蛋白芯片筛选用于培养Muse细胞的纤维蛋白原和明胶组合基质

doi:10.12307/2022.637

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (21): 3312-3318.doi: 10.12307/2022.637

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蛋白芯片筛选用于培养Muse细胞的纤维蛋白原和明胶组合基质

李秀亚1，盛扬1，王圣依2，黎悦2，张汝芝2，潘艳3，孙一新1，邓林红3，Mark Bradley4，张嵘1

1常州大学材料科学与工程学院，江苏省常州市 213164；2苏州大学附属第三医院皮肤性病科，江苏省常州市 213000；3常州大学生物医学工程与健康科学研究院，江苏省常州市 213164；4爱丁堡大学化学学院，苏格兰爱丁堡市 EH93 JJ1

收稿日期:2021-03-18 接受日期:2021-04-28 出版日期:2022-07-28 发布日期:2022-01-27
通讯作者: 张嵘，教授，常州大学材料科学与工程学院，江苏省常州市 21316
作者简介:李秀亚，女，1997年生，江苏省南通市人，汉族，常州大学材料科学与工程学院在读硕士，主要从事生物医用材料研究。
基金资助:
江苏省六大人才高峰创新团队项目(SWYY-CXTD-001)，项目负责人：张嵘；常州市科技局国际合作项目(CZ20190019)，项目负责人：张嵘

Preparation of protein chips for screening matrix for Muse cell culture based on fibrinogen and gelatin

Li Xiuya1, Sheng Yang1, Wang Shengyi2, Li Yue2, Zhang Ruzhi2, Pan Yan3, Sun Yixin1, Deng Linhong3, Mark Bradley4, Zhang Rong1

1School of Materials Science and Engineering, Changzhou University, Changzhou 213164, Jiangsu Province, China; 2Department of Dermatology and Venereology, Third Affiliated Hospital of Soochow University, Changzhou 213000, Jiangsu Province, China; 3Institute of Biomedical Engineering and Health Sciences, Changzhou University, Changzhou 213164, Jiangsu Province, China; 4School of Chemistry, University of Edinburgh, Edinburgh EH93 JJ1, Scotland

Received:2021-03-18 Accepted:2021-04-28 Online:2022-07-28 Published:2022-01-27
Contact: Zhang Rong, Professor, School of Materials Science and Engineering, Changzhou University, Changzhou 213164, Jiangsu Province, China
About author:Li Xiuya, Master candidate, School of Materials Science and Engineering, Changzhou University, Changzhou 213164, Jiangsu Province, China
Supported by:
the Six Talent Peak Innovation Team Project of Jiangsu Province, No. SWYY-CXTD-001 (to ZR); Changzhou Science and Technology Bureau International Cooperation Project, No. CZ20190019 (to ZR)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
蛋白基质：表面用蛋白质修饰的用于细胞体外培养的基质材料，该文中用于Muse细胞的培养。
Muse细胞：为应激耐受多系分化细胞，是在人骨髓与皮肤中发现的新型干细胞，具有多能性、低端粒酶活性及非致瘤性，在再生医疗方面有很大的应用潜力。

背景：Muse细胞在再生医学中具有巨大的医疗潜力，但目前其体外培养需要通过细胞簇悬浮的方法，不利于大规模扩增和应用。蛋白质是细胞外基质的重要组成部分之一，不同的蛋白质在细胞生长过程中起着不同的作用，因此可以通过高通量的方法快速筛选有利于Muse细胞在二维表面黏附扩增的蛋白质基质材料。
目的：选出合适的蛋白质基材，用于Muse细胞的表面黏附培养和传代。
方法：以牛血清白蛋白、牛血纤维蛋白原和明胶为原料，通过喷墨打印进行点样和蛋白质两两物理混合，制备成蛋白微点阵列芯片，利用高通量筛选方法选出适合Muse细胞黏附的最佳蛋白质组合。采用常规方法在蛋白基材表面进行Muse细胞传代培养并进行表征。
结果与结论：①由高通量筛选出两种有利于原代Muse细胞黏附的蛋白组合，两种组合分别为：牛血清白蛋白与明胶、牛血纤维蛋白原与明胶，组合比例均为7/17；②利用CCK8法测试原代Muse细胞在两种组合蛋白包被板的生长状况，各组细胞都呈现正常的增殖情况；经过6 d的培养，在牛血纤维蛋白原与明胶组合包被板上培养的细胞呈现较好的增殖状态；③通过对在蛋白包被板上传代培养的1代及3代Muse细胞的免疫荧光染色结果进行分析，结果显示，由牛血纤维蛋白原和明胶按7/17比例混合制备的基材能支持Muse细胞至少3代的黏附培养与扩增，并且维持较好的干细胞特性。

