过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0570

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (7): 1041-1045.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0570

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过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化

黄红1，黄佳纯2，黄宏兴3，王吉利2，刘少津2，汪悦东2

(1广州中医药大学护理学院，广东省广州市 510006；2广州中医药大学，广东省广州市 510006；3广州中医药大学附属骨伤科医院，广东省广州市 510240)

收稿日期:2018-06-28 出版日期:2019-03-08 发布日期:2019-03-08
通讯作者: 黄宏兴，博士，教授，广州中医药大学附属骨伤科医院，广东省广州市 510240
作者简介:黄红，女，1970年生，广东省韶关新丰县人，汉族，高级实验师，主要从事护理技能教学实验管理工作。
基金资助:
国家自然科学基金(81674004)，项目负责人：黄宏兴；国家自然科学基金(81302991)；国家自然科学基金(81373653)，项目负责人：黄宏兴

Proliferation and differentiation of MG63 cells transfected with recombinant adenovirus vector overexpressing estrogen-related receptor alpha after silencing Bak1 and Bcl2

Huang Hong1, Huang Jiachun2, Huang Hongxing3, Wang Jili2, Liu Shaojin2, Wang Yuedong2

(1School of Nursing, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 2Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 3Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China)

Received:2018-06-28 Online:2019-03-08 Published:2019-03-08
Contact: Huang Hongxing, MD, Professor, Orthopedic Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510240, Guangdong Province, China
About author:Huang Hong, Senior experimentalist, School of Nursing, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81674004 (to HHX), 81302991 and 81373653 (to HHX)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
雌激素相关受体：属于核受体超家族。是第一个发现的孤儿核受体，包括雌激素相关受体α，雌激素相关受体β和雌激素相关受体γ3种类型。雌激素相关受体的生物学功能主要体现在以不同的方式参与雌激素信号途径，雌激素相关受体与雌激素受体在骨骼组织和乳腺组织中拥有共同的靶基因。
腺病毒：腺病毒是DNA病毒，不插入细胞基因组，不形成稳定转染，其瞬时表达能力一般为2-4周，细胞增殖越快，表达时间越短，并且由于不会随机插入损伤基因组，相比较慢病毒，腺病毒对体外培养的目的细胞毒性较小。

摘要
背景：雌激素缺乏是绝经后骨质疏松症的主要发病机制，而关于雌激素相关受体α(estrogen-related receptor alpha，ERRα)与骨质疏松症的相关性研究较少，ERRα在骨质疏松症中的具体作用及其机制在目前尚不明确。
目的：研究过表达ERRα对沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染的MG63细胞和相关蛋白的影响。
方法：构建过表达ERRα和沉默Bak1、Bcl2腺病毒载体，将培养好的MG63细胞分成空载病毒组、Ad-shBak1组、Ad-shBcl2组、Ad-shBak1+shBcl2组，过表达ERRα进行干预。 MTT法检测细胞增殖，考马斯亮蓝蛋白定量检测碱性磷酸酶活性，流式法测定钙离子浓度，Western blot法分析骨调节蛋白(骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、肿瘤坏死因子α)的表达。
结果与结论：①与空载病毒组对比，Ad-shBak1组的细胞活性、碱性磷酸酶活性均升高，钙离子浓度降低，各骨调节蛋白除肿瘤坏死因子α降低外，其余均升高；Ad-shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性、结缔组织生长因子均降低，但无显著性意义(P > 0.05)，钙离子浓度、骨形态发生蛋白4、Runt相关转录因子2均降低，骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α显著升高(P < 0.01)；Ad-shBak1+shBcl2组的细胞活性、碱性磷酸酶活性稍升高，钙离子浓度稍降低，各骨调节蛋白水平均升高，但差异不明显(P > 0.05)；②与Ad-shBcl2组比较， Ad-shBak1组与Ad-shBak1+shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性升高，钙离子浓度显著降低，除肿瘤坏死因子α水平显著降低外，其余骨调节蛋白水平显著升高(P < 0.01或P < 0.05)；③结果提示，过表达ERRα可提高重组腺病毒Bak1转染后的MG63细胞增殖和碱性磷酸酶活性，降低钙离子浓度，且对骨调节蛋白有一定影响作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9177-8106(黄红)

