人羊膜修复急性坐骨神经损伤模型大鼠

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1073

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
人羊膜：是羊膜腔内表面的一层薄膜，厚度为0.02-0.5 mm，由5层无血管、无淋巴和神经系统的膜性结构组成，5层结构由内到外分别为上皮细胞层、基底层、固有层、成纤维细胞层、海绵层。人羊膜具有免疫原性低，可以减少瘢痕形成，抑制炎性反应，抗血管生成等作用。羊膜可以抑制损伤组织中细胞因子白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子的表达，从而能够减少肉芽及瘢痕组织的形成。
坐骨神经钳伤损伤模型：神经钳伤后，神经轴索断裂，但神经内膜、束膜及内膜连续性存在，神经轴浆流不能通过损伤节段，冲动可以通过周围的膜性结构发生容积性传导，所以造模成功后坐骨神经的传导速度及幅度均较正常下降，表明造模成功。

摘要
背景：人羊膜具有免疫原性低、可以减少瘢痕形成、抑制炎性反应、抗血管生成等作用。
目的：观察人羊膜对坐骨神经急性损伤修复与再生的作用。
方法：选用成年雌性SD大鼠(河北医科大学实验动物中心提供)90只，制备坐骨神经急性损伤模型，随机分为羊膜组、几丁糖组、空白对照组，每组30只。羊膜组坐骨神经损伤处用新鲜羊膜包裹，羊膜两端各缝合1针固定；几丁糖组坐骨神经损伤处近端用9-0无创缝线做标记，损伤神经周围注入约0.5 mL医用几丁糖凝胶；空白对照组坐骨神经钳夹处近端用9-0无创缝线做标记，不用任何材料处理。术后进行大体、光镜、透射电镜观察以及轴突图像分析和神经电生理检测。
结果与结论：①大体、光镜、透射电镜观察显示：与空白对照组相比，羊膜组大鼠术后肢体肿胀较轻，神经充血水肿轻，与周围组织粘连轻，炎性反应小，成纤维细胞及新生血管少，许旺细胞内细胞器增生活跃，成纤维细胞及胶原产生少，修复时程短，与几丁糖组差别不大；②轴突图像分析显示：羊膜组和几丁糖组髓鞘厚度及有髓纤维直径大于空白对照组(P < 0.05)；③神经电生理检测显示：3组神经传导速度比较无明显差异，3组之间波幅比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，羊膜组和几丁糖组潜伏期均短于空白对照组(P < 0.05)；④结果表明，羊膜可为神经修复提供相对稳定微环境，减少粘连，抑制炎性反应，促进神经修复与再生，获得较好的治疗效果。羊膜在体内存留时间长，有利于神经再生和微环境的维持，利于神经再生与功能恢复，羊膜要优于几丁糖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-1229-6518(曹鹏)

关键词: 周围神经损伤, 坐骨神经, 神经再生, 人羊膜, 几丁糖, 髓鞘厚度, 有髓纤维直径, 神经传导速度, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Human amniotic membrane with low immunogenicity can reduce scar formation, inhibit inflammation and prevent angiogenesis.
OBJECTIVE: To observe the effect of human amniotic membrane on repair and regeneration process after acute nerve injury.
METHODS: Ninety adult male Sprague-Dawley rats provided by Laboratory Animal Center of Hebei Medical University were used for establishing the models of acute sciatic nerve injury and then randomly divided into amniotic membrane (nerve entrapment with amniotic membrane), chitosan (nerve entrapment with chitosan gel) and blank control (without any treatment) groups (n=30 per group). Gross, light microscope and transmission electric microscope observations, axon image analysis and electrophysiological examination were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: Gross, light microscope and transmission electric microscope observations revealed: compared with the blank control group, the mild limb swelling, neurohyperemia, and edema were observed in the amniotic membrane group. In addition, the adhesion with the surrounding tissue was mild in the amniotic membrane group, the inflammatory reaction was mild and there were few fibroblasts and newborn capillaries. In the amniotic membrane group, function of organelles was active, there were few fibroblasts and less collagen, and the repair time was short, which were similar with the chitosan group. The axon image analysis showed that thickness of the myelin sheath and the diameter of myelinated fibers in the amniotic membrane and chitosan groups were superior to those in the blank control group (P < 0.05). Neurophysiological stimulation showed that there was no significant difference in the nerve conduction velocity among groups. The amplitude was significantly different among groups (P < 0.05). The latent period in the amniotic membrane and chitosan groups was significantly shorter than that in the blank control group (P < 0.05). To conclude, amniotic membrane can provide a relatively stable microenvironment for nerve repair, reduce adhesion, inhibit inflammatory reaction, promote the repair and regeneration of nerve, and show good therapeutic effect. Amniotic membrane has a long retention time in vivo, which is beneficial to nerve regeneration and microenvironment maintenance, and contributes to the recovery of nerve function. Therefore, amniotic membrane is better than the chitosan.