https://orcid.org/0000-0001-7295-3116 (李秀亚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: Muse细胞, 细胞医疗, 细胞扩增, 牛血清白蛋白, 牛血纤维蛋白原, 明胶, 高通量筛选, 干细胞特性

Abstract: BACKGROUND: Stress-tolerant multilineage differentiated (Muse) cells have excellent medical potential for regenerative medicine. However, at present, Muse cells need to be cultured and proliferated in vitro by suspension of cell aggregation, which is not conducive to large-scale expansion and application. Protein is one of the important components of extracellular matrix. Different proteins play different roles in cell growth. Therefore, the high-throughput method can be used to rapidly screen protein matrix that is conducive to the adhesion and proliferation of Muse cells on a two-dimensional surface.
OBJECTIVE: To identify suitable protein substrates for surface adhesion and passaging of Muse cells.
METHODS: Bovine serum albumin, bovine blood fibrin, and gelatin were used as raw materials, and their solutions were printed on glass slides by an ink jet printer and mixed on site to prepare protein microarray chips. The optimal protein combination for the adhesion of Muse cells was identified by using high-throughput screening approach. The Muse cells were cultured and passaged on the identified protein substrates for characterization.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Two protein combinations were obtained by high-throughput screening, which were beneficial to the adhesion of primary Muse cells. They were bovine serum albumin/gelatin and bovine blood fibrinogen/gelatin, with combination ratios of 7/17 for both. (2) CCK-8 assay showed that Muse cells proliferated well in all groups. Among them, cells cultured on plates coated with bovine blood fibrinogen/gelatin proliferated well in 6 days. (3) By analyzing the immunofluorescence staining results of passages 1 and 3 of Muse cells cultured on the protein-coated plate, it was found that the combination of bovine blood fibrinogen and gelatin with a ratio of 7/17 in weight supported the adhesion and proliferation of Muse cells for at least 3 passages, maintaining good stem cell characteristics.

Key words: Muse cell, cell therapy, cell amplification, bovine serum albumin, bovine blood fibrinogen, gelatin, high-throughput screening, stem cell characteristics

中图分类号:

李秀亚, 盛扬, 王圣依, 黎悦, 张汝芝, 潘艳, 孙一新, 邓林红, Mark Bradley, 张嵘. 蛋白芯片筛选用于培养Muse细胞的纤维蛋白原和明胶组合基质[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3312-3318.

Li Xiuya, Sheng Yang, Wang Shengyi, Li Yue, Zhang Ruzhi, Pan Yan, Sun Yixin, Deng Linhong, Mark Bradley, Zhang Rong. Preparation of protein chips for screening matrix for Muse cell culture based on fibrinogen and gelatin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(21): 3312-3318.

图/表（结果） 5

2.1 Muse细胞在微点阵列芯片上的培养和高通量筛选蛋白芯片的制备与课题组以前的聚合物芯片制备方法类似[28，30]，不同之处在于先用氯硅烷对玻璃芯片进行了修饰，然后在点阵中固定聚乙烯亚胺，用过量的1，6-己二醇二丙炔酸酯处理玻璃片，通过点击化学反应得到含有丙炔酸酯基团的聚乙烯亚胺点阵，在点阵中打印蛋白及其混合液后，在一定温度下蛋白质能通过点击化学反应与聚乙烯亚胺上的丙炔酸酯基团反应，从而被固定在点阵中获得蛋白芯片。
作者对各步反应进行了分析，证明成功获得了蛋白芯片(结果没有在文中展示)。实验共使用了3种蛋白，按照不同比例两两组合，制备了包含190个蛋白质微点的蛋白芯片。先用灭菌后的蛋白质芯片培养Muse细胞24 h，细胞固定后用DAPI进行细胞核染色，通过高内涵荧光显微镜扫描拍照，对每个微点上细胞黏附的数量进行计数，结果见图3。微点A14C34和B14C34上细胞黏附数量多于对照蛋白微点(蛋白C为对照)，初步认定这两种组合是有利于Muse细胞黏附的基质。