关键词: 骨质疏松, 雌激素受体α, ERRα, 基因沉默, Bak1, Bcl2, 细胞转染, 腺病毒, 骨调节蛋白, 凋亡蛋白, 国家自然科学基金, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Estrogen deficiency is the main pathogenesis of osteoporosis in postmenopausal women, but there are few researches on the correlation between estrogen-related receptor α (ERRα) and osteoporosis. Little is known about their mechanisms of action.
OBJECTIVE: To investigate the effect of adenoviral overexpression of ERRα and silencing of Bak1/Bcl2 in MG63 cells.
METHODS: Adenovirus vector overexpressing ERRα and silencing of Bak1/Bcl2 was constructed. MG63 cells were divided into blank control, Ad-shBak1, Ad-shBcl2, and Ad-shBak1+shBcl2 groups. MG63 cells of different groups were infected by ERRα, Bak1, and Bcl2 overexpressing recombinant adenovirus. The cell proliferation was detected by MTT assay. The alkaline phosphatase activity was measured by Coomassie brilliant blue method. The Ca2+ concentration was detected by flow cytometry. The expression levels of related bone-regulating proteins (bone morphologic protein 4, connective tissue growth factor, osteopontin, Runt 2 and tumor necrosis factor α) were tested by western blot assay. .
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, the cell viability and alkaline phosphatase activity were significantly increased and Ca2+ concentration was significantly decreased, bone morphologic protein 4, connective tissue growth factor, osteopontin and Runt 2 were increased, and tumor necrosis factor α was decreased in the Ad-shBak1 group. The cell viability, alkaline phosphatase activity and connective tissue growth factor level were decreased, but not significant in the Ad-shBcl2 group (P > 0.05). In the Ad-shBcl2 group, the Ca2+ concentration, bone morphologic protein 4, and Runt 2 were significantly decreased, osteopontin and tumor necrosis factor α were significantly increased (P < 0.01). In the Ad-shBak1+shBcl2 group, the cell viability and alkaline phosphatase activity were increased, Ca2+ concentration was decreased, and level of each protein was increased (P > 0.05). Compared with the Ad-shBcl2 group, in the Ad-shBak1 and Ad-shBak1+shBcl2 groups, the cell viability and alkaline phosphatase activity were significantly increased, Ca2+ concentration was significantly decreased, bone morphologic protein 4, connective tissue growth factor, osteopontin and Runt 2 were increased, and tumor necrosis factor α was significantly decreased (P < 0.01 or P < 0.05). Our findings suggest that the overexpression of ERRα can increase the MG63 cell proliferation and alkaline phosphatase activity after transfection by Bak1 recombinant adenovirus, decrease Ca2+ concentration, and also has certain effects on related bone regulating proteins.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoporosis, Postmenopausal, Estrogen Receptor alpha, Adenoviridae, Tissue Engineering

中图分类号:

黄红，黄佳纯，黄宏兴，王吉利，刘少津，汪悦东 . 过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1041-1045.

Huang Hong1, Huang Jiachun2, Huang Hongxing3, Wang Jili2, Liu Shaojin2, Wang Yuedong2 . Proliferation and differentiation of MG63 cells transfected with recombinant adenovirus vector overexpressing estrogen-related receptor alpha after silencing Bak1 and Bcl2[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(7): 1041-1045.

