2.1  富血小板血浆检测结果  单频次注射组与多频次注射组富血小板血浆中的血小板平均浓度分别为(1 077.12± 128.30)×10⁹ L^-1，(1 145.26±126.55)×10⁹ L^-1，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。单频次注射组与多频次注射组血小板平均富集系数分别为4.26±0.74，4.63±0.58，组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2  再生神经的组织学评价  坐骨神经挤压伤后12周NF-200、S100染色显示：正常组轴突、髓鞘排列规则、紧密，分布均匀，髓鞘包绕轴突；对照组再生轴突小、髓鞘少，分布松散、不均匀；单频次注射组、多频次注射组均可见再生轴突及髓鞘，较对照组密集，但少于正常组，同时多频次注射组轴突较单频次注射组排列规则，分布均匀、密集。对照组NF-200、S100表达累积吸光度值均显著低于正常组(P均=0.000)；与对照组比较，单频次注射组、多频次注射组的NF-200、S100表达累积吸光度值明显升高(P均=0.000)，且多频次注射组NF-200、S100表达累积吸光度值高于单频次注射组(P=0.034，0.015)，但仍显著低于正常组(P=0.022，0.006)，见图2。

2.3  再生神经的形态学评价  术后12周电镜观察再生神经远端横切面显示，正常组髓鞘厚薄较为一致，染色均匀；对照组髓鞘厚薄不均，可见多处髓鞘板层断裂，染色欠均匀；单频次注射组、多频次注射组电竞观察结果均好于对照组，但不如正常组。对照组有髓神经纤维密度、有髓神经纤维直径、髓鞘厚度均显著低于正常组(P均=0.000)；与对照组比较，单频次注射组、多频次注射组有髓神经纤维密度(P=0.045，0)、有髓神经纤维直径(P均=0.000)及髓鞘厚度(P=0.002，P=0.000)明显增加，且多频次注射组较单频次注射组增加显著(P=0.030，0.029，0.038)，但仍显著低于正常组(P=0.011，0.003，0.002)，见图3。

2.4  小腿三头肌的湿质量恢复、组织学评价  术后12周，对照组、单频次注射组、多频次注射组失神经支配肌肉均有不同程度的萎缩，单频次注射组、多频次注射组失神经支配肌肉萎缩轻于对照组，并且多频次注射组较单频次注射组肌肉湿质量(P=0.001)、肌纤维横截面积(P=0.024)恢复好，见图4。

周围神经损伤在所有创伤患者中的发病率为2.8%，可导致患者长期残疾，增加了社会负担^[1-2]。自体神经移植是周围神经严重损伤治疗的金标准^[3]，然而周围神经再生因患者年龄、身体状况、受伤到手术时间及潜在疾病等多种因素的影响而结果不同，少有患者能获得满意的功能恢复。随着组织工程技术的不断发展，细胞移植进行神经修复的研究日益增多。富血小板血浆富含高浓度可诱导组织愈合和再生的生长因子，可为组织的修复提供适宜的微环境^[4]，在肌腱、韧带、软骨等修复中逐渐受到临床的认可^[5-7]。因此，实验借助超声引导方式将富血小板血浆精准注射至周围神经损伤的部位，探讨不同频次富血小板血浆注射修复坐骨神经挤压伤的价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  对比观察动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年10月至2019年1月在解放军总医院骨科再生医学北京市重点实验室完成。

1.3  材料 

实验动物：28只健康雄性新西兰白兔，5月龄，体质量2.5-3.0 kg，由北京隆安动物繁殖中心提供(许可证号：SCXK[Jing]2014-0003)。将新西兰兔随机分为4组：正常组(n=7)未行坐骨神经挤压损伤，仅暴露神经，而后缝合伤口；对照组(n=7)制作坐骨神经挤压损伤，未行任何治疗；单频次注射组(n=7)制作坐骨神经挤压损伤后注射自体富血小板血浆；多频次注射组(n=7)制作坐骨神经挤压损伤后注射自体富血小板血浆，1次/2周，共3次。实验经解放军总医院实验动物管理委员会批准(2015-x10-02)，所有操作均在解放军总医院骨科再生医学北京市重点实验室完成。

实验用试剂与仪器：陆眠宁(中国吉林长春兽医研究所)；10%氯化钙(Sigma，c1016)；石蜡切片机(Leica，Shanghai，China，RM2016)；抗NF-200抗体(N5389，Sigma)；抗S-100抗体(S2657，Sigma)；荧光显微镜(Nikon Eclipse C1，Japan)；透射电镜(Hi-tachi，Tokyo，Japan)；Image Plus Pro 6.0 软件(Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA)。