2.2 蛋白质在培养板上的吸附很多蛋白都能在细胞培养板上通过物理吸附而附着在培养板表面，例如明胶或胶原蛋白常用于包被细胞培养板。为证明实验中使用的蛋白能吸附在培养板上，用紫外光谱对蛋白包被的培养板进行了分析。首先对配制好的固含量0.1%的蛋白A与蛋白B进行检测，得知两种蛋白紫外吸收峰在280 nm附近，见图4a。把固含量0.1%的蛋白溶液加入六孔细胞培养板，见图4b，置于37 ℃环境下包被3 h后移除蛋白溶液，用PBS清洗2次后晾干，用酶标仪测试A值，由于孔板对蛋白质有一定的吸附性，包被了蛋白的孔板的A值高于未包被蛋白的对照孔，见图4c。对于包被好的孔板，用PBS在37 ℃下浸泡3 h后吸干PBS，再次用酶标仪测试，蛋白包被孔的A值依然高于对照孔，见图4d，这证明蛋白质的物理吸附能有效包被培养板。

2.3 原代Muse细胞在蛋白质包被板上的生长根据原代Muse细胞生长曲线可以看出，Muse细胞生长缓慢，见图5a，但在第4天后，蛋白A14C34组合包被板、B14C34蛋白质组合包被板及明胶包被板上的细胞密度相比逐渐增大，见图5b，结合第6天的DAPI染色结果可以看出，蛋白B14C34组合对原代Muse细胞的增殖有一定促进作用，而蛋白A14C34组合上生长的细胞的密度与明胶包被的结果很接近
(P > 0.05)，见图5c-e。

2.4 在蛋白包被板上长期培养的Muse细胞的荧光免疫表征对传了1代与3代的Muse细胞进行免疫染色以考察细胞的干性维持情况，结果表明，蛋白A14C34、B14C34与C包被孔板上的第1代Muse细胞均对抗体SSEA-3和SOX2呈阳性表达，见图6，且A14C34包被板上的细胞密度稍小于对照组，B14C34包被板上的细胞密度则略大于对照组，总的来说，几种蛋白包被板上1代Muse细胞增殖效果无明显差异，见图6p所示。

Muse细胞在蛋白包被板上培养并传至第3代，免疫染色后进行显微荧光拍照，见图7，结果表明在干性维持方面，明胶包被板上Muse细胞的SSEA-3与SOX2阳性表达均变弱，见图7a、d、g、j、m、q所示；A14C34包被板上的Muse细胞对于SSEA-3的表达有一部分细胞变弱了，对于SOX2都能呈现较强的阳性表达，见图7b、e、h、k、n、q所示；B14C34包被板上Muse细胞的SSEA-3与SOX2阳性表达均较强，见图7c、f、i、l、o、q所示；在Muse细胞扩增能力方面，样品组与对照组很接近，但从平均细胞密度的趋势上看，A14C34包被板不如对照组，B14C34包被板则优于对照组，见图7p所示。因此，蛋白A14C34与B14C34组合均对Muse细胞的长期培养有一定的干性维持能力，但B14C34组合对Muse细胞的干性维持效果更好，且更有利于细胞的扩增。

