神经瘤形成及神经再生等^[5-6]，但其发生机制尚不完全明确。近年最新的研究表明，华勒氏变性的发生与许旺细胞的自噬活动密切相关，对许旺细胞自噬活动进行调控可显著影响华勒氏变性的发生发展，从而改变后续的轴突再生及髓鞘化过程^[7-9]。课题组总结相关研究结论并提出假设^[10]，对移植神经片段中许旺细胞的自噬活动进行调控，改变其华勒氏变性过程，观察是否能够提高移植物的成活率、促进轴突再生及功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  动物对比观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年10月至2018年12月在中国医学科学院整形外科医院完成。

1.3  材料

实验动物：8周龄C57BL/B6J雌性小鼠24只，体质量20-25 g，购自北京维通利华。动物实验通过北京协和医学院动物伦理委员会批准

实验用试剂：IMDM培养基(Cat.#12440061，Gibco，美国)；胎牛血清(Cat. #10099141，Gibco，美国)；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(Cat.# sc-205596，Santa，美国)；兔多克隆抗体碱性髓鞘蛋白(Abcam，cat: ab40390)；鸡多克隆抗体神经丝蛋白(Abcam，cat: ab4680)。

实验用器材：显微外科器械 (浙江奥斯卡医学仪器公司)；显微外科显微镜 (XTS-4A，中天光学仪器公司)；11-0不可吸收显微外科缝线(宁波灵桥，宁波医用缝针有限公司)；冰冻切片机(Leica CM1900，Leica Microsystems Inc.，美国)；光学显微镜(Olympus BX51，Olympus，日本)；透射电镜(H7650，Hitachi，日本)。

1.4  实验方法

1.4.1  供体坐骨神经片段的获取及处理  将8只8周龄C57BL/6J小鼠分别腹腔注射1%戊巴比妥(0.005 mL/g)麻醉，去除双侧术区毛发，消毒术区，切开皮肤暴露双侧坐骨神经，各取5 mm坐骨神经片段共16条，分为2组，分别置于普通培养基(IMDM+体积分数10%胎牛血清)与自噬移植培养基(IMDM+体积分数10%胎牛血清+20 mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤)中处理72 h。

1.4.2  动物模型构建  将16只8周龄C57BL/6J小鼠分为实验组与对照组，每组8只，按照以上述同样方法暴露左侧坐骨神经，剪掉坐骨神经组织形成3 mm坐骨神经缺损模型，对照组植入普通培养基处理过的供体神经片段，实验组植入自噬移植培养基处理过的供体神经片段，修剪掉两种供体移植片段两端各1 mm组织，将中间3 mm神经片段移植于缺损处，用11-0不可吸收缝线通过显微外科技术缝合。6-0丝线缝合术区皮肤，于同样环境条件下饲养8周。

1.5  主要观察指标

功能学检测：应用纸板搭建长50 cm、宽10 cm的跑道，下方铺垫白纸。术后2，4，6，8周时，将被测小鼠双后足蘸少量墨水，置于跑道中自由跑动，留下双侧足印。每只小鼠取双侧清晰足印各5个，测量其内趾战距、外趾展距和足长。根据公式算出其坐骨神经功能指数^[7]，绘制坐骨神经功能指数变化曲线。

组织学检测：①制备冰冻切片：术后8周时暴露切取再生坐骨神经组织，一部分于4%PFA中固定2 h，于4 ℃ 30%蔗糖溶液中脱水24 h，OCT包埋，制作8 µm厚冰冻再生神经切片；②免疫荧光染色：用PBS清洗冰冻切片表面OCT 3次，每次5 min，后用0.2%Triton+羊血清封闭40 min，加入一抗兔多克隆抗体碱性髓鞘蛋白(1∶200)、鸡多克隆抗体神经丝蛋白(1∶200)，于4 ℃条件下放置12 h。PBS清洗一抗，加入相应二抗(1∶600)，于37 ℃温箱中孵育40 min，DAPI染核，树脂封固；另一部分切片行苏木精-伊红染色及甲苯胺蓝染色，于显微镜下观察记录；③透射电镜：取小鼠的再生神经中段，置于4 ℃戊二醛中24 h，再置于1%锇酸中处理   2 h，梯度脱水，环氧树脂包埋。制备70 nm厚超薄切片，柠檬酸铅染色，透射电镜下观察有髓神经鞘，每个组织随机测量200有髓神经鞘厚度进行统计分析。

