2.1  成骨细胞的原代培养  图1为原代培养成骨细胞的生长情况，从图片中可以看出原代培养3 d后，许多成骨细胞从骨组织块周围爬出(图1A)，多呈梭形、三角形或星形的不规则形态，细胞形态饱满，边界清晰，表面较光滑；培养一定时间后骨组织块周围的细胞逐渐增多并向四周扩展移行，出现细胞堆积生长现象，此时细胞形态多为梭形(图1B)；传代培养的成骨细胞逐渐伸展变形，胞体逐渐展开成短梭形，继而变成星形或多极形(图1C)；传代培养的成骨细胞呈集落样生长(图1D)，集落中心细胞的轮廓不清，细胞体积变小，周边细胞则体积不变，细胞多为短梭形、三角形或多角形等，多角形细胞有多个长短不一的突起，核卵圆形居一侧，常为分裂相细胞。

 图2为成骨细胞与材料共培养3 d后的倒置相差显微镜观察图像，可见成骨细胞在复合材料周围生长良好，从材料的边缘可见很多细胞从材料上爬出，与不含材料的对照组细胞生长无差异。

2.2  成骨细胞的生长曲线  从图3可以看出，原代培养的成骨细胞在前1-3 d为细胞生长潜伏期，3-7 d为细胞对数增殖期，7 d后进入平台期。

2.3  成骨细胞的鉴定  从图4A中可以观察到碱性磷酸酶染色后成骨细胞核呈蓝紫色，胞浆出现红棕色颗粒；从图4B中可见成骨细胞呈复层状生长，局灶性聚集，细胞形成钙结节的位置染茜素红染料染成红色，细胞以钙结节为中心放射状排列；从图4C可以观察到Ⅰ型胶原蛋白染色后的胞浆呈棕黄或棕褐色，表现为阳性，表明成骨细胞分泌的蛋白以Ⅰ型胶原为主。

2.4  成骨细胞与材料共培养后的增殖情况  从图5中可以观察到，成骨细胞在3种复合材料中培养的9 d内成骨细胞都处于增殖状态，表明细胞的增殖未受到抑制，细胞在1-3 d增殖较慢，从第3天开始增殖加快，第3-7天为迅速增殖期(对数生长期)，7 d后进入平台期，与对照组细胞增殖无明显差异。

2.5  成骨细胞在复合材料上生长的荧光染色结果  原代成骨细胞与材料共培养后第3天行DAPI染色，在荧光显微镜下观察到(图6)：成骨细胞在材料上生长良好，被染料标记的细胞核呈蓝色，细胞核在材料中不规则分布，在镜下部分蓝色的细胞核对焦清晰，部分呈模糊状，核仁大小不一，分析原因可能是由于实验中的材料具有三维网状，细胞爬行到多孔的材料中呈立体性生长；在3组复合材料之间没有被观察到有明显的差异，说明材料对细胞生长物明显影响。

2.6  成骨细胞在复合材料上黏附的扫描电镜观察结果  原代成骨细胞与材料共培养3 d后，扫描电镜下可见成骨细胞紧密黏附于材料表面，呈多角形，伸展完全，胞体饱满，胞体伸出许多长短不一及粗细不等的伪足嵌入材料内部(图7)。原代成骨细胞与材料共培养7 d后，扫描电镜(低倍镜×300)下可见细胞几乎铺满整个材料表面，细胞多呈梭形，部分呈多角形，生长密集，其中2/1配比的复合材料组细胞生长最密集(图8)。

近年来，人们对生活质量的要求随着社会经济的不断发展越来越高。种植义齿因具有卓越的修复效果已逐渐成为口腔修复中失牙患者进行义齿修复的首要选择，被誉为人类的“第三副牙齿”。然而并不是所有的牙缺失情况都能满足种植修复的条件，种植修复的首要条件是种植区牙槽骨有足够的骨组织支持，达到与种植体周围的理想骨结合。由于牙周病、先天畸形、外伤、肿瘤切除术及失牙后牙槽骨进行性吸收等因素造成的种植区牙槽骨骨量不足，是失牙患者在进行种植手术时必须解决的重要问题。