图/表（结果） 1

2.1 Ad-ERRα对各组MG63细胞增殖、碱性磷酸酶活性、钙离子浓度的影响与空载病毒组比较，Ad-shBak1组细胞活性、碱性磷酸酶活性明显升高，钙离子浓度明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；与空载病毒组比较， Ad-shBcl2组细胞活性、碱性磷酸酶活性均降低，但降低幅度不明显(P > 0.05)，钙离子浓度明显升高，差异有显著性意义(P < 0.01)；与空载病毒组比较，Ad-shBak1+shBcl2组的细胞活性、碱性磷酸酶活性稍有升高，钙离子浓度稍有降低，但差异无显著性意(P > 0.05)；与Ad-shBcl2组比较，Ad-shBak1组与Ad-shBak1+shBcl2组碱性磷酸酶活性、Ad-shBak1组的细胞活性升高，钙离子浓度明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)， Ad-shBak1+shBcl2组细胞活性显著升高(P < 0.05)；与Ad-shBak1组比较， Ad-shBak1+shBcl2组的细胞活性、碱性磷酸酶活性显著降低，钙离子浓度明显升高(P < 0.01)，见图1。

2.2 Ad-ERRα干预Bak1、Bcl2重组腺病毒转染的各组MG63细胞中骨调节蛋白的影响与空载病毒组比较， Ad-shBcl2组骨形态发生蛋白4、Runt相关转录因子2均降低，而骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α升高，差异有显著性意义(P < 0.01)，结缔组织生长因子虽然也降低，但无显著性意义(P > 0.05)；与空载病毒组比较，Ad-shBak1组骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2均升高，而肿瘤坏死因子α降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；Ad-shBak1+ shBcl2组骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、肿瘤坏死因子α均升高。差异有显著性意义(P < 0.01)。与Ad-shBcl2组比较，Ad-shBak1组和shBcl2组骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2均升高，而肿瘤坏死因子α降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；与Ad-shBak1组比较，Ad-shBak1+shBcl2组骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白均降低，肿瘤坏死因子α升高(P < 0.01)，Runt相关转录因子2也升高，但差异不明显(P > 0.05)，见图2。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外观察实验。

1.2 时间及地点于2015年1月至7月在广州中新壮生物技术有限公司完成。

1.3 材料

实验用主要试剂：人成骨肉瘤细胞(MG63)(中国科学院上海细胞所细胞库)；Lipofectamine 2000、TRIzol 试剂、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒、One Shot® Stbl3^TME. coli感受态细胞、bP Clonase II enzyme mix、LR Clonase II enzyme mix、Taq DNA聚合酶(美国Invitorgen公司)；Calcium Otange^TM Indicators(美国Molcular Probes公司)；抗骨形态发生蛋白4抗体、抗骨桥蛋白抗体、抗Runt相关转录因子2抗体、抗肿瘤坏死因子α抗体(美国abcam公司)；抗结缔组织生长因子抗体(美国Santa公司)；Bak1 (D4E4) 兔 mAb、Bcl2 (50E3) 兔mAb、ERRα (E1G1J) 兔 mAb(美国CST公司)；HRP-羊抗鼠 IgG、HRP-羊抗兔 IgG(美国Jackson公司)；MTT、RIPA细胞裂解液、EGTA(美国Sigma公司)。

实验用主要仪器：普通PCR仪(TCS 中国博日)；荧光定量PCR仪(AbI 7500 美国Thermo)；微量核酸定量仪(Thermo NanoDrop)；倒置荧光显微镜(IX73美国OLYMPUS)；酶标仪(美国Thermo)；电泳、转膜设备(io-Rad)；电泳仪、蛋白转印仪、电转仪、凝胶成像系统(伯乐)。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养和总RNA提取调整人成骨肉瘤细胞浓度为1×10⁹L^-1，加入适量DMEM高糖培养基(含体积分数10%胎牛血清，体积分数1%Pen/Strep)于体积分数5%CO₂，饱和湿度下培养。待长至约80%融合，消化收集细胞，以1∶3比例进行传代。弃旧培养基，预冷PBS洗涤细胞3次，尽量吸尽液体后加入1 mL TRIzol，提取细胞总RNA，反转录合成cDNA。