1.4  实验方法

1.4.1  动物模型的建立  实验前3 d将动物饲养于实验室以适应环境，温度控制在20-22 ℃，并实行12 h光照和  12 h黑暗交替。所有涉及动物的外科手术操作均采用无菌技术。肌内注射陆眠宁麻醉(0.2 mL/kg)，备皮并用碘伏消毒皮肤后，经右侧大腿中部股骨水平下方做纵向皮肤切口，沿肌间隙入路，显露右侧坐骨神经(约3 cm长)。在坐骨神经主干与其小分支分叉处使用持针器嵌夹(3扣)30 s，而后在其旁重复此操作，形成10 mm坐骨神经挤压损伤。钳夹解除后可见神经菲薄，呈半透明状(Sunderland，III度损伤，轴突和神经内膜受损，但神经外膜未严重受损)^[8]，见图1A，分层缝合切口。术后均给予抗生素抗炎治疗(青霉素    800 000 IU/次，共5次)。超声引导注射前(Mindray, Resona 7, 4-15 MHz线性探头)将富血小板血浆与10%氯化钙混合，激活生长因子。术后24 h，待富血小板血浆由液体变为近似胶冻状但不影响注射器抽吸时，单频次注射组、多频次注射组在超声引导下使用22 G针平面内进针，将富血小板血浆注射至损伤神经的周围，见图1B，并用超声扫描整个坐骨神经，以确保富血小板血浆位于病变部位及其近端和远端区域。此后第3，5周多频次注射组各注射1次自体富血小板血浆。

1.4.2  富血小板血浆的制备及注射  造模前采用文献[9]方法的制备富血小板血浆。自单频次注射组、多频次注射组兔耳中动脉采集自体全血，自单频次注射组7 mL/只，多频次注射组20 mL/只，使用15 mL离心管分装，内含38 g/L柠檬酸钠。首先将全血22 ℃下400×g离心10 min，分成3层：红细胞位于底部，乏细胞血浆位于顶层，血小板位于中间区域；而后将含有血小板的上清液转移到另一个未添加抗凝剂的无菌离心管中，800×g离心10 min，得到血小板浓缩物；除去上2/3贫血小板血浆，剩余1/3即为富血小板血浆，将其悬浮混匀，单频次注射组获得1 mL富血小板血浆/只，多频次注射组共获得3 mL富血小板血浆/只，并使用自动血细胞计数仪检测血小板计数。将多频次注射组富血小板血浆平均分装成3份，置于-80 ℃冰箱储存。

1.4.3  再生神经组织学评价  术后12周，过量麻药处死动物，取各组兔损伤远端处神经横断面，行NF-200、S100免疫荧光染色。简而言之，使用石蜡切片机将神经组织横向切片(4 μm厚)，于体积分数10%山羊血清室温封闭2 h后，PBS洗涤5 min×3次，而后滴加抗NF-200抗体(1∶400)和抗S-100抗体(1∶200)作为一抗，放于4 ℃冰箱过夜。次日清晨，分别滴加二抗山羊抗小鼠Alexa 594(1∶200)和山羊抗兔Alexa 488(1∶200)避光放入湿盒常温放置2 h。PBS水洗3次后，滴加DAPI染色细胞核。所有免疫荧光图像均用荧光显微镜拍摄(×20)，并用Image Plus Pro 6.0软件分析每张图像的累积吸光度值以评估轴突生长状况。

1.4.4  再生神经形态学评价  术后12周，取各组损伤神经远端5 mm处神经节段标本。神经组织首先用25 g/L柠戊二醛固定3 h，而后用1%四氧化锇固定；经一系列乙醇脱水后, 将神经组织切成70 nm厚的超薄切片。采用透射电镜检测各组有髓神经纤维密度、有髓神经纤维直径和髓鞘厚度，并使用Image Pro Plus 6.0 软件进行定量分析。

1.4.5  小腿三头肌的湿质量恢复、组织学评价  术后12周，取双侧小腿三头肌，比较失神经支配侧肌肉和健侧肌肉的大小和质量，进行宏观评价。湿质量百分比指患侧肌肉湿质量与健侧肌肉湿质量的比值。而后，取双侧小腿三头肌放于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，并包埋于石蜡中。将肌肉的横向切片(7 μm)行Masson染色，并进行一系列的常规脱水、透明、封固。每张切片随机选取10个视野(×200)，采用Image Pro Plus 6.0软件分析肌纤维横截面积。

1.5  主要观察指标  各组再生神经的组织学、形态学评价及失神经支配肌肉的湿质量恢复与组织学检测结果。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0统计软件，符合正态分布的计量资料以x(_)±s表示。计量资料呈正态分布且方差齐，两样本均数比较采用t 检验，非正态分布、方差不齐数据组间比较采用非参数秩和检验。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。

创伤性周围神经损伤是临床常见病，及时有效的治疗可避免患者出现不同程度的肢体功能障碍。实验结果表明，超声引导局部多次注射富血小板血浆可有效加速神经的再生，增加有髓神经纤维的数目、直径及髓鞘的厚度，减缓失神经支配肌肉的萎缩。

