载细胞多孔甲基丙烯酸酐化明胶三维支架及对细胞行为的影响

doi:10.12307/2022.253

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (16): 2532-2539.doi: 10.12307/2022.253

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载细胞多孔甲基丙烯酸酐化明胶三维支架及对细胞行为的影响

李明欣1，李军2，王文朝2，宋平3，雷皓远3，桂兴宇3，张程云2，周长春3，刘雷2

1四川大学华西临床医学院，四川省成都市 610041；2四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041；3四川大学生物材料工程学院，四川省成都市 610065

收稿日期:2021-05-12 修回日期:2021-05-14 接受日期:2021-07-16 出版日期:2022-06-08 发布日期:2021-12-23
通讯作者: 周长春，博士，教授，四川大学生物材料工程学院，四川省成都市 610065 刘雷，主任医师，教授，四川大学华西医院骨科，四川省成都市 610041
作者简介:李明欣，男，1991年生，辽宁省丹东市人，汉族，四川大学华西临床医学院在读博士，主治医师，主要从事创伤骨科相关的骨缺损修复材料研究。
基金资助:
国家自然科学基金 (31971251)，项目负责人：周长春；国家自然科学基金 (8187090956)，项目负责人：刘雷；华西医院博士后科研发基金 (2019HXBH068)，项目负责人：李军；四川省科技厅项目(2019JDTD0008)，项目参与者：周长春；四川省科技厅项目(2019YFH0079)，项目负责人：周长春

Cell-carrying porous methacrylate anhydride gelatin three-dimensional scaffolds and their effects on cell behavior

Li Mingxin1, Li Jun2, Wang Wenchao2, Song Ping3, Lei Haoyuan3, Gui Xingyu3, Zhang Chengyun2, Zhou Changchun3, Liu Lei2

1West China Clinical College of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 2Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; 3Department of Biomaterials Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China

Received:2021-05-12 Revised:2021-05-14 Accepted:2021-07-16 Online:2022-06-08 Published:2021-12-23
Contact: Zhou Changchun, PhD, Professor, Department of Biomaterials Engineering, Sichuan University, Chengdu 610065, Sichuan Province, China Liu Lei, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
About author:Li Mingxin, Doctoral candidate, Attending physician, West China Clinical College of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31971251 (to ZCC); National Natural Science Foundation of China, No. 8187090956 (to LL); Postdoctoral Research and Development Fund of West China Hospital, No. 2019HXBH068 (to LJ); Sichuan Province Science & Technology Department Project, No. 2019JDTD0008 (to ZCC); Sichuan Province Science & Technology Department Project, No. 2019YFH0079 (to ZCC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
甲基丙烯酸酐化明胶：明胶是胶原经过不可逆分解得到的主要产物，被广泛应用于医疗及药品行业，具备良好的生物相容性及可降解性。甲基丙烯酸酐化明胶是在明胶的侧链氨基接枝光敏性基团，在保留其优异的生物学性能基础上具备了光敏性，加入光引发剂后可通过蓝光或紫外光激发固化反应，可形成具有一定强度的三维结构。
三维(3D)细胞培养技术：传统的二维细胞培养技术虽有利于细胞获取养分，但易形成接触抑制，仅能提供细胞的基本生理学信息。三维培养的细胞行为更接近于生物体内，可保留细胞的自然形态，允许细胞间形成广泛的连接，细胞的基因和蛋白表达水平更接近于体内。水凝胶支架内部的网络结构可留存大量水分，可模拟细胞在生物体内生存环境，是研究细胞行为的理想三维培养平台之一。

