碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子1对精原干细胞增殖凋亡影响的机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2066

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (19): 3017-3022.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2066

• 干细胞因子及调控因子 stem cell factors and regulatory factors • 上一篇下一篇

碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子1对精原干细胞增殖凋亡影响的机制

李宏^1，2，吴绍华¹，邱明星¹，邓青富³，雷国林²，李青龙²

¹西南医科大学，四川省泸州市 646000；²简阳市人民医院·西南医科大学附属简阳医院泌尿外科，四川省简阳市 641400；³西南医科大学附属医院泌尿外科，四川省泸州市 646000

收稿日期:2019-07-30 修回日期:2019-08-02 接受日期:2019-09-17 出版日期:2020-07-08 发布日期:2020-04-08
通讯作者: 邱明星，主任医师，西南医科大学，四川省泸州市 646000
作者简介:李宏，男，1980年生，四川省成都市人，副主任医师，主要从事泌尿疾病方面的研究。
基金资助:
四川省卫生和计划生育科研课题项目(17PJ160)

Mechanism underlying basic fibroblast growth factor and insulin-like growth factor-1 effects on proliferation and apoptosis of spermatogonial stem cells

Li Hong^{1, 2}, Wu Shaohua¹, Qiu Mingxing¹, Deng Qingfu³, Lei Guolin², Li Qinglong²

¹Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; ²Department of Urology Surgery, the People’s Hospital of Jianyang City & Jianyang Hospital of Southwest Medical University, Jianyang 641400, Sichuan Province, China; ³Department of Urology Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China

Received:2019-07-30 Revised:2019-08-02 Accepted:2019-09-17 Online:2020-07-08 Published:2020-04-08
Contact: Qiu Mingxing, Chief physician, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China
About author:Li Hong, Associate chief physician, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of Urology Surgery, the People’s Hospital of Jianyang City & Jianyang Hospital of Southwest Medical University, Jianyang 641400, Sichuan Province, China
Supported by:
the Research Project of the Health and Family Planning Commission of Sichuan Province, No. 17PJ160

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

碱性成纤维细胞生长因子：是细胞生长和分化的重要调节因子，具有促血管生成、细胞增殖、细胞趋化、细胞迁移等活性，在细胞分化和机体发育过程中发挥重要作用。碱性成纤维细胞生长因子通过与细胞膜表面的特异性配体结合，进而引发细胞内的一系列级联反应，从而产生各种生物学效应。

胰岛素样生长因子1：是多功能细胞增殖调控因子，主要分布在肝脏中，其与胰岛素样生长因子2、胰岛素及其受体一起构成了胰岛素样生长因子家族，其对细胞生长和代谢具有多效作用。

背景：生长因子作为体外细胞培养和体内细胞生长及增殖必需的调节因子，一直被广泛的关注。

目的：探讨碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)与胰岛素样生长因子1(insulin-like growth facter，IGF-1)联合作用对小鼠精原干细胞增殖、凋亡的影响。

方法：从6-8 d龄昆明雄性小鼠睾丸内分离培养精原干细胞并进行鉴定。将精原干细胞接种于经丝裂霉素C处理过的胚胎成纤维细胞饲养层上，分组干预：对照组加入正常DMEM培养基进行培养；bFGF、IGF-1组分别加入含20 μg/L bFGF、20 μg/L IGF-1的DMEM培养基进行培养；bFGF+IGF-1组同时加入含20 μg/L bFGF及20 μg/L IGF-1的DMEM培养基进行培养。采用CCK-8、EDU染色法分别检测精原干细胞增殖活性，流式细胞仪检测精原干细胞生长周期和细胞凋亡情况，Western blot检测增殖和凋亡相关蛋白PCNA、Bax、Bcl-2的表达。