周围神经损伤治疗的目标是恢复受损神经元结构和功能的完整性。过去的30年中，外科技术在神经再生治疗中取得了大的突破，但仍存在神经干严重损伤后功能恢复不完全等问题。神经再生和靶肌肉再支配是一个复杂的过程，涉及与神经元、生长环境等有关的多种因素。以往研究发现，富血小板血浆含有影响肌腱、韧带、肌肉和骨骼愈合的生长因子^[10-11]，如神经生长因子、脑源神经营养因子、类胰岛素生长因子1、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等^[12]。富含神经生长因子、脑源神经营养因子并负载骨髓间充质干细胞的富血小板血浆纤维蛋白支架，可增强干细胞的存活及分化成神经元表型^[13]。阿尔茨海默病小鼠神经元的体外培养实验显示，添加富血小板血浆后，原代神经元培养物中由聚集状态β-淀粉样蛋白诱导的神经毒性显著降低，同时存活细胞数量明显增加^[14]。此外，阿尔茨海默病小鼠模型中富血小板血浆的慢性鼻腔内给药引发神经保护，这可能是由抗细胞凋亡PIEK/Akt信号通路的激活所介导^[15]。在此基础上，研究人员逐渐认识到富血小板血浆激活后释放的诸如此类分子可调节周围神经早期炎症、激活许旺细胞，促进巨噬细胞极化，以及积极阻止炎症反应和纤维化，从而成为神经功能恢复的关键驱动力^[16-20]。

实验结果显示与对照组相比，坐骨神经挤压伤后单次注射或多次注射富血小板血浆至损伤神经的外膜周围，均可明显改善神经再生，抑制肌肉萎缩，但多次注射疗效更为显著。研究报道，单次注射富血小板血浆的作用时间为2-4周^[21]，考虑到富血小板血浆在受区半衰期较短，增加受区局部注射频次，理论上延长受区神经营养因子的持续作用时间，改善损伤神经周围微环境，产生持续的诱导和促进神经修复的作用^[22]。因此，实验采用每隔2周注射一次共注射3次的方法延长富血小板血浆的作用时间。近年的动物实验报道，在面神经缝合模型中对神经缝合部位局部给予富血小板血浆，可显著增加再生轴突数量，缩短肌电图潜伏期^[23]；在海绵神经挤压模型中，局部应用富血小板血浆可增加再生轴突的数量，降低凋亡指数，显著改善勃起功能^[24]。此外，临床研究也不断报道富血小板血浆的治疗价值。一项双盲、随机临床试验中，将富血小板血浆注射至麻风病患者的胫神经和尺神经周围，显示出明显的感觉改善^[25]。在14例腕管综合征患者中超声引导单次正中神经周围注射富血小板血浆，8例患者疼痛消失，3例患者随访3个月疼痛减轻^[26]。另一项针对腓总神经麻痹患者的研究，超声引导富血小板血浆注射至腓总神经近端及远端周围，腓骨长肌和胫骨前肌肌电图检查提示功能恢复显著^[27]。然而，以上均为临床个案研究，缺乏大样本的系统研究，需要进一步的动物实验研究证实富血小板血浆的价值，为临床研究提供参考。因此，实验采用不同频次的富血小板血浆注射治疗周围神经挤压伤，研究方法及结果可能对临床具有重要的意义。

实验中的富血小板血浆由自体血液取样制备，快速、简单、方便、经济，安全^[28]。富血小板血浆中血小板浓度尚无明确的统一标准。有学者认为最有利于促进组织愈合和修复的血小板浓度为全血血小板生理浓度的3-8倍^[29]。实验提取的血小板浓度为全血的四五倍，在最适范围内，富集系数也较高，因而能保证应用的效果。

实验存在一定的局限性：首先，未采用多种富血小板血浆制备方案验证神经再生的最佳给药条件，需进一步研究最佳制备方法，以在临床使用前确定更为恒定、可重复的结果；其次，少有研究对比不同频次富血小板血浆注射治疗周围神经挤压伤，因而可比较的研究较少。因此，为了进一步阐明富血小板血浆治疗对神经再生的影响，还需要进一步研究。

综上所述，超声引导自体富血小板血浆多频次注射治疗对兔坐骨神经10 mm挤压伤具有良好的修复效果。随着富血小板血浆在再生医学或临床康复医学中的广泛应用，实验结果可能有助于建立周围神经损伤修复的有效策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

富血小板血浆：是通过离心自体全血而得到的含高浓度血小板的血浆。已证实富血小板血浆中含有多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、类胰岛素生长因子1、血管内皮生长因子、神经生长因子、脑源神经营养因子、肝细胞生长因子等。这些生长因子对组织的修复和再生起着重要作用。富血小板血浆由自体血液取样制备，因取材方便、制备较简单，且具有较好的促进组织再生等优点，已被广泛用于骨科领域，如：肌肉、肌腱、韧带、软骨损伤，创面修复，骨折、骨性关节炎、脊柱融合等，并逐年被应用于神经再生的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

富血小板血浆由自体血液取样制备，快速、简单、方便、经济，安全。超声引导自体富血小板血浆多频次注射治疗对兔坐骨神经10 mm挤压伤具有良好的修复效果，有效加速神经的再生，增加有髓神经纤维的数目、直径及髓鞘的厚度，并减缓失神经支配肌肉的萎缩。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程