背景：水凝胶材料支架是三维培养细胞的理想材料之一，但水凝胶内部密集的网络结构对细胞增殖及舒展有明显抑制作用，水凝胶支架内部的多孔结构对上述问题有明显改善。
目的：探讨以甲基丙烯酸酐化明胶为支架材料、聚环氧乙烷溶液为造孔剂构建三维载细胞多孔水凝胶支架的方法，以及多孔水凝胶支架对细胞行为的影响。
方法：制备甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液，将二者分别以4∶1、3∶1、2∶1、1∶1的体积比混合，加入骨髓间充质干细胞，设计构建可载细胞的三维多孔水凝胶支架，表征支架的微观形貌与力学性能，利用活死染色观察细胞相容性、细胞骨架染色观察细胞形态。
结果与结论：①扫描电镜下可见，各组支架截面呈均匀分布的多孔结构，各孔隙之间相互连通，孔隙呈类椭圆形或类圆形，随着聚环氧乙烷溶液比例的增加，支架的孔径及孔隙率增加；②多频应变曲线显示，各组支架的应变均可达到40%以上，其中体积比1∶1支架的应变可达到60%；随着聚环氧乙烷溶液比例的增加，支架的储能模量下降，其中体积比1∶1支架的力学强度较差，仅能勉强维持支架的形态；③体外培养14 d的活死染色显示，各组支架内的细胞存活率均>85%；④体外培养14 d的细胞骨架染色显示，体积比3∶1支架中大部分细胞呈短梭形，体积比2∶1、1∶1支架中的细胞呈星形或长梭形，细胞间建立了广泛的连接；⑤结果表明，三维载细胞多孔水凝胶支架有利于骨髓间充质干细胞的舒展和增殖，其中体积比为2∶1的支架兼顾了力学强度及生物学性能，是较为理想的三维细胞培养平台。

https://orcid.org/0000-0001-9491-4425 (李明欣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨缺损, 多孔水凝胶, 甲基丙烯酸酐化明胶, 组织工程, 支架, 骨髓间充质干细胞, 三维培养, 光固化

Abstract: BACKGROUND: Hydrogel scaffolds are one of the ideal materials for three-dimensional cell culture. However, the dense network structure in the hydrogel can significantly inhibit the proliferation and extension of cells, and the porous structure in the hydrogel scaffolds can alleviate these problems.
OBJECTIVE: To investigate the method of constructing three-dimensional cellular porous hydrogel scaffold with methacrylate anhydride gelatin as scaffold material and polyethylene oxide solution as pore-forming agent, and the effect of porous hydrogel scaffolds on cellular behavior.
METHODS: Methacrylate anhydride gelatin hydrogel solution and polyethylene oxide solution were prepared, and mixed in a volume ratio of 4:1, 3:1, 2:1, and 1:1, separately. After adding bone marrow mesenchymal stem cells, a three-dimensional porous hydrogel scaffold that could carry cells were designed and constructed to characterize the microscopic morphology and mechanical properties of the scaffold. The live/dead staining was utilized to observe cell compatibility, and cytoskeleton staining was applied to observe cell morphology.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The scanning electron microscope showed that the cross-sections of scaffolds of each group displayed uniformly distributed porous structures, and the pores were connected to each other. The pores were oval-like or round-like. As the proportion of polyethylene oxide solution increased, the pore size of the scaffolds and porosity increased. (2) Multi-frequency strain curves showed that the strain of scaffolds of each group could reach more than 40%, among which the strain of the scaffold with a volume ratio of 1:1 could reach 60%. As the proportion of polyethylene oxide solution increased, the storage modulus of the scaffold decreased, and the mechanical strength of the volume ratio 1:1 scaffold was poor, and it could barely maintain the shape of the scaffold. (3) The live/dead staining of 14 days in vitro culture showed that the survival rate of cells of scaffolds in each group was >85%. (4) Staining of the cytoskeleton cultured for 14 days in vitro showed that most of the cells in the scaffold with a volume ratio of 3:1 were short spindle-shaped, and the cells in the scaffold with a volume ratio of 2:1 and 1:1 were star-shaped or long spindle-shaped. A wide range of connections was established among cells. (5) Three-dimensional cell-carrying porous hydrogel scaffold can significantly promote the spreading and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells. Porous hydrogels with a volume ratio of 2:1 have both mechanical strength and biological properties and can be a good platform for three-dimensional cell culture.

Key words: bone defect, porous hydrogel, methacrylate anhydride gelatin, tissue engineering, scaffold, bone marrow mesenchymal stem cells, three-dimensional culture, light curing

中图分类号:

李明欣, 李军, 王文朝, 宋平, 雷皓远, 桂兴宇, 张程云, 周长春, 刘雷. 载细胞多孔甲基丙烯酸酐化明胶三维支架及对细胞行为的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(16): 2532-2539.