结果与结论：①与对照组比较，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组吸光度值显著升高，与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组吸光度值进一步升高(P < 0.05)，EDU染色得到与CCK-8实验一致的结论；②bFGF+IGF-1组S+G₂/M期细胞比例明显高于其他3组(P < 0.05)，IGF-1组、bFGF组S+G₂/M期细胞比例高于对照组(P < 0.05)；③与对照组比较，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组凋亡细胞降低；与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组凋亡细胞进一步降低；④与对照组比较，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组细胞中Bax蛋白相对表达水平显著下降(P < 0.01)，Bcl-2和PCNA蛋白相对表达水平均显著升高(P < 0.05)。与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组细胞中Bax蛋白相对表达水平进一步下降(P < 0.01)，Bcl-2和PCNA蛋白相对表达水平进一步升高(P < 0.05)；⑤结果表明，bFGF、IGF-1通过上调PCNA和Bcl-2蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，二者联合作用效果最佳。

ORCID: 0000-0001-5693-3713(李宏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 精原干细胞, 胰岛素样生长因子1, 碱性成纤维细胞生长因子, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: As a necessary regulatory factor of in vitro cell culture, and in vivo cell growth and proliferation, growth factors have attracted much attention.

OBJECTIVE: To investigate the effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) combined with insulin-like growth factor-1 (IGF-1) on the proliferation and apoptosis of spermatogonial stem cells in mice.

METHODS: Spermatogonial stem cells were isolated and cultured from the testis of 6-8 days old male Kunming mice and were identified. Spermatogonial stem cells were inoculated into the feeder layer of embryonic fibroblasts treated with mitomycin C, and were then divided into four groups. Control group was cultured with normal DMEM medium; bFGF and IGF-1 groups were cultured with DMEM medium containing

20 μg/L bFGF and 20 μg/L IGF-1, respectively; bFGF+IGF-1 group was cultured with DMEM medium containing 20 μg/L bFGF and 20 μg/L IGF-1. The proliferation activity of spermatogonial stem cells was detected by cell counting kit-8 assay and EDU staining. The growth cycle and apoptosis of spermatogonial stem cells were detected by flow cytometry. The expression levels of PCNA, Bax and Bcl-2 proteins were detected by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the absorbance values in the bFGF, IGF-1 and bFGF+IGF-1 groups were significantly increased. Compared with the bFGF and IGF-1 groups, the absorbance values in the bFGF+IGF-1 group were further increased (P < 0.05). EDU staining results showed the same conclusion as cell counting kit-8 assay results. The proportion of S+G₂/M phase cells in the bFGF+IGF-1 group was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.05). The proportion in the IGF-1 and bFGF groups was significantly higher than that in control group (P < 0.05). Compared with the control group, the number of apoptotic cells in the bFGF, IGF-1 and bFGF+IGF-1 groups was decreased. Compared with the bFGF and IGF-1 groups, the number of apoptotic cells in the bFGF+IGF-1 group was further decreased. Compared with the control group, the relative expression levels of Bax protein in the bFGF, IGF-1 and bFGF+IGF-1 groups were significantly decreased (P < 0.01), and the expression levels of Bcl-2 and PCNA proteins were significantly increased (P < 0.05). Compared with the bFGF and IGF-1 groups, the relative expression level of Bax protein in the bFGF + IGF-1 group was decreased further (P < 0.01), and the relative expression levels of Bcl-2 and PCNA proteins were increased further (P < 0.05). These results indicate that bFGF and IGF-1 can promote cell proliferation and inhibit cell apoptosis by up-regulating the expression of PCNA and Bcl-2 proteins and down-regulating the expression of Bax protein. The combination of bFGF and IGF-1 can achieve favorable effects.

Key words: spermatogonial stem cells, insulin-like growth factor 1, basic fibroblast growth factor, cell proliferation, cell apoptosis

中图分类号:

李宏, 吴绍华, 邱明星, 邓青富, 雷国林, 李青龙. 碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子1对精原干细胞增殖凋亡影响的机制[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(19): 3017-3022.

Li Hong, Wu Shaohua, Qiu Mingxing, Deng Qingfu, Lei Guolin, Li Qinglong. Mechanism underlying basic fibroblast growth factor and insulin-like growth factor-1 effects on proliferation and apoptosis of spermatogonial stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(19): 3017-3022.