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Key words: Sciatic Nerve, Nerve Regeneration, Amnion, Tissue Engineering

中图分类号:

曹鹏，王皓楠，田伟峰，孙乃超，白江博，于昆仑，田德虎. 人羊膜修复急性坐骨神经损伤模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1046-1051.

Cao Peng, Wang Haonan, Tian Weifeng, Sun Naichao, Bai Jiangbo, Yu Kunlun, Tian Dehu. Human amniotic membrane repairs acute sciatic nerve injury in rat models[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(7): 1046-1051.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 SD大鼠90只，随机分为3组，每组30只，均进入结果分析。

2.2 大体观察结果术后3组大鼠伤口均未见感染，无足底溃疡，未见自噬现像，Ⅰ期愈合。

术后1周大鼠左下肢均出现肿胀，拖地现象，肌力差，刺激无收缩，未出现明显缩足及舔足动作。精神状态较差，饮食及尿便较前减少明显。下肢肿胀逐渐减轻，至术后8周羊膜组和几丁糖组跛足现象消失，对外界刺激出现明显缩足及舔足，空白对照组仍有跛足现象，对外界刺激感觉差。术后12周，大鼠对外界刺激敏感，空白对照组稍差。

各组大鼠神经周围恢复情况，见图1。

术后1，2周，3组大鼠损伤段神经压迹清晰可见，损伤神经菲薄，神经外膜充血，羊膜组和几丁糖组神经与周围组织粘连不明显，空白对照组神经与周围组织有薄膜性的粘连。术后4，8周，神经及周围组织充血水肿减轻，损伤段神经较前增粗，羊膜组及几丁糖组外膜充血基本消退，与周围组织粘连较疏松，空白对照组神经外膜充血较明显，质地较硬，与周围组织粘连较致密。羊膜大部分吸收，几丁糖完全吸收。术后12周，神经及周围组织未见明显充血水肿，损伤段神经增粗，接近正常，神经外膜充血消失，羊膜组和几丁糖组神经与周围组织粘连较疏松，羊膜完全吸收，空白对照组与周围组织粘连广泛而致密，钝性分离困难。

2.3 光镜观察结果见图2。

术后1，2周，3组神经排列紊乱，失去正常形态，髓鞘肿胀，可见大量脱髓鞘的神经，视野内出现大量炎性细胞，可见巨噬细胞，其中羊膜组和几丁糖组炎性细胞较少，空白对照组炎性细胞较多。术后4周，羊膜组和几丁糖组神经髓鞘部分恢复正常形态，可见大量许旺细胞。3组神经炎症细胞较前均有所减少，羊膜组和几丁糖组减少更加明显，空白对照组神经细胞大部分未恢复正常形态，炎症细胞仍较多。术后8周，羊膜组和几丁糖组神经排列整齐，炎症细胞明显减少，可见散在许旺细胞核，可见新生毛细血管。空白对照组炎性细胞较多。术后12周，3组神经均恢复正常形态，羊膜组和几丁糖组神经束间较为疏松，空白对照组神经束间较为致密。

2.4 透射电镜观察结果见图3。

术后2周，羊膜组和几丁糖组可见髓鞘融合、肿胀、空化，髓鞘不整齐，许旺细胞肿胀，核周系扩张，胞质肿胀，线粒体空泡化，未见明显成纤维细胞。空白对照组可见明显脱髓鞘反应，髓鞘板层结构剥离，髓鞘结构不规则，向内增生，许旺细胞内线粒体空泡化，嵴和膜溶解消失，内质网脱颗粒，核周系扩张，线粒体致密化。偶可见成纤维细胞包裹轴突。术后4周，羊膜组和几丁糖组髓鞘较规则，脱髓鞘反应减少，成纤维细胞及胶原纤维较少，细胞器较空白对照组多。空白对照组髓鞘欠规则，仍可见较多脱髓鞘反应，可见大量成纤维细胞和胶原纤维增生，粗面内质网较多，游离核糖体较发达，线粒体损伤较前减轻。术后8周，羊膜组及几丁糖组成纤维细胞少，轴突排列整齐，粗细较一致，轴突层板较清晰。空白对照组轴突排列较整齐，成纤维细胞和胶原纤维减少。偶可见损伤髓鞘。