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引言

组织工程因可作为治疗某些疾病的重要潜在替代方案或补充方案而兴起[1]。种子细胞的获取是组织工程的基础，很多细胞曾被用于组织工程的种子细胞，如间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞等，但由于各种原因大部分研究成果没有规模化应用于临床，其中一个重要原因是难以获得足够数量的种子细胞[2]。具有足够活性且无免疫排斥作用的种子细胞的短缺，已成为当前再生医学发展的瓶颈之一。
Muse细胞是间充质干细胞的特定子集，最早由KURODA等[3]在2010年报道。Muse细胞具有自我再生能力、组织修复功能、低端粒酶活性与非致瘤性，并能分化成3个胚层的代表性细胞[4-5]。研究表明，Muse细胞表达了多种多能性标记物，包括Nanog、Oct4、Sox2和SSEA-3[6-7]。Muse细胞被认为是理想的种子细胞，在组织工程和细胞治疗方面具有广阔的应用前景[8-10]。到目前为止，Muse细胞的传代培养都是通过悬浮培养与贴壁培养交替进行[11-12]，通过悬浮培养(悬浮培养基为甲基纤维素与常规培养基的混合物)形成Muse拟胚体细胞簇，整个细胞簇对SSEA-3抗体表达阳性，以此来维护细胞干性；将细胞簇分离出来，接种到明胶包被板(明胶采用物理吸附法包被到细胞培养板)后贴壁培养，在贴壁过程中细胞得到扩增，这样一次悬浮培养与贴壁培养即为Muse细胞的一次传代培养[13-14]。当前Muse细胞的培养方法比较繁琐，且细胞增殖慢[15]，细胞数量、形态、干性等的分析和观察困难，因此迫切需要研发可供其二维培养扩增的培养基质。
蛋白质作为生物体中细胞赖以生存的固体环境元素，对细胞的增殖与分化发挥着重要作用。一些研究表明，采用不同蛋白质基质培养干细胞可以影响干细胞的生长并保持其多能特性，且蛋白质本就来源于生物体，具有很好的细胞相容性[16]，是理想的细胞培养材料。2005年LI等[17]及2008年 BRAAM 等[18]分别利用层粘连蛋白与人重组蛋白对人类胚胎干细胞的培养进行了改进。但层粘连蛋白、人重组蛋白等稀有蛋白质产量较低、价格昂贵，此次实验从产量高价格相对便宜的牛血清白蛋白及牛血纤维蛋白原展开研究。血清白蛋白及纤维蛋白原可以作为疾病的检测凭据[19-20]，但这两种蛋白在细胞培养方面的应用还没有相关研究，因此，此次实验利用两种常规蛋白结合Muse细胞常用的贴壁蛋白(明胶)制备蛋白芯片，筛选合适的蛋白质或者组合用于干细胞的培养实验。
微点阵列芯片是一种高通量筛选的有效载体[21-22]，因为自动化、高通量和并行化的特点被广泛应用于生物学、检疫、医药等领域[23-25]。ANDERSON等[26]开发了一种由不同聚合物组成的微点阵列芯片，以筛选适合细胞生长和增殖的新型合成聚合物生物材料。课题组也曾经以丙烯酸酯类单体为原料，通过喷墨打印的方法在载玻片上打印单体溶液的微点并引发现场聚合，制备了聚合物微点阵列芯片并用于筛选培养脂肪干细胞的聚合物基质材料[27-28]。但是，聚合物涂层在大规模细胞培养的应用中存在制备方法复杂、表面均匀性有待提高、有的聚合物涂层容易破碎并污染细胞等不足，因此，作者考虑采用高通量的方法筛选蛋白质基材用于Muse细胞的体外扩增。
为了在载玻片上固定蛋白微点，该文采用喷墨打印机在改性玻璃片上打印蛋白质溶液，改性载玻片上含有的1，6-己二醇二丙炔酸酯基团能够在60 ℃下与蛋白质发生点击化学反应[29]，从而固定打印的蛋白微点形成蛋白质微点阵列芯片，然后在芯片上进行细胞的接种与培养，观察不同蛋白质组合对Muse细胞黏附和增殖的影响，最后将筛选出的蛋白组合放大到盖玻片上，进一步考察Muse细胞的扩增及其多能特性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验，t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年9月至2020年9月在常州大学材料科学与工程学院完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂氢氧化钠(NaOH，国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；明胶(国药集团化学试剂有限公司，化学纯)；1H，1H，2H，2H-全氟辛基二甲基氯硅烷(Alfa Aesar，化学纯)；3-氯丙基三甲氧基硅烷(麦克林，化学纯)；聚乙烯亚胺(阿拉丁，Mw=1 800)；1-甲基-2-吡咯烷酮(上海凌峰化学试剂有限公司，分析纯)；1，6-己二醇二丙炔酸酯(联合实验室合成，化学纯)；牛血清白蛋白(源叶生物科技有限公司，生化试剂)；牛血纤维蛋白原(源叶生物科技有限公司，生化试剂)；中性蛋白酶(Roche，生物试剂)；Ⅳ型胶原酶(StemCell Technologies，生物试剂)；0.25%Trypsin/0.02%EDTA(Thermo Fisher，生物试剂)；胎牛血清(Gibco，生物试剂)；Anti-SSEA-3(Thermo Fisher，生物试剂)；Anti-SOX2(abcam，生物试剂)；DAPI(DOJINDO，生物试剂)；Triton-X-100(Solarbio，T8200，生化试剂)；CCK8试剂盒(Abmole Bioscience)。
1.3.2 主要设备与仪器微点喷墨打印机(Autodrop Compact，德国Microdrop Technologies GmBH)；三目倒置荧光显微镜(TS2-FL型，日本尼康)；酶标仪(Epoch，美国BioTek)；紫外可见-分光光度计(UV-2450，日本岛津公司)；离心机(TGL-16M，上海卢湘仪器有限公司)；生物安全柜(HR30-IIA2，青岛海尔特种电器有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 显微镜载玻片的预处理将显微镜载玻片(Menzel GmBH Co. KG，德国多芬，76 mm×26 mm)浸入1 mol/L氢氧化钠溶液中24 h，依次用蒸馏水和乙醇冲洗，常温干燥。按照程序设置，使用喷墨打印机在载玻片上打印蔗糖(质量分数10%水溶液)微点阵列，糖点间距为2 mm×1 mm，得到糖点芯片。