图/表（结果） 7

2.1 精原干细胞的形态和鉴定体外培养的精原干细胞在光镜下呈圆形，大小均一，饱满呈圆形，传代3次后细胞数量增多，细胞连接紧密，呈葡萄串状细胞集落。细胞集落经碱性磷酸酶染色后在倒置显微镜下观察呈棕红色，强阳性，见图1。

2.2 CCK-8法检测细胞增殖 CCK-8法检测培养12，24，48，72，96 h后细胞活力，与对照组比较，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组细胞增殖能力均显著增强(P < 0.05)，与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组细胞增殖能力显著增强(P < 0.05)，结果提示bFGF与IGF-1均能促进细胞增殖，两者联合促增殖效果更显著，见图2。

2.3 EDU检测细胞增殖情况 EDU染色检测各组干预4 d后细胞增殖情况，荧光显微镜下可见增殖的细胞呈红色，bFGF+IGF-1组增殖细胞明显多于其他3组， IGF-1、bFGF组增殖细胞多于对照组，见图3。

2.4 流式细胞术检测细胞周期对照组、bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组S+G₂/M期细胞比例分别为(60.35± 2.14)%，(69.32±1.69)%，(76.31±2.57)%，(86.37±3.16)%。bFGF+IGF-1组S+G₂/M期细胞比例明显高于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)，并且IGF-1组S+G₂/M期细胞比例高于对照组、bFGF组，差异有显著性意义(P < 0.05)；bFGF组S+G₂/M期细胞比例高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况与对照组比较，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组凋亡率降低；与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组凋亡率进一步降低，见图5。

2.6 Western blot检测PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达与对照组相比，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组细胞中Bax蛋白相对表达水平显著下降(P < 0.01)，Bcl-2、PCNA蛋白相对表达水平以及Bcl-2/Bax比值均显著升高(P < 0.05)。与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组细胞中Bax蛋白相对表达水平进一步下降(P < 0.01)，Bcl-2、PCNA蛋白相对表达水平以及Bcl-2/Bax比值进一步升高 (P < 0.05)，见表1和图6。

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引言

哺乳动物的睾丸结构可以分为生精小管和管外间质组织两部分，生精小管内壁衬有生精上皮，主要有2种细胞，一种是生殖细胞，另一种是支持细胞^[1-3]。精原干细胞是一类在睾丸内位于生精小管基底膜上的原始精原细胞，其一方面可以自我增殖维持自身数目的相对恒定，另一方面可以经过数次有丝分裂后进入减数分裂，形成精母细胞，最终形成精子。精子发生是以精原干细胞为基础，在多种生长因子、微环境及自身信号调控下复杂而高度有序的过程^[4-5]。精原干细胞具有终生扩增性和永生性的生物学特性，使其在干细胞生物学、医学等领域均具有潜在的应用价值^[6-8]，但雄性哺乳动物睾丸内的精原干细胞数量稀少，仅占生殖细胞数量的0.02%-0.03%，因此需要在体外建立精原干细胞培养增殖系统，扩增精原干细胞数量，获取足够数量的精原干细胞来进行相关研究。

精原干细胞的自我更新与分化之间的平衡是维持精子发生与正常生育能力的关键，这2个过程同时被干细胞内部的基因表达和外部的信号所调节。生长因子广泛存在于细胞周围环境中，是调控细胞增殖、凋亡、迁移和分化的多肽类物质。众多文献发现在体外培养精原干细胞中，添加胶质细胞源性神经营养因子^[9]、表皮生长因子^[10]、碱性成纤维细胞生长因子^[11]、干细胞因子^[12]、白血病抑制因子^[13]、胰岛素样生长因子等^[14]，均可以促进精原干细胞的增殖。该研究拟观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor，IGF-1)联合作用对小鼠精原干细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其作用机制，为生精机制研究提供新的途径与思路。

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。

1.2 时间及地点实验于2018年4至7月在西南医科大学实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物出生6-8 d的昆明雄性小鼠10只，SPF级，由西南医科大学动物实验中心提供。