Li Mingxin, Li Jun, Wang Wenchao, Song Ping, Lei Haoyuan, Gui Xingyu, Zhang Chengyun, Zhou Changchun, Liu Lei. Cell-carrying porous methacrylate anhydride gelatin three-dimensional scaffolds and their effects on cell behavior[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(16): 2532-2539.

图/表（结果） 8

2.1 甲基丙烯酸酐化明胶的合成与表征通过上述实验方法制备了甲基丙烯酸酐化明胶，冻干后呈白色海绵状固体，体视显微镜下可见疏松多孔结构，见图1A。普通光学显微镜下可见甲基丙烯酸酐化明胶呈密集连接的丝状结构，无色透明，见图1B。通过使用1H-NMR光谱分别测量原材料明胶以及合成的甲基丙烯酸酐化明胶的磁共振图像，见图1C、D。计算2.91×10-6处伯氨基峰的积分值来确定官能化的甲基丙烯酸基团的百分比来确定取代度，实验中所合成的甲基丙烯酸酐化明胶为中等取代度。

2.2 各组水凝胶支架的制备与力学表征将甲基丙烯酸酐化明胶固体溶解于PBS中，配置成10%的水凝胶溶液并用0.22 μm滤头过滤，呈无色透明且室温下稍黏稠的液体，见图2A。将聚环氧乙烷粉末配置成1.6%的溶液并用0.22 μm滤头过滤，呈透明清亮的液体，见图2B。将甲基丙烯酸酐化明胶溶液与聚环氧乙烷溶液混合后仍然为无色透明的液体，见图2C。通过将复合水凝胶溶液注入硅胶模具后，用蓝光手电距离水凝胶溶液5 cm照射30 s后，水凝胶支架成功固化，脱模后水凝胶支架呈长圆柱形，顶视图、底视图、侧视图可见水凝胶支架成分均一稳定，无色透明，见图2D-F。水凝胶支架具有一定的力学强度，通过应力应变曲线可观察到所有分组水凝胶应变均大于40%，随着聚环氧乙烷溶液比例的增加，应力应变曲线也随之明显改变，见图2G，聚环氧乙烷溶液的加入降低了水凝胶支架的杨氏模量。多频应变曲线可观察到纯水凝胶支架在10 Hz时的储能模量可达到14 kPa，体积比为1∶1的支架储能模量仅有3 kPa，见图2H。

2.3 各组水凝胶溶液的显微镜观察普通光学显微镜下可见，纯水凝胶溶液无色透明，成分均一稳定，见图3A；复合水凝胶溶液中均匀分布有聚环氧乙烷溶液的小液滴，随着聚环氧乙烷溶液体积的增加，小液滴的体积也随之增加，其中体积比为1∶1复合水凝胶溶液中小液滴之间出现了聚集融合趋势，见图3B-E。

2.4 各组水凝胶支架扫描电镜观察结果扫描电镜观察到甲基丙烯酸酐化明胶网络形成支架的整体结构，使支架截面呈均匀分布的多孔结构，各孔隙之间相互连通，孔隙呈类椭圆形或类圆形，见图4。冻干状态下纯水凝胶支架的孔径为(141.6±37.6) μm，孔隙率为(47.6±5.1)%；随着造孔剂比例的增加，支架的孔径及孔隙率增加，体积比1∶1多孔水凝胶支架孔径达到了(204.5±22.6) μm，孔隙率达到(75.9±5.2)%。

2.5 各组水凝胶支架内部孔隙观察激光共聚焦显微镜下可见，纯水凝胶支架内部为均一结构，见图5A；多孔水凝胶组中黑色部分为支架内部形成的孔隙结构，体积比4∶1多孔水凝胶支架中可见孔隙结构为均匀分散的球形结构，然而孔隙之间未能形成互相连接，体积比3∶1，2∶1，1∶1多孔水凝胶支架中开始出现互相连通的孔隙结构，见图5B-E。随着聚环氧乙烷溶液的比例的增加，支架孔隙率增加，见图5F。