在载玻片的周围涂布1H，1H，2H，2H-全氟辛基二甲基氯硅烷，于封闭环境中放置24 h，依次用丙酮和水洗涤除去过量的1H，1H，2H，2H-全氟辛基二甲基氯硅烷和表面的糖点。风干后，在每张载玻片的表面涂上10 μL 3-氯丙基三甲氧基硅烷，室温下封闭环境中放置24 h，用乙腈冲洗去除多余的偶联剂，再将芯片置于含质量分数5%聚乙烯亚胺的无水乙醇溶液中60 ℃浸泡48 h，用乙醇清洗多次，得到氨基化玻璃芯片。最后将含质量分数10%1，6-己二醇二丙炔酸酯的1-甲基-2-吡咯烷酮溶液涂抹在芯片表面，用洗净的载玻片覆盖，室温静置20 min，揭去上层载玻片，用丙酮洗净晾干，得到表面含有1，6-己二醇二丙炔酸酯基团的改性玻璃片，见图1。

1.4.2 蛋白质芯片的制备使用1-甲基-2-吡咯烷酮与水的混合液作为溶剂(比例为1∶4)，配制固含量为1%的牛血清白蛋白(A)、牛血纤维蛋白原(B)及明胶(C)溶液，用喷墨打印机将蛋白质溶液打印到改性载玻片上，按照蛋白质搭配方案，如图2a所示，每个微点共打印48滴蛋白质溶液(每滴0.2 μL)，每种蛋白质组合打印6个重复点，每两种蛋白质按照42/6、38/10、34/14的打印滴数比例等构成10种组合，形成蛋白组合梯度，对照点为明胶微点。打印好的蛋白芯片装入密封盒后在60 ℃烘箱中加热2 h，然后将芯片放在去离子水中浸泡2次，每次10 min，常温晾干后得到蛋白质芯片，见图2b，芯片上的微点呈圆形或椭圆形，见图2c，d所示。将干燥的蛋白质芯片放入-20 ℃冰箱保存备用。