1.3.2 实验细胞胚胎成纤维细胞购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。

1.3.3 实验试剂与仪器 rhbFGF、rhIGF-1(艾美捷科技有限公司)；DMEM培养基、胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司)；Ⅳ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶(湖南汇百侍生物科技有限公司)；精原干细胞培养基(武汉普诺赛生命科技有限公司)；兔抗PCNA抗体、抗Bax抗体、抗Bcl-2抗体、抗GAPDH抗体(上海酶联生物科技有限公司)；流式细胞仪(BD公司)；细胞培养箱(Thermo公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 胚胎成纤维细胞饲养层的准备将胚胎成纤维细胞接种于培养皿中，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液；观察细胞铺满皿底时，在培养液中加入 10 mg/L丝裂霉素C进行处理，放入体积分数为5%CO₂培养箱内37 ℃培养3 h；吸弃含丝裂霉素C的培养液，PBS清洗3次；加入0.25%胰蛋白酶消化1 min，1 000 r/min离心 5 min，以含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，将细胞悬液接种于明胶包被过的培养皿内，置入体积分数为5%CO₂培养箱37 ℃培养30 min，备用。

1.4.2 精原干细胞得分离、培养与鉴定取10只昆明小鼠，麻醉后断颈处死，置入体积分数为75%乙醇中15 min，暴露腹腔，取双侧睾丸组织，去除白膜，置于含PBS的培养皿中25 ℃浸泡3 min；PBS清洗3次，加入Ⅳ型胶原酶溶液3 mL，放入培养箱内37 ℃培养15 min；PBS清洗后 1 000 r/min离心2 min，弃上清，重复此步骤2次；加入0.25%胰蛋白酶0.8 mL，放入培养箱内37 ℃培养10 min；终止消化反应，吹打至单细胞悬液，1 000 r/min离心5 min；以精原干细胞培养基重悬细胞，放入预先铺有明胶的培养皿中室温培养30 min；转移至明胶包被过的12孔板内，每孔加入精原干细胞培养基1 mL，放入体积分数为5% CO₂培养箱内37 ℃培养过夜，第2天半量更换新的培养基，观察细胞长满孔底后按1∶2比例接种于经丝裂霉素C处理过的胚胎成纤维细胞饲养层上进行培养。采用碱性磷酸酶染色鉴定小鼠精原干细胞。

1.4.3 实验分组实验分为4组：对照组，加入正常DMEM培养基进行培养；bFGF组，加入含20 μg/L bFGF的DMEM培养基进行培养^[15]；IGF-1组，加入含20 μg/L IGF-1的DMEM培养基进行培养^[16]；bFGF+IGF-1组，加入含20 μg/L bFGF及20 μg/L IGF-1的DMEM培养基进行培养。

1.4.4 CCK-8检测细胞增殖培养24 h后将精原干细胞悬液接种于96孔板内，每孔100 µL，细胞密度为2×10⁵/孔，根据实验分组向培养板内加入含相应生长因子的培养基，放入培养箱内培养不同的时间(12，24，48，72，96 h)，每孔加入10 µL CCK-8溶液，孵育4 h，利用酶标仪检测 450 nm处的吸光度值。

1.4.5 EDU免疫荧光分析法检测细胞增殖按上述分组在培养板内加入含相应生长因子的培养基，干预4 d后每孔加入50 μmol/L EDU培养基100 μL孵育2 h，40 g/L多聚甲醛固定30 min，2 g/L甘氨酸孵育5 min，PBS冲洗2次，0.5%Triton X-100透化细胞，PBS冲洗2次，Apollo染色反应液避光孵育30 min后加入0.5%Triton X-100冲洗3次，每次10 min，PBS冲洗，Hoechst33342避光孵育30 min，随后在荧光显微镜下成像。