骨移植是目前解决牙槽骨骨量不足的主要方法，骨移植材料的来源主要有自体骨、同种异体骨、异种骨和人工骨材料^[1-2]。由于自体骨和异体骨移植存在二次损伤、来源受限及免疫排斥反应等问题，在临床中的应用受到限制^[3-5]。理想的骨移植材料应该至少达到以下4方面的要求：①良好的生物相容性，即材料有利于成骨相关细胞的增殖与黏附，其本身和代谢物质对种子细胞无毒性且对细胞的表型影响小；②优越的机械力学性能，即材料植入后具有一定的强度、硬度，能够维持植骨位点的形状；③良好的生物活性，即材料具有可降解性，并最终被再生组织所取代，降解速度与细胞长入速度一致；④材料呈多孔状，因为与天然骨相似的多孔结构有利于成骨相关细胞的长入及细胞进行物质交换，具备一定的骨传导和骨诱导能力。

煅烧骨是经高温锻烧异种动物骨后得到的无机材料，钙磷比接近于人骨，前期实验已经测定其主要成分为羟基磷灰石和β-磷酸三钙。与人工合成的羟基磷灰石比，煅烧骨不用考虑材料的结构形貌，原材料来源广泛、制作成本低，然而由于高温锻烧时去除了胶原等有机成分，导致其力学强度降低、脆性增大，在临床上单独应用受到了一定限制。壳聚糖[聚(β(1，4)2-氨基2-脱氧-D-葡萄糖)]是甲壳素[聚(β(1，4)-N-乙酰基-2-D-葡萄糖胺)]脱乙酰化的产物，有一定抑菌效果且无毒，具有促进成骨细胞矿化的能力^[6]，具有良好的生物相容性^[7]。在医药和工业中壳聚糖常作为药物缓释载体材料被广泛应用，如片剂、微球、水凝胶和纳米粒等^[8]。研究表明壳聚糖还可以促进多种细胞的黏附和增殖，促进成骨细胞的分化和基质矿化^[9-11]，然而其亲水性差、降解速度慢，不具有与骨结合的生物活性，这些因素也限制了其在骨移植方面的单独使用。因此，很多研究者都致力于将壳聚糖与其他无机材料结合来模拟自然骨的特性，合成性能优越的复合材料^[12-14]，各种复合材料经成为研究的热点^[15-19]。目前已有文献报道将壳聚糖与羟基磷灰石^[14，20]、骨髓间充质干细胞等进行复合^[21]，发现复合材料既能发挥原组成材料的明显优势又能克服自身的弊端，具有较好的成骨性能。然而，有关煅烧骨与壳聚糖复合材料对成骨细胞增殖、黏附的影响目前国内外尚未见报道。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  细胞形态学观察实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年1月至2018年9月在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。

1.3  材料  煅烧骨粉由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室生物材料中心廖运茂研究员提供；Bio-oss骨粉(Geistlich，Switzerland)由四川大学华西口腔医学院口腔种植科和修复科提供；小鼠成纤维细胞株L929由口腔疾病研究国家重点实验室提供；DMEM培养基(Hyclone，USA)；F12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco，USA)；PBS(1 mmol/L，pH=7.4，口腔疾病研究国家重点实验室配制)；茜素红染料、青霉素/链霉素双抗(Sigma，USA)；CCK-8试剂盒(DOJINDO，Japan)；(Gibco，USA)、0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco，USA)；碱性磷酸酶测定试剂盒(南京建成，中国)；免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司，中国)。

实验动物：3-5 d SD大鼠乳鼠，SPF级，雌雄不拘，由四川大学华西校区实验动物中心提供。动物实验获得口腔疾病研究国家重点实验室伦理委员会批准。

1.4  实验方法

1.4.1  复合材料的制备  按照课题组前期研究的方法制备3种不同质量比例的煅烧骨/壳聚糖复合材料^[22]，煅烧骨与壳聚糖的质量比分别为1/2、1/1、2/1，将其制备成5 mm长×5 mm宽×1 mm厚的膜状。