1.4.3 Muse细胞的培养与高通量筛选
人真皮成纤维细胞的提取、培养：由常州市第一人民医院皮肤科提供包皮环切手术样本(供者10-30岁，无传染病，供者及家属对实验知情同意)，将样本用碘伏浸泡5 min后，用PBS冲洗干净，去除脂肪、皮下组织等，眼科剪剪成2 mm×2 mm小块，置于固含量0.25%的中性蛋白酶/PBS溶液中(0.22 μm过滤器过滤后使用)37 ℃下消化1.5-2 h，手术镊分离表皮和真皮。
真皮组织剪碎并用固含量0.25%的Ⅳ型胶原酶/PBS溶液(0.22 μm过滤器过滤后使用)37 ℃下消化1.5-2 h，用含体积分数10%胎牛血清的低糖完全培养基终止消化，用200目筛网过滤，取滤液，1 500 r/min离心
5-10 min，移去上层液，将细胞重悬于低糖完全培养基(含体积分数10%胎牛血清)中，用血球计数板进行细胞计数，调整细胞浓度为(4-6)×109 L-1，接种到25 cm2的培养瓶内，放入体积分数5%CO2、37 ℃培养箱内培养。当细胞达到80%-90%融合时，用0.25%Trypsin/0.02%EDTA溶液消化成单细胞分散，以1∶3进行传代，培养基每3 d换液1次。
Muse细胞的提取与接种：选取4代以内成纤维细胞(2-6)×106个，加入0.25%Trypsin/0.02%EDTA消化液5 mL，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中消化16 h，用低糖完全培养基(L-DMEM+体积分数10%胎牛血清)中和，2 500 r/min离心5 min，1 000 r/min离心5 min，去除死细胞。移除上清液，用完全培养基重悬细胞并计数后接种培养。目前常用的Muse细胞培养方法比较复杂，通常采用明胶包被板黏附培养与甲基纤维素包被板悬浮培养交替进行，达到细胞传代扩增的目的，悬浮培养时形成类胚体的细胞簇。实验直接将Muse细胞接种在蛋白包被板上，细胞黏附平铺在蛋白基质上生长扩增，当细胞达到80%-90%融合时，用0.25%Trypsin/ 0.02%EDTA溶液消化成单细胞分散，以1∶3进行传代，培养基每3 d换液1次，传至第3代后进行细胞分析。
高通量筛选：将蛋白芯片两面分别进行紫外杀菌30 min，将有蛋白微点的一面朝上放入4孔培养板，依次用无水乙醇与PBS浸洗两三次(每次5 min)，按照4×104/cm2的密度接种细胞，用低糖培养基(含有体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素)培养24 h；用40 g/L多聚甲醛溶液(5 mL/孔)固定，PBS浸洗3次，用1 mg/L DAPI溶液(5 mL/孔)染色，PBS浸洗3次；用高内涵显微镜对微点进行荧光拍照，用ImageJ软件处理荧光照片，对每个微点上黏附的细胞进行计数，与对照点上的黏附细胞数进行比较，选出黏附细胞最多的蛋白组合。
1.4.4 蛋白质包被孔板方法配制固含量0.1%的蛋白质水溶液，用0.22 μm的无菌滤器过滤除菌后，加入96孔细胞培养板(200 μL/孔)中，放入37 ℃培养箱中孵育3 h，取出培养板，移除蛋白质溶液后放在无菌操作台晾干，备用。
1.4.5 蛋白对孔板的吸附实验用紫外分光光度计测试0.1%牛血清白蛋白与牛血纤维蛋白原水溶液的吸光度值，确定吸收峰位置，采用1.4.4方法中蛋白质(牛血清白蛋白，牛血纤维蛋白原)包被孔板，用酶标仪测试包被蛋白后孔板的吸光度值。对于包被好的孔板，用PBS在37 ℃下浸泡3 h，吸干PBS，再次用酶标仪测试吸光度值。

1.4.6 Muse细胞的生长曲线绘制用固含量0.1%的A14C34、B14C34与C溶液包被96孔细胞培养板，按照1×107 L-1的细胞浓度接种0代Muse细胞，每孔加入100 μL细胞悬液。每隔24 h取3个孔加入培养基10%的CCK-8溶液，置于37 ℃下培养3 h，用酶标仪测定吸光度值，按照公式1计算细胞生长率，绘制生长曲线。