1.4.2 构建沉默重组腺病毒载体

构建ERRα过表达重组腺病毒载体(Ad-ERRα)：在NCBI数据库查询ERRα核苷酸序列，采用Primer 5.0设计PCR引物并添加KpnⅠ、NotⅠ酶切位点，以cDNA为模板扩增ERRα基因；KpnⅠ、NotⅠ双酶切目的基因与穿梭质粒pENTER后，在T₄ DNA酶作用将目的基因与穿梭质粒连接，连接产物转化感受态DH5α，挑选抗性克隆进行酶切鉴定。同源重组构建重组腺病毒质粒后经PacⅠ酶切线性化，用Lipofectamine 2000脂质体转染HEK-293细胞，转染后待80%左右的细胞出现病变效应，收集被感染的细胞和上清，4 ℃ 5 000 r/min离心15 min，弃上清，加入3 mL PBS，反复冻融裂解细胞4次，收集病毒制备第1代的病毒液Ad-ERRα。测定重组腺病毒滴度后，人成骨肉瘤细胞MG63以5×10⁵/孔接种于6孔板，加入DMEM高糖培养基补充至 2 mL，并于体积分数5%CO₂，饱和湿度下培养。重组腺病毒感染48 h后，分别消化收集细胞，qPCR、Western blot检测ERRα在MG63细胞中的表达。

构建Bak1及Bcl2沉默重组腺病毒载体(Ad-shBak1、Ad-shBcl2)：设计并合成相对应的shRNA序列，每条链由正义链、Loop、反义链、终止信号TTTTT组成，并在两端分别加入AgeⅠ、EcoRⅠ酶切位点，设计出的特异性针对Bcl2、Bak1及无关对照序列，将合成的寡聚核苷酸链分别重悬于ddH₂O，然后于RNase free PCR管加入对应试剂混匀后进行退火反应，使上、下游引物互补配形成双链；AgeⅠ、EcoRⅠ酶切pAd-GFP-shRNA质粒，轻轻混匀后37 ℃孵育4 h，电泳并胶回收线性化的pAd-GFP-shRNA质粒，T₄ DNA连接酶连接退火后的shRNA与线性化的pAd-GFP-shRNA于16 ℃孵育过夜，连接产物转化为感受态的DH5α细胞，扩大培养shRNA腺病毒后提取无内毒素质粒，去内素后用Lipofectamine 2000脂质体转染MG63细胞。shRNA腺病毒质粒转染MG63细胞48 h后，消化收集细胞，qPCR、Western blot检测shRNA腺病毒质粒沉默效率。

1.4.3 MTT检测MG63细胞增殖收集对数期MG63细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷L^-1，分为空载病毒组、Ad-shBak1组、Ad-shBcl2组、Ad-shBak1+Ad-shBcl2组，于96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液，使96孔板中每孔的细胞为2 000个。将96孔板置于37 ℃体积分数5%CO₂及饱和湿度条件下培养。培养24 h后，分别用空载病毒、Ad-ERRα+ Ad-shBak1、Ad-ERRα+Ad-shBcl2、Ad-ERRα+Ad-shBak1+ shBcl2的重组腺病毒颗粒感染MG63细胞(感染复数=50) 48 h后，弃旧培养基后再补充新鲜培养基，并分别向每孔中加入5 g/L MTT溶液10 μL，继续于细胞培养箱内培养4 h后终止培养，小心吸去孔内培养基，每孔加入200 μL DMSO，置于摇床上室温低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，于490处酶标仪上测定吸光度值。

1.4.4 检测MG63细胞碱性磷酸酶活性收集对数期MG63细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1。6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液，于37 ℃体积分数5%CO₂及饱和湿度条件下培养。培养24 h后，用Ad-ERRα+ Ad-shBak1、Ad-ERRα+Ad-shBcl2、Ad-ERRα+ Ad-shBak1+ Ad-shBcl2感染MG63细胞(感染复数=50)。MG63细胞感染重组腺病毒48 h后，弃旧培养基，消化收集细胞，提取细胞总蛋白，12 000 r/min离心30 min，取上清，考马斯亮蓝蛋白定量后测定碱性磷酸酶活性。