1.4.2  成骨细胞的原代培养  采用组织块法培养成骨细胞。将SD大鼠乳鼠置于体积分数75%乙醇中约4 min后处死，取出后用含1 000 U/mL双抗(青/链霉素)的PBS漂洗2次；在超净工作台内将漂洗过的乳鼠至于无菌培养皿内，迅速用组织剪剪断颈部，分离头部组织，取颅盖骨，小心剔除颅盖骨表面的骨膜及结缔组织；用含双抗的PBS漂洗2次后将颅盖骨置入到小培养瓶中，在培养瓶内用眼科剪将颅盖骨剪成0.5-1.0 mm³大小的组织块，将剪碎的组织小心地转移到25 mL培养瓶内并均匀地摆放在培养瓶底，组织块之间的距离约4 mm；小心翻转培养瓶，使瓶底朝上，向瓶内加入含体积分数10%胎牛血清的F12培养基5 mL，加盖后将培养瓶放入体积分数5%CO₂饱和度、37 ℃的培养箱中培养，4 h后小心翻转培养瓶，使培养基完全淹没组织块(注意不要使贴壁的组织块移动)，在培养箱内继续培养。前3 d静置培养，而后根据细胞生长情况可酌情换液，换液时不需要用PBS漂洗，只需将原培养基吸出直接加入新的培养基，勿使贴壁的组织块发生移动。

1.4.3  成骨细胞的形态学观察及生长曲线测定  从细胞的原代培养开始，采用倒置相差显微镜观察细胞的形态和生长变化，同时拍照记录。取第3代成骨细胞，按2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种到96孔板，设10个复孔，每孔加入含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/链霉素的F12培养基    0.1 mL，测定9个时间点(第1-9天)，为了避免检测吸光度时细胞污染，每个时间点各使用1个96孔细胞培养板，共计9个培养板。从第3天开始剩余培养板可根据细胞的生长情况更换1-3次培养基。在每个时间点测吸光度前吸去每孔原培养基，更换新鲜的培养基同时每孔再加入10 μL的CCK-8试剂，放入体积分数5%CO₂饱和度、37 ℃的培养箱中继续培养1 h后，立即用酶联免疫检测仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度值。计算10个复孔的平均吸光度值作为最终的结果，以时间为横轴，吸光度值为纵轴描记成骨细胞的增殖曲线。

1.4.4  成骨细胞的鉴定

碱性磷酸酶定性染色：将第4代成骨细胞按2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种到12孔培养板，用含体积分数10%胎牛血清的F12培养基培养，在细胞增殖融合后用PBS洗2次，加入预冷的2.5%戊二醛固定液固定10 min，双蒸水冲洗，用碱性磷酸酶试剂盒染色，倒置相差显微镜下观察并拍照。

矿化结节染色：将第4代成骨细胞按2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种到6孔培养板，用含体积分数10%胎牛血清的F12培养基培养，两三天后换液；培养3周后在倒置相差显微镜下观察到有白色结节出现，取出培养板，先用PBS洗3遍(每次5 min)，再用体积分数95%乙醇固定10 min，PBS洗2次吸干后，用0.1%茜素红染液在37 ℃染色30 min，双蒸水冲洗3遍，倒置相差显微镜下观察并拍照记录。

Ⅰ型胶原染色：将第4代成骨细胞按2×10⁷ L^-1的细胞浓度接种到6孔培养板，培养2 d后进行如下操作：弃旧培养  基→40 g/L多聚甲醛固定液固定过夜→1 mL Tritonx-100 (0.25%)保持10 min→加入2 mL体积分数3%的过氧化氢，湿盒内避光处理10 min→1 mL血清封闭10 min→弃血清，滴加1∶100 羊抗大鼠Ⅰ型胶原抗体，4 ℃过夜→加生物素标记的二抗，室温孵育10 min→滴加链霉素抗生物素－过氧化物酶，室温孵育10 min→DAB显色，苏木精复染，脱水，封固，镜下观察(上述每个步骤在加入每种试剂之前都需用PBS漂洗细胞3次)，胞浆被染成棕黄色或棕褐色为阳性。

1.4.5  煅烧骨/壳聚糖复合材料与成骨细胞共培养  将制备好的煅烧骨/壳聚糖复合材料先用体积分数75%乙醇浸泡2 h，再用灭菌的PBS反复冲洗，干燥后在密闭的环境中采用紫外灯双面照射灭菌30 min，密封包装后备用。共培养前在超净工作台内将灭菌后的3种复合材料浸泡到F12(含体积分数10%胎牛血清)培养基中1 h，然后置于培养板中，分别接种原代成骨细胞悬液2.5 mL，细胞接种浓度为2×10⁷ L^-1，以单独培养的细胞为对照。每天倒置相差显微镜下观察细胞在材料周围的生长情况并拍照记录。