其中，CGR为细胞生长率，A0为Muse细胞在蛋白包被板培养后经CCK-8处理后的吸光度值；AL为完全培养基中加入CCK-8并培养后的吸光度值。
1.4.7 Muse细胞的免疫荧光染色分别对在蛋白包被孔板上培养的1代及3代的Muse细胞进行SOX2与SSEA-3免疫荧光染色，以表征Muse细胞的干性。将Muse细胞按照1×107 L-1的细胞浓度接种在用蛋白包被的96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液；培养5-7 d至细胞80%融合后移去培养基，用PBS洗涤两三次(100 μL/孔)，移除PBS，用40 g/L多聚甲醛溶液(100 μL/孔)于常温下固定10 min，移除多聚甲醛溶液，用PBS洗涤两三次；用0.1%Triton-X-100溶液(100 μL/孔)于常温下处理15 min，移除后用PBS洗涤1次；用3%牛血清白蛋白溶液(100 μL/孔)在室温下进行细胞封闭处理30 min，加入直标抗体SSEA-3(1∶50)和SOX2(1∶100)的3%牛血清白蛋白溶液(100 μL/孔)，在4 ℃黑暗环境下处理18 h；PBS洗涤两三次，用1 mg/L的DAPI溶液(100 μL/孔)常温下处理15 min；PBS洗涤两三次后荧光显微镜下拍照。
1.5 主要观察指标不同蛋白质组合对Muse细胞黏附和增殖的影响。
1.6 统计学分析数据采用OriginPro 2018统计软件进行处理，实验结果以均数±标准误差表示。各实验组间与对照组的比较用两独立样本均数t检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

细胞外基质是干细胞赖以生存的环境，细胞外基质对于细胞的生物行为如黏附、迁移和分化等都有直接的影响。目前，通常将提取的Muse细胞先用甲基纤维素培养基进行悬浮培养，得到Muse细胞的拟胚体细胞簇，再将细胞簇接种到明胶包被板贴壁培养，以此完成Muse细胞的一次传代，此方法Muse细胞增殖慢，很难达到临床应用所需的种子细胞数量。从Muse细胞的提出至今，大量科研人员针对Muse细胞的医疗价值进行研究，且取得了可观的结果，但极少有人研究改进Muse细胞的培养机制，因此，实验采用高通量筛选的方法选出有利于Muse细胞生长的蛋白质，采用物理吸附法制备对应蛋白质细胞培养板并对Muse细胞采用常规方法进行传代培养，发现相比于A14C3蛋白4基质及对照组，B14C34蛋白基质对原代Muse细胞增殖有很好的效果；经过Muse细胞常规方法的传代培养发现，在两组基质上培养的1代Muse细胞的增殖能力与对照组相比无明显差异(P > 0.05)，且对于SOX2与SSEA-3抗体均呈100%阳性表达；在对应蛋白基质上将Muse细胞传代至第3代，发现实验组细胞增殖能力与对照组相比无明显差异(P > 0.05)，实验组对SSEA-3的表达比率与对照组相比也无显著差异，但两实验组细胞对于抗体SOX2的阳性表达比率相对于对照组有统计学差异性(P < 0.05)。因此，基质B14C34对于Muse细胞的增殖与干性维持有一定的优势。
该文所涉及的基于牛血清白蛋白、牛血纤维蛋白原及明胶的蛋白组合的研究局限于其对细胞的增殖和免疫表型的影响，将来的工作会深入到蛋白组合基质与细胞表面蛋白等分子的相互作用，甚至对干细胞特性影响的细胞信号通路的分析。
由于所使用蛋白相对于很多稀有蛋白更加容易获得、成本低廉，此次研究尝试将其应用到Muse细胞的规模化体外培养，推进Muse细胞培养方法的改进，并进一步推动Muse细胞的临床应用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

蛋白芯片筛选用于培养Muse细胞的纤维蛋白原和明胶组合基质

Preparation of protein chips for screening matrix for Muse cell culture based on fibrinogen and gelatin

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