上述结果显示，羊膜组和几丁糖组神经修复过程早于空白对照组，羊膜组与几丁糖组无明显差异。

2.5 轴突图像分析见图4和表1。术后12周对3组大鼠坐骨神经进行锇酸染色，并在高倍视野下进行有髓神经计数，测量有髓神经髓鞘厚度及直径，羊膜组和几丁糖组较空白对照组神经髓鞘厚，神经纤维直径粗，成熟度好，有髓神经计数并无明显差异。

2.6 神经电生理检测结果见表2。术后12周，对3组大鼠进行肌电图检查，测定神经传导速度、波幅及潜伏期，结果显示：3组间传导速度差异无显著性意义；羊膜组波幅高于几丁糖组，几丁糖组波幅高于空白对照组；羊膜组潜伏期要短于几丁糖组和空白对照组，几丁糖组和空白对照组间差异无显著性意义。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年9至12月在河北医科大学第三医院动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物成年雌性SD大鼠90只，体质量150- 200 g，由河北医科大学实验动物中心提供。用编号标记后随机分成羊膜组、几丁糖组、空白对照组，每组30只。

1.3.2 实验仪器显微手术器械、显微带线缝合针(浙江宁波成和显微器械厂)；FSB013德国目乐显微镜(德国麦迪塞姆仪器有限公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；电子天平(德国SARTORJUS公司)；数码照相机(日本Canon公司)；石蜡切片机、超薄切片机(德国Leica公司)；Viking Quest型肌电诱发仪(美国Nicolet公司)；H-7500透射电子显微镜(日本HITACHI公司)；非吸收性外科缝合线(南通华利康医疗器械有限公司)；DP73数码显微照相装置(日本Olympus公司)；游标卡尺(北京第二精密量具厂)；16 cm全齿血管弯钳(上海医疗器械(集团)有限公司)。

1.3.3 实验试剂及用品生理盐水(石家庄制药集团)；戊巴比妥钠、40 g/L多聚甲醛、4%戊二醛(武汉谷歌生物有限公司) ；医用几丁糖凝胶(石家庄亿生堂医用品有限公司)；兔S-100单克隆抗体(美国Abcam 公司)；通用SP试剂盒(北京中杉金桥生物制剂有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分离羊膜术前征得剖腹产产妇同意，并确认产妇术前各项检查正常。在剖腹产产妇胎盘上取下羊膜，无菌操作下用500 mL PBS冲洗净血迹，然后在改良PBS内浸泡15 min，500 mL PBS冲洗，在净化台上将上皮面朝上平铺于乙酸纤维素薄膜上，裁成1 cm×2 cm大小，放置于改良DMEM培养液，4 ℃冰箱中储存，24 h内应用。

1.4.2 实验动物模型建立 SD大鼠于术前8 h禁食水，1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射，麻醉满意后，取俯卧位，四肢伸直固定于手术台上，常规给予左后肢备皮，碘伏消毒。取左后肢股后正中切口，依次切开皮肤、皮下组织，从股二头肌和半腱肌、半膜肌肌间隙分离并暴露坐骨神经。在梨状肌下缘1 cm处(定位)，用同一把新的16 cm全齿血管弯钳在同一部位钳夹坐骨神经，钳压3扣，维持 5 s，松开，同样操作重复3次，每次间隔10 s(定时定量)。神经干钳伤宽度2 mm，受损处神经干菲薄，连续性存在。彻底止血后，用生理盐水冲洗伤口。羊膜组坐骨神经损伤处用新鲜羊膜包裹，羊膜两端各缝合1针固定；几丁糖组坐骨神经损伤处近端用9-0无创缝线做标记，损伤神经周围注入约0.5 mL医用几丁糖凝胶；空白对照组坐骨神经钳夹处近端用9-0无创缝线做标记，不用任何材料处理。创口处注入硫酸庆大霉素注射液约0.4 mL预防感染。关闭肌间隙，缝合皮肤，术毕。