1.4.6  DAPI荧光染色实验  用PBS将DAPI溶液配制成终质量浓度为1 g/L的母液，使用前用甲醇将其稀释成2 mg/L后使用。细胞与材料共培养3 d后，从每组中分别取出一个样本进行如下步骤操作：吸出培养基，PBS分别洗3次；加入体积分数4%甲醛固定1 h，PBS漂洗3次；DAPI染料在37 ℃染色30 min后，PBS冲洗3次；荧光显微镜下观测。

1.4.7  CCK-8法检测细胞增殖情况  将第4代成骨细胞按5×10⁷ L^-1细胞浓度接种到预先放置好3种材料的48孔培养板内，每孔接种0.2 mL细胞悬液，每组设6个复孔，以单独培养的细胞为对照。培养第1，3，5，7，9天后更换培养基(0.2 mL)，立即加入CCK-8试剂20 μL，在37 ℃的培养箱中继续培养1 h，将已经染色的培养基转移到新的48孔培养板中，立即用酶联免疫检测仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度值。计算6个孔板的平均值作为最终的结果，描记增殖曲线。

1.4.8  扫描电镜观察细胞黏附情况  细胞与材料共培养3，7 d后，从每组中分别取出一个样本进行如下步骤操作：吸出培养基、PBS分别洗3次；加入4 ℃预冷的2.5%戊二醛固定4 h，PBS漂洗3次；梯度乙醇(体积分数分别为30%，50%，70%，80%，90%，100%)脱水，每个梯度脱水2次，每次15 min；临界点干燥，喷金膜，扫描电镜下观察细胞在材料上的黏附情况。

1.5  主要观察指标  ①成骨细胞的形态学观察及细胞增殖情况；②成骨细胞与材料共培养后细胞的增殖情况；③成骨细胞在复合材料上的黏附生长情况。

1.6  统计学分析  利用SPSS 17.0软件包对数据进行统计分析，两组之间的比较用t 检验，多组之间的比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，取P < 0.05表示差异有显著性意义。

评价生物材料生物安全性的主要方法有体内直接接触法与体外细胞培养法，体内直接接触法由于受到宿主许多复杂体内环境因素的影响，很难准确反映材料在宿主体内的真实生物安全性^[23]；而体外通过培养基等模拟体内细胞生长的微环境，将生物材料与细胞复合培养可直接观察细胞与生物材料生长的状况，了解细胞与材料之间的相互作用，比体内植入更能直观地反映生物材料与细胞相容性的缺点^[24]，有助于骨移植材料的筛选。体外细胞毒性实验是运用体外细胞培养技术检测待测物质和(或)其浸提液是否造成细胞生长受到抑制、变异、溶解、死亡等情况，是生物材料评价体系中非常重要的指标之一，也是各种生物材料运用到临床前安全性评价的必选和首选项目。课题前期实验先对复合材料的细胞毒性进行了测定，结果表明材料安全无毒。现使用原代培养的SD大鼠成骨细胞与复合材料共培养，分别观察检测成骨细胞在材料上的增殖、黏附。在探索煅烧骨/壳聚糖复合材料对原代大鼠成骨细胞增殖黏附的影响过程中，放弃使用细胞株的原因是因为原代培养的成骨细胞更能够真实地模拟体内成骨细胞的生长、增殖和分化过程。实验使用SD大鼠颅骨的骨组织块原代培养成骨细胞，采用“差速贴壁法”纯化细胞，经过细胞形态学观察、碱性磷酸酶试剂染色、茜素红钙结节及Ⅰ型胶原染色后鉴定为纯度较高的成骨细胞，为成骨细胞在材料上的增殖黏附实验打下基础。