1.4.6 流式细胞仪检测细胞周期按上述分组在培养板内加入含相应生长因子的培养基，干预4 d后收集细胞，PBS清洗3次，离心沉淀细胞，弃上清，PBS重悬细胞，放入体积分数为70%预冷的乙醇中4 ℃固定24 h；离心弃上清，PBS清洗3次，加入含有0.2 mg RNase A的1 mL PI/Triton X-100染色液(20 μg PI/0.1% Triton X-100)重悬细胞，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-1，37 ℃染色15 min，应用流式细胞仪测定细胞周期。

1.4.7 流式细胞仪检测细胞凋亡按上述分组在培养板内加入含相应生长因子的培养基，干预4 d后收集细胞，PBS清洗3次，严格按照Annexin V/PI双染色法凋亡试剂盒说明书操作，样品准备好后上流式细胞仪检测凋亡率。

1.4.8 Western blot检测PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达干预4 d后收集细胞，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，利用BCA方法检测蛋白浓度。取蛋白样品10 µL，加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100 ℃或沸水浴加热3-5 min；冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，恒压120 V电泳90 min；选用PVDF膜，使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置转膜60 min，设定转膜电流为300 mA；取出PVDF膜，放入含1%脱脂牛奶的TBST封闭液中室温孵育1 h；加入一抗(抗PCNA抗体、抗Bax抗体、抗Bcl-2抗体、抗GAPDH抗体)4 ℃孵育4 h，TBST洗膜3次，加入HRP标记的羊抗兔二抗(1∶10 000)，室温孵育1 h；ECL显色。

1.5 主要观察指标 ①各组精原干细胞增殖、凋亡情况；②各组精原干细胞PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达。

1.6 统计学分析每组实验重复3次。采用SPSS 22.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

由于精原干细胞在动物睾丸内的含量极少，因此成功分离培养精原干细胞是进一步深入研究的基础。在6-8 d龄雄性小鼠睾丸中的精原干细胞比例较大，并且都是A型精原细胞，占生殖细胞比例的0.8%^[17]，这样就可以获得较多的精原干细胞且纯化效率高。因此实验选择此阶段的小鼠用于精原干细胞的分离。

在分离培养过程中为避免其他组织的污染，去除了白膜组织，而后采用两步酶消化法分离精原干细胞，进一步利用差异贴壁法分选精原干细胞，研究表明碱性磷酸酶在原始生殖细胞中呈高表达，常作为生殖干细胞的标志性酶^[18]，细胞集落经碱性磷酸酶染色后在倒置显微镜下观察呈棕红色，说明培养的细胞为未分化状态的精原干细胞。

使小鼠精原干细胞在体外无限增殖且保持未分化状态是建立小鼠永生化细胞系的前提和基础。细胞在生长和增殖过程中需要一定的环境条件，多种生长因子通过不同途径、不同机制对于维持组织和细胞的稳态发挥重要作用。bFGF是一种生物活性很强的促细胞分裂原，它主要作用于来自中胚层和神经外胚层的组织细胞，而男性生殖器官来源于中胚层，因而bFGF能对睾丸生精细胞增殖起到调节作用^[19-20]。EISELLEOVA等^[21]研究表明，bFGF可与膜上的受体结合，促进有丝分裂蛋白激酶的表达，从而激活下游信号通路，维持生殖细胞系的多能性和促进细胞增殖。IGF-1是胰岛素样生长因子家族中的一员，是细胞生长的重要调节因子，在哺乳动物生殖系统生长发育中的作用已有比较详细的报道。ZHANG等^[22]研究表明IGF-1能提高睾丸间质细胞类固醇激素的合成和上调间质细胞黄体生成素受体基因的表达，具有促进生精上皮增殖的作用；还有研究表明IGF-1是促进生精功能的重要因素^[23-24]。实验将与小鼠精原干细胞在体内增殖有关的bFGF、IGF-1细胞因子添加到培养液中，观察2种因子单独和联合作用对小鼠精原干细胞增殖和凋亡的影响。