所有手术操作均在无菌条件下进行，均为同一术者与同一助手协同完成。术后4周，随机抽取实验动物6只，每组2只，神经电生理检测示左坐骨神经出现失神经电位，神经传导速度较健侧降低约1/3，波幅降低为健侧的1/2左右。损伤段神经病理学显示不同程度脱髓鞘改变，神经外膜连续性存在，造模成功。

术后大鼠患肢伤口给予碘伏消毒，术后7 d拆除缝线。实验动物继续分笼饲养，任其自由活动。以下大体观察、光镜观察、电镜观察每组每个时间点取3只大鼠，均采用同1只大鼠的神经；轴突图像分析术后12周每组取5只大鼠，神经电生理检测术后12周每组取5只大鼠。

1.4.3 大体观察术后观察大鼠的步态、体质量、食欲、伤口恢复情况，注意观察患肢是否出现溃疡以及后肢肌肉萎缩情况。为防止大鼠自噬，将苦味酸涂于患足。于术后1，2，4，8，12周暴露损伤段神经，观察羊膜及几丁糖吸收情况、神经与周围组织粘连情况。

1.4.4 光镜观察组织学改变术后1，2，4，8，12周于受损神经损伤段远端0.2 cm处取长0.5 cm神经段，近端切口垂直于神经纵轴，远端切口为斜形(以区分远近端)，将标本放于40 g/L多聚甲醛溶液固定48 h，给予包埋，切片(横切)，苏木精-伊红染色，在光镜下行组织学观察。

1.4.5 透射电镜观察损伤神经超微结构术后2，4，8周于损伤段远端0.2 cm处取长0.5 cm神经段，4%戊二醛溶液固定，四氧化饿溶液后固定，漂洗，梯度乙醇或丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片。透射电镜下观察神经损伤及修复过程中细胞器、髓鞘板层变化。

1.4.6 轴突图像分析有髓神经纤维数目、有髓神经直径及髓鞘厚度术后12周于损伤段神经远端0.2 cm处取长 0.5 cm神经段，迅速置入4%戊二醛中固定24 h，PBS冲洗，四氧化锇溶液浸泡，PBS冲洗，梯度乙醇脱水，树脂包埋，切片，光镜下观察，随机抽取5个视野，用图像分析软件计算每高倍视野下有髓神经纤维数目、有髓神经直径及髓鞘厚度。

1.4.7 神经电生理检测复合肌肉动作电位术后12周暴露大鼠左后肢坐骨神经，在三头肌肌腹中插入记录电极，在损伤神经段的近端及远端分别放置电极，且远、近端放置电极的距离大于5 mm，参考电极距记录电极5 mm，用Viking Quest型肌电诱发仪进行复合肌肉动作电位检测，刺激量为5.0 mA，刺激时间为0.2 ms，刺激频率为1 Hz，连接计算机记录潜伏期、波幅和神经传导速度及图形。

1.5 主要观察指标 ①大体观察神经吻合口与周围组织粘连程度，神经吻合口瘢痕形成情况及神经的活动程度；②光镜下观察神经吻合口周围爆炸性细胞浸润、再生神经结构等；③透射电镜观察神经纤维再生、髓鞘板层开关及其排列情况、细胞器的活跃程度；④再生有髓纤维数目、轴突直径及髓鞘厚度；⑤坐骨神经干诱发电位的波幅、潜伏期和神经传导速度。

1.6 统计学分析数据处理采用SPSS 21.0统计学软件进行统计。采用单因素方差分析进行方差齐性检验，全部数据用x(_)±s表示，组间两两比较用SNK-q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。图像分析采用Image Pro Plus6.0软件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

人羊膜作为一种产后“废弃”产物，来源广泛，取材方便，且满足伦理学要求，又具有防粘连等多种特性，越来越成为应用的焦点。人羊膜是羊膜腔内表面的一层薄膜，厚度为0.02-0.5 mm，由5层无血管、无淋巴和神经系统的膜性结构组成，5层结构由内到外分别为上皮细胞层、基底层、固有层、成纤维细胞层、海绵层^[5-7]。人羊膜具有免疫原性低，可以减少瘢痕形成，抑制炎性反应，抗血管生成等作用^[8-9]。羊膜可以抑制损伤组织中细胞因子白细胞介素1、肿瘤坏死因子α和血管内皮生长因子的表达，从而能够减少肉芽及瘢痕组织的形成^[10-11]。人羊膜上皮细胞可以分泌诸如胶质细胞源性神经营养因子、表皮生长因子、转化生长因子等^[12]，具有营养神经元、促进轴突再生及轴突髓鞘化的功能，还可以使神经元免受毒素损害^[13]。更重要的是，人羊膜上皮细胞是一种具有多向分化潜能的干细胞^[14]，不仅可以分化成骨、软骨、脂肪和肌细胞，还可分化成为神经细胞^[15]。在临床实践中，羊膜用于治疗腹部和盆腔粘连^[16-17]、阴道重建、眼外科手术^[18-19]，治疗慢性皮肤溃疡和烧伤^[20-21]，但是羊膜对神经修复的研究较少。几丁糖目前已应用于临床预防组织粘连，效果显著，该实验在受损神经周围注入几丁糖，做为阳性对照组^[22-23]。