骨移植材料不仅应该具备生物安全性，还应该具有良好的生物相容性，植入骨组织后骨移植材料承担细胞外基质的作用，对细胞黏附增殖起到促进作用^[25]。由于骨移植材料植入体内后与之接触的细胞主要是成骨细胞和具有成骨分化潜能的骨髓基质干细胞，因此采用体外原代成骨细胞与复合材料共培养的方法来研究材料的生物相容性，能够客观地揭示材料植入后与骨组织相容的情况。宁思敏  等^[26]将培养的大鼠成骨细胞分别在壳聚糖/羟基磷灰石复合支架降解产物浸提液和含体积分数10%胎牛血清的 DMEM培养液中培养，发现前者培养的成骨细胞增殖速度、细胞碱性磷酸酶活性、细胞总蛋白合成及碱性磷酸酶与总蛋白的比值明显高于后者，从而得知壳聚糖/羟基磷灰石复合生物支架的降解产物不仅有利于大鼠成骨细胞的增殖、黏附和生长，而且能够增强其骨化功能，具有较好的生物相容性。MAO等^[27]认为骨移植材料的骨诱导能力可能是骨愈合中最重要的特性，因为它能够刺激间充质干细胞分化为成骨细胞，从而开始骨形成过程^[28]。骨移植材料植入体内后，随着材料的逐步降解细胞不断增殖并分泌细胞外基质，最终形成与原来形态、功能相对应的新骨，从而达到修复骨缺损和重建功能的目的；细胞在生物材料上的黏附、增殖和凋亡直接影响骨修复效果的成败^[29-30]，其中细胞黏附至关重要，因为细胞必须与材料界面有良好的黏附才能进行迁移、分化和增殖等过程。LYNCH ^[31]认为细胞膜表面的整合素家族受体能特异性识别氨基酸的次序和细胞外基质中生长因子、黏附相关因子等，细胞与材料表面吸附的蛋白质发生作用，从而介导细胞的黏附和增殖。骨移植材料表面的亲/疏水性、表面电荷、几何形态及表面生物活性分子(蛋白质、多肽)等都对成骨相关细胞的黏附有重要作用。细胞容易黏附在亲水性强及表面能高的材料上面，因此对于聚乳酸等高分子聚合材料，其表面生物惰性不利于细胞的黏附，常通过化学修饰、引入生物活性多肽等方法改变材料表面的疏水性、增加亲水性，提高材料对蛋白质的吸附，促进细胞黏附。各种细胞在不同粗糙程度材料表面生物学行为的研究提示：成骨细胞在平滑的材料表面的黏附和铺展优于粗糙表面。

骨修复材料植入体内后，材料与天然骨相互融合或在界面上产生侵入和交织，是新骨生成的最佳方式，材料的多孔结构对细胞黏附也有重要作用。VENKATESAN等^[20]通过冻干的方法制备天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料，结果证实该材料具有多孔结构，能够明显促进成骨细胞的增殖黏附，是一种很有潜力的骨组织工程支架材料。材料的表面结构(如孔径大小及孔隙率的差异)可直接影响成骨细胞的吸附作用，可能的原因有：多孔结构使材料具有一定的细胞附着面，允许骨组织和其他组织长入其内的通道，为细胞黏附提供场所；多孔结构提高了材料的表面积，有利于细胞的增殖和迁移，促进界面结合反应过程；孔隙之间相互连通性，可使新骨从材料表面“爬行”至内部获得良好的界面结合，并为细胞和组织的生长提供必须的气体和养分交换环境，连通性高则有利于长入材料深部的组织有足够的营养供应，促进新骨的生成。此外，HING等^[32]认为材料孔径大小确实会影响细胞的增殖和分化，太小的孔隙会阻碍细胞进入孔隙，从而影响细胞生长和繁殖；但太大的孔隙会失去材料的细胞支架作用，细胞在其上面容易脱落。

由于钙磷成分的生物材料具有良好的亲水性，含有骨组织新陈代谢所需的钙、磷等元素，微降解时所释放的适量Ca²⁺、PO₄^3-离子可形成细胞增殖的碱性环境，也有利于细胞的黏附生长。朱明华等^[33]认为羟基磷灰石的羟基能与人体组织发生键合，植入人体后与组织选择性结合，促进胶原纤维在材料上结合，材料对基质蛋白吸附增加，从而促进成骨细胞的吸附与爬行，促进成骨细胞的增殖和功能增强，增加各种相关细胞的基质分泌。目前骨再生领域应用最多的钙磷生物陶瓷是羟基磷灰石、磷酸三钙及磷酸钙骨水泥等，都具有良好的骨传导性，能提供细胞爬行的条件，支持细胞黏附、扩散和分化^[34]。