1.4.5 流式分析MG-63成骨细胞钙离子浓度的影响以1×10⁵/孔接种MG63细胞到6孔板中，于37 ℃，体积分数5%CO₂培养24 h后，换新鲜培养液，培养24 h后，分别用Ad-ERRα+Ad-shBak1、Ad-ERRα+Ad-shBcl2、Ad-ERRα+ Ad-shBak1+Ad-shBcl2感染MG63细胞(感染复数=50)48 h后，消化收集细胞，PBS洗涤细胞沉淀3次。钙荧光探针负载：取细胞悬液，加入Calcium Orange Indicator(溶于DMSO，浓度为2 mmol/L)至终浓度为10 μmol/L，置细胞培养箱中孵育1 h，其间轻微振荡3次，离心，去掉多余染料，再用无钙缓冲液反复洗涤3次，最后用无钙缓冲液稀释。上机，测定每管细胞悬液样品的荧光强度，记为F值。加入10% Triton 100后再加入1 mmol/L CaCl₂，吹打均匀，避光孵育10 min，测定荧光值即F_max。加入20 μL EGTA，吹打均匀后避光孵育10 min，测定荧光值即Fmin。胞内游离钙离子浓度计算：[Ca²⁺]= Kd·[(F-F_min)/(F_max-F)]

1.4.6 Western blot法检测骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、肿瘤坏死因子α 收集对数期MG63细胞，制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸L^-1。6孔板中每孔加入2 mL细胞悬液，置于37 ℃，体积分数5%CO₂及饱和湿度条件下培养。培养24 h后，按分组予重组腺病毒颗粒感染MG63细胞(感染复数=50)。MG63细胞感染重组腺病毒48 h后，弃旧培养基，消化收集细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，计算含40 μg蛋白的溶液体积即为上样量，在蛋白标本中加入适当体积的5*蛋白上样缓冲液，沸水浴5 min。上样，电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶封闭1 h后一抗4 ℃孵育过夜，TBST在室温下脱色摇床上洗3次，二抗室温下孵育30 min后，用TBST洗3次，充分接触显色剂后去尽残液，包好，放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。将胶片进行扫描存档，Image J软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.5 主要观察指标 ①各组MG63细胞增殖、碱性磷酸酶活性、钙离子浓度；②组MG63细胞中骨调节蛋白的表达。

1.6 统计学分析运用SPSS 18.0进行统计学处理，组间比较以采用One-Way ANOVA及LSD-t 检验，计量资料以 x(_)±s表示。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

ERRα是雌激素受体，同时也是线粒体特异性基因，与雌激素信号通路、骨的形成和氧化代谢这3个途径相关联^[7]。据报道，ERRα无论是在体内还是体外的成骨细胞和破骨细中均有表达，并在骨祖细胞的增殖分化中处于重要地位,并且ERRα和核转录因子1、核转录因子2协同作用可以促进线粒体呼吸功能相关基因的表达^[8-10]。近些年来，ERRα在绝经后骨质疏松发生发展中的地位逐步被提高^[11]。Shoukry等^[12]的实验更是证明了ERRα基因多态性与绝经后妇女骨密度间存在着密切的关系，Huang等^[13]研究亦表明ERRα可促进间充质干细胞的成骨分化，故其有望成为防治骨质疏松症的新靶点。Bcl2家族蛋白质在细胞凋亡中起着主要调节作用，其中Bcl2属于Bcl2亚家族，是抗凋亡蛋白，Bak1属Bax亚家族，为促凋亡蛋白^[14]。骨形态发生蛋白4，发挥着信号传导的作用，可调节细胞的分裂、移动及凋亡过程，是有着强大骨诱导活性的成骨因子^[15-16]。骨桥蛋白为成骨相关基因，其基因组中顺式作用元件的启动子能与Runt相关转录因子2相结合，促进相关成骨细胞分化基因的转录与表达，最终发挥促进成骨细胞分化的作用^[17-18]。结缔组织生长因子是由成骨细胞产生和分泌，在调节成骨细胞的增殖、成熟和成矿作用方面起着重要作用^[19-20]。而Runt相关转录因子2能抑制骨细胞的成骨分化，并且miR-23b可通过靶向调节Runt相关转录因子2来参与肿瘤坏死因子α介导的骨髓间充质干细胞成骨活动的减弱^[21-22]。肿瘤坏死因子α是一种强大的破骨细胞激活因子，是骨代谢和骨重塑的重要调节因子，可以刺激破骨细胞的分化，属于骨吸收因子，可降低成骨细胞分化的特殊标志物，抑制成骨细胞的分化^[23-24]。综上所述，骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2、肿瘤坏死因子α蛋白的表达均与成骨细胞的增殖分化息息相关。