1.6  统计学分析  应用Excel、SPSS及Graphpad软件进行数据整理与统计分析，数据均以x(_)±s的形式表现。其中髓鞘厚度通过Mann-Whitney U 检验及Kruskal-Wallis 1-way ANOVA进行多重比较。其余数据应用Student’s t 检验，应用Scheffe’s post hoc检验用于比较不同组间差异性。P < 0.05为差异有显著性意义。

周围神经损伤后发生以轴突崩解、髓鞘结构破坏、炎症细胞浸润等一系列病理变化过程为中心的华勒氏变性，既往研究认为这一过程是通过炎症反应引发的^[12-14]，然而2015年GOMEZ-SANCHEZ等^[7]通过小鼠坐骨神经损伤模型的研究证明，损伤后许旺细胞的自噬作用才是引发华勒氏变性的关键。在周围神经受到损伤后，许旺细胞中的JNK/c-Jun通路被激活，PI3K形成，继而引发孤立膜结构及自噬小体的形成^[15-16](图7)。3-甲基腺嘌呤可以和Beclin蛋白结合，抑制PI3K及自噬小体的形成，从而抑制细胞自噬过程及华勒氏变性的发生^{[9，15，17]}。

同种异体神经移植还面临免疫排斥的问题，许多研究通过免疫抑制剂、冻融脱细胞等方式来降低免疫排斥过程^[18-19]，而这些方法同时会降低移植片段的生物活性。大量研究表明华勒氏变性与移植后的免疫反应密切相关^[20-22]，或许能在不影响细胞活性的条件下调节华勒氏变性的同时影响免疫抑制过程，从而使异体神经移植成为可能。课题组通过将3-甲基腺嘌呤处理与普通培养基处理的神经片段移植修复小鼠坐骨神经缺损，对比其修复效果。实验结果显示经3-甲基腺嘌呤处理的神经段移植后，其组织结构能更好的保留，髓鞘形态更为完整，能为再生的轴突提供较好的生长环境与引导支架，有效帮助了损伤后神经轴突的再生与髓鞘化形成^[23]；未经3-甲基腺嘌呤处理神经片段移植后发生了明显的组织崩解和吸收，有核细胞数量减少，髓鞘结构失去完整性，大面积空洞形成，不利于新生轴突的延伸。同时在功能学检测中，虽然前期两组间无差异，但术后8周时实验组运动功能恢复优于对照组，推测随着观察时间的延长，小鼠功能恢复的差异将会更加显著，但由于动物模型数量的限制暂时没有进行更长期的观察，这一部分将考虑在后续实验中进行完善补充。由于华勒氏变性过程中会产生大量的神经生长因子(神经生长因子、胰岛素样生长因子、脑源性神经营养因子等)与细胞外泌素^[24-25]，作者担心抑制许旺细胞的自噬过程有可能会抑制这些细胞因子的分泌，从而对后续再生过程产生不利影响，但这一猜想并未得到证实，因此也将在后续研究中对自噬抑制后神经片段中的相关细胞因子进行定量检测，评估自噬抑制对这一过程的影响。此外在过去的研究中，神经系统中的细胞自噬与免疫排斥反应^[26-27]、神经瘤形成^[28-29]、神经性疼痛等均密切相关^[30]，后续将补充包括对炎性细胞及自噬过程中具体相关蛋白的检测，更加深入探讨细胞自噬在神经损伤及再生中的作用机制。

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文题释义：
细胞自噬：指细胞在受到创伤、饥饿、缺氧、感染等应激状态下的一种自我保护机制，这一过程可以无选择性地发生于所有真核细胞中，真核细胞通过自噬作用清除老化的细胞器和蛋白，以此来维持细胞生长发育的平衡。自噬过程主要的诱发因素是饥饿，即细胞营养物质的缺乏，此外也可通过一些感染、损伤、特定的蛋白如热休克蛋白、细胞因子等选择性地引发。
华勒氏变性：是指周围神经损伤后，残留的轴突及髓鞘结构迅速发生退化、崩解、吸收的过程。这一复杂过程有多种细胞因子及炎症细胞参与，是周围神经损伤后最重要的病理变化过程之一，影响损伤后续的修复再生。

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研究通过对国内外相关许旺细胞自噬的研究结果，大胆提出猜想，通过对许旺细胞自噬的抑制作用是否能够减少移植神经片段的崩解吸收过程，提高移植神经片段的存留率，从而改善同种异体神经片段移植后的修复情况。随后应用显微外科技术及相关神经功能学的检测技术，通过体内外的相关实验证实了这一假设，为神经移植修复周围神经损伤这一领域提供了新的思路。

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