实验在细胞核荧光染色中发现，镜下部分蓝色的细胞核对焦清晰，部分呈模糊状，核仁大小不一，分析原因可能是由于材料具有三维网状，细胞爬行到多孔的材料中呈立体性生长；在3组不同质量比例的材料之间没有被观察到有明显差异，说明材料对细胞生长无明显影响。实验还通过形态学观察、扫描电镜等方法研究细胞在材料上的黏附生长情况，结果表明细胞在复合材料上生长良好，在材料表面和内部都黏附生长，分析原因可能与材料的以下方面有关：①复合材料中的主要无机成分羟基磷灰石和β-磷酸三钙都具有良好的亲水性，所含钙、磷等元素有利于细胞的黏附生长；②材料中羟基磷灰石的羟基骨组织有骨键合作用，促进细胞的黏附和爬行；③材料的高孔隙率和分级多孔结构为细胞的黏附、扩展和迁移提供有利条件，孔的高连通率为细胞生长提供足够营养运输；④复合材料中的壳聚糖具有良好的生物相容性，具有骨引导作用，可以促进成骨细胞的增殖生长^[35-36]。当然，复合材料的发展潜力巨大，存在着无数可能性，需要更多更深入的研究来挖掘这些材料的复合潜力。一方面可通过改善骨移植材料的内部结构特征来优化复合材料的基础性能，如GHAEE等^[37]将氯磺酸与壳聚糖复合制备磺化壳聚糖，以提高壳聚糖支架的生物活性，以壳聚糖、磺化壳聚糖和聚己内酯纳米纤维为原料制备了新型生物活性纳米复合支架，同时为了模拟细胞外基质样结构，在制备的支架中加入了不同量的切碎亲水性聚己内酯纳米纤维，加入聚己内酯纳米纤维可以获得更大的孔径、更高的孔隙率和磷灰石沉积，将该材料掺入支架可以提高细胞的存活率和附着性。另一方面可通过增加其他复合材料来实现更优的性能，如刘苗等^[38]通过体内实验发现添加鹿瓜多肽的煅烧骨颗粒/壳聚糖复合材料可以更有效地促进骨缺损修复。

总之，实验将原代成骨细胞与煅烧骨/壳聚糖复合材料共培养，采用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况，荧光显微镜观察细胞在材料上的生长增殖情况，CCK-8法检测细胞在材料上的增殖率，并采用扫描电镜观察成骨细胞在材料上的生长黏附情况，结果表明细胞在复合材料上生长良好，在材料表面和内部都黏附生长，表明煅烧骨/壳聚糖复合材料具有良好生物相容性，提示该复合材料可能因其材料组分、表面形貌、微观结构等方面的因素促进细胞的黏附、生长，从而显示其有利于成骨的可能性，为下一步体内成骨实验提供依据。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

壳聚糖：是甲壳素的脱乙酰产物，属于天然聚合物，广泛存在于低等生物体内，其代谢产物为N-乙酰葡萄糖和氨基多糖，是天然代谢产物，对人体组织无毒无害，具有良好的生物相容性和生物降解性。

体外细胞毒性实验：是运用体外细胞培养技术检测待测物质和(或)其浸提液是否造成细胞生长受到抑制、变异、溶解、死亡等情况，是生物材料评价体系中非常重要的指标之一，也是各种生物材料运用到临床前安全性评价的必选和首选项目。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

煅烧骨是经高温锻烧动物骨所获得的异种骨移植材料。与人工合成的羟基磷灰石比，煅烧骨不用考虑材料的结构形貌，而且材料来源广泛，制作成本低。壳聚糖是天然的甲壳素的脱乙酰产物，来源广泛，生物相容性好，可降解，可以促进多种细胞的黏附和增殖，并能促进成骨细胞分化和基质矿化。人体骨具备复杂的结构、拥有独特的理化性能和生物学性能，成分单一的骨移植材料无法达到这一要求，而复合材料既能能发挥原组成材料的主要优势，又能克服自身弊端，从而获得新的优越性能。锻煅烧骨/壳聚糖复合材料既具有壳聚糖的柔性和韧性，又具有煅烧骨多孔网状结构，能促进大鼠成骨细胞的增殖黏附，是一种有潜力的新型骨移植材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程