雌激素水平下降是绝经后妇女骨质疏松症的主要发病机制，目前大多数研究集中在雌激素受体上，而缺乏对ERRα与骨质疏松症相关性的研究，ERRα在骨质疏松中的具体作用及其作用机制目前仍缺共识。成骨细胞是维持骨量的主要细胞之一，骨质疏松症的发生责于成骨细胞对骨量的影响，骨代谢关系到细胞凋亡，Bcl2家族凋亡蛋白与其关系是不可分割的，故雌激素和Bcl2家族凋亡蛋白与绝经后骨质疏松症的发生是有潜在关系的。当前研究在前期实验的基础上，构建了过表达ERRα和沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体，用shBak1、shBcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞，再予过表达ERRα重组腺病毒载体进行干预，观察其对MG63细胞及相关蛋白的影响，结果显示，ERRα的过表达可以明显提高Ad-shBak1组的细胞活性、碱性磷酸酶活性和骨形态发生蛋白4、结缔组织生长因子、骨桥蛋白、Runt相关转录因子2等的表达，降低钙离子浓度、肿瘤坏死因子α的表达；也可以显著地提高Ad-shBcl2组的钙离子浓度及骨桥蛋白、肿瘤坏死因子α的表达，降低骨形态发生蛋白4、Runt相关转录因子2的表达。此次实验结果说明，ERRα对Bak1沉默的MG63细胞的增殖分化起正向调节作用，对Bcl2沉默的MG63细胞亦有一定的影响。由此可推断ERRα可能是通过作用于Bcl2家族凋亡蛋白从而影响成骨细胞的增殖与矿化，然而其具体的机制仍需进一步的深入研究。

线粒体多分布在骨骼肌、脑等细胞生理功能活跃的区域，经多种途径发挥其功能^[25]。有研究报道随着年龄的增加，肌肉质量和力量的下降均与线粒体功能切切相关，线粒体不仅参与能量代谢，还参与钙离子浓度的调节，ERRα与线粒体的关系是值得探讨的^[26-31]。当前实验前期研究结果显示Bcl2和Bak基因沉默可以引起游离钙离子浓度发生变化，而当前实验中过表达ERRα也会影响相应基因沉默的MG63细胞胞内钙离子的浓度，因此，ERRα可能是在通过线粒体影响能量代谢的过程中产生一些刺激作用从而引发钙离子浓度改变，这为下一个实验提供了新的研究方向。

总之，此次研究证实了ERRα的过表达对Bak1沉默的MG63细胞的增殖分化起到正向调节作用，对Bcl2沉默的MG63细胞的成骨分化亦有一定的影响。ERRα在调节骨代谢中扮演一个重要角色，是治疗绝经后骨质疏松症的潜在靶点。虽然研究有一定的局限性，未从分子生物学层面上深入探讨其具体作用机制，但可进一步提升ERRα在骨质疏松症诊治中的地位，为目前临床诊治骨质疏松症提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化

Proliferation and differentiation of MG63 cells transfected with recombinant adenovirus vector overexpressing estrogen-related receptor alpha after silencing Bak1 and Bcl2

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