实验通过CCK-8法检测精原干细胞的增殖活性，与对照组比较，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组吸光度值显著升高，表明bFGF与IGF-1均能促进精原干细增殖，与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组吸光度值进一步升高(P < 0.05)，表明二者对精原干细胞的增殖具有协同促进作用。此外，采用EDU法再次研究bFGF、IGF-1对精原干细胞增殖活性的影响，得到与上述一致的结论，EDU属于胸腺嘧啶核苷类似物，不需要严格的样品变性处理，通过EDU标记，可以将其插入正在复制的DNA分子，进而对处于S期的增殖细胞进行检测，准确判断精原干细胞体外增殖效果^[25-26]。在细胞周期内，DNA含量随细胞内时相发生周期性变化，同样当细胞受到某些因素刺激时，可使DNA含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变，精原干细胞属于增殖性细胞，大部分细胞处于细胞周期的G₀/G₁期，在某种刺激下，随着DNA合成的增加，细胞进入S期比例上升，细胞不断增殖，实验发现bFGF、IGF-1对精原干细胞周期的影响与对细胞增殖的影响也是一致的，以bFGF、IGF-1二者联合对细胞周期的影响最好，S+G₂/M期细胞比例最高。细胞凋亡为细胞的程序性死亡，是在生物生长发育过程中不可或缺的一个重要方面，实验结果表明bFGF、IGF-1联合应用更能减缓细胞凋亡，但是二者是通过何种途径促进精原干细胞的增殖和凋亡仍未明确，

PCNA是增殖细胞核抗原，由MIYACHI等于1978年在系统性红斑狼疮患者的血清中首次发现并命名，PCNA与细胞DNA合成关系密切，在细胞增殖的启动上起重要作用，是反映细胞增殖状态的良好指标^[27-28]。实验用PCNA作为细胞增殖指标，与对照组相比，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组细胞中PCNA蛋白相对表达水平均显著升高(P < 0.05)。与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组细胞中PCNA蛋白相对表达水平进一步升高(P < 0.05)。

目前已知有多种基因与细胞凋亡有关，Bcl-2和Bax是近来年发现的一对关系密切的凋亡基因，在细胞凋亡的调控中起重要作用，是体外培养细胞的重要检测指标。Bcl-2基因是最主要的抗凋亡基因，它编码的Bcl-2蛋白主要分布在线粒体外膜、细胞膜内表面、内质网膜及核膜等处，其主要生物学功能为延长细胞寿命并增加细胞对多种凋亡刺激因素的抗性^[29-30]。Bax基因属于Bcl-2基因家族，编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体，对Bcl-2产生阻抑作用，是促凋亡基因^[31]。研究发现Bcl-2/Bax两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素，当Bcl-2/Bax比值上调，则抑制细胞凋亡。精原干细胞在体外培养时，细胞凋亡贯穿其全过程。与对照组相比，bFGF组、IGF-1组、bFGF+IGF-1组细胞中Bax蛋白相对表达水平显著下降(P < 0.01)，Bcl-2蛋白相对表达水平以及Bcl-2/Bax比值均显著升高(P < 0.05)。与bFGF组、IGF-1组比较，bFGF+IGF-1组细胞中Bax蛋白相对表达水平进一步下降(P < 0.01)，Bcl-2蛋白相对表达水平以及Bcl-2/Bax比值进一步升高 (P < 0.05)。

总之，在一定条件下体外培养精原干细胞，bFGF、IGF-1通过上调PCNA和Bcl-2蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，二者联合作用效果最佳；精原干细胞在体外的增殖与凋亡为研究和阐明精子发生机制提供了新的方法和途径，但是精原干细胞在体外存活和增殖受到多种因素的影响，体外培养的条件以及某些基因方面的研究还不是十分明了，因此有必要对精原细胞的体外培养体系以及其增殖、凋亡相关基因作一下研究。另外，实验不能完全模拟体内的环境进行精原干细胞培养，其在增殖过程中的作用机制等问题还有待进一步分析。

碱性成纤维细胞生长因子及胰岛素样生长因子1对精原干细胞增殖凋亡影响的机制

Mechanism underlying basic fibroblast growth factor and insulin-like growth factor-1 effects on proliferation and apoptosis of spermatogonial stem cells

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