神经钳伤是一种经典的实验性周围神经损伤模型，钳夹后神经轴索断裂，但神经内膜、束膜及内膜连续性存在，神经轴浆流不能够通过损伤节段，冲动可以通过周围的膜性结构发生容积性传导，所以造模成功后坐骨神经的传导速度及幅度均较正常下降，表明造模成功^[24]。轴索断裂后，轴浆运输被阻断，轴索断端处局部钙离子浓度增加，激活钙离子依赖的蛋白水解酶，导致细胞骨架崩解，损伤远端发生脱髓鞘改变。神经损伤24 h后，吞噬细胞开始汇聚到损伤部位，吞噬变性的轴突碎片，造成有利于轴突再生的环境。与此同时，许旺细胞也开始分裂增殖，一方面协同巨噬细胞清理轴突碎片，一方面形成Bungner带，为再生的轴芽提供向远端推进的通道和支架，并且分泌多种神经营养因子，调节神经再生修复过程^[25-28]。在损伤轴突的近端，其损伤与修复过程与远端相同，只是方向相反，由损伤端向胞体方向进行。随后，损伤轴索的近端形成锥形轴芽，沿着许旺细胞形成的Bungner带向远端再生，直至达到靶器官，轴突髓鞘化，完成再生过程。

多种因素均可影响周围神经的修复与再生过程，除了神经元自身的生长能力和周围再生微环境，局部瘢痕粘连尤为重要。神经损伤后，会诱导产生水肿，导致成纤维细胞和巨噬细胞进入神经，形成纤维化。炎性细胞浸润，新生毛细血管和成纤维蛋白最终形成瘢痕组织。损伤神经段形成的瘢痕与周围组织粘连，形成新的卡压，影响神经的再生与修复^[29-30]。

实验建立大鼠坐骨神经钳夹模型^[31-33]，应用羊膜、几丁糖包裹损伤的坐骨神经，观察羊膜对神经修复与再生的作用。通过大体和光镜观察发现，羊膜组炎症反应少，粘连较轻，提示羊膜可以抑制炎症反应，减少损伤神经与周围组织粘连，这说明羊膜在神经周围建造一个保护性鞘管，降低炎症反应，减少神经与周围组织的粘连^[34]。研究表明，羊膜的抗粘连作用不仅是因为机械屏障作用，还与其主动分泌抗炎因子白细胞介素10有关，可以减少瘢痕形成^[35]。透射电镜下观察发现术后4周羊膜组神经纤维排列较规则，脱髓鞘反应少见，细胞器损伤轻，术后8周轴突排列整齐，成纤维细胞和胶原纤维减少，可能是羊膜中所分泌的生长因子加快了神经的修复。轴突图像分析可以客观地显示神经修复的程度^[36]，3组之间的有髓神经计数差异无显著性意义(P > 0.05)，但羊膜组有髓神经髓鞘厚，直径粗，成熟度要好，相对于其他两组差异有显著性意义(P < 0.05)。肌电图是神经功能恢复的重要客观指标^[37-38]，实验结果显示，3组间传导速度差异无显著性意义；羊膜组波幅高于几丁糖组，几丁糖组波幅高于空白对照组；羊膜组潜伏期要短于几丁糖组和空白对照组，几丁糖组和空白对照组间差异无显著性意义，说明羊膜组神经功能状态要优于空白对照组。

结论：羊膜可为神经修复提供相对稳定微环境，减少粘连，抑制炎性反应，促进神经的修复与再生，获得较好的治疗效果。羊膜在体内存留时间长，有利于神经再生和微环境的维持，利于神经再生与功能恢复，在这点上羊膜要优于几丁糖。该实验为羊膜治疗周围神经损伤提供了理论依据和动物实验基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程