2.6 三维载细胞水凝胶支架的活死染色活死染色显示，各组载细胞水凝胶支架中培养1，3，7，14 d的细胞存活率均> 85%，见图6。纯水凝胶支架培养第1，3，7天的细胞数量高于各多孔水凝胶支架，纯水凝胶支架中的细胞增殖速度较慢，第14天时体积比为1∶1水凝胶支架中的细胞数量超过了纯水凝胶支架。从细胞形态来看，纯水凝胶支架经过14 d的培养后大多数细胞仍然呈球形或短梭形，体积比1∶1多孔水凝胶支架在第14天时呈细胞长梭形且之间建立了广泛的连接。

2.7 三维载细胞水凝胶支架中的细胞形态鬼笔环肽及DAPI染色显示结果见图7。培养7 d时，纯水凝胶支架中的骨髓间充质干细胞均为球形；体积比3∶1多孔水凝胶支架中的部分细胞为球形，部分细胞为短梭形；体积比1∶1的多孔水凝胶中的细胞呈星形或长梭形，细胞间已建立连接。培养14 d时，纯水凝胶支架中的骨髓间充质干细胞大多数仍保持为球形，体积比3∶1多孔水凝胶支架中大部分细胞呈短梭形，积比2∶1、1∶1多孔水凝胶支架中的细胞呈星形或长梭形，细胞间建立了广泛的连接。

2.8 多孔水凝胶支架的细胞相容性由活死染色与鬼笔环肽及DAPI染色可知，甲基丙烯酸酐化明胶多孔水凝胶支架具有良好的细胞相容性。

参考文献

[1] LI JJ, EBIED M, XU J, et al. Current Approaches to Bone Tissue Engineering: The Interface between Biology and Engineering. Adv Healthc Mater. 2018;7(6):e1701061.
[2] 杨思敏,王新卫.自体骨移植修复骨缺损的临床研究进展[J].中国疗养医学,2019,28(9):945-948.
[3] 马武秀,程迅生.自体骨移植修复骨缺损的研究进展[J].中国骨与关节损伤杂志,2011,26(6):574-576.
[4] AZI ML, APRATO A, SANTI I, et al. Autologous bone graft in the treatment of post-traumatic bone defects: a systematic review and meta-analysis. BMC Musculoskelet Disord. 2016;17(1):465.
[5] BRACEY DN, JINNAH AH, WILLEY JS, et al. Investigating the Osteoinductive Potential of a Decellularized Xenograft Bone Substitute. Cells Tissues Organs. 2019;207(2):97-113.
[6] SHIBUYA N, JUPITER DC. Bone graft substitute: allograft and xenograft. Clin Podiatr Med Surg. 2015;32(1):21-34.
[7] PORZIONATO A, STOCCO E, BARBON S, et al. Tissue-Engineered Grafts from Human Decellularized Extracellular Matrices: A Systematic Review and Future Perspectives. Int J Mol Sci. 2018;19(12):4117.
[8] SHANBHAG S, PANDIS N, MUSTAFA K, et al. Bone tissue engineering in oral peri-implant defects in preclinical in vivo research: A systematic review and meta-analysis. J Tissue Eng Regen Med. 2018;12(1): e336-e349.
[9] 刘利永,周雷.组织工程用水凝胶研发现状和发展趋势：基于专利信息的分析[J].中国组织工程研究,2021,25(22):3527-3533.
[10] WOLF MT, DALY KA, BRENNAN-PIERCE EP, et al. A hydrogel derived from decellularized dermal extracellular matrix . Biomaterials. 2012; 33(29):7028-7038.
[11] RASTOGI P, KANDASUBRAMANIAN B. Review of alginate-based hydrogel bioprinting for application in tissue engineering. Biofabrication. 2019; 11(4):042001.
[12] AHSAN SM, THOMAS M, REDDY KK, et al. Chitosan as biomaterial in drug delivery and tissue engineering. Int J Biol Macromol. 2018;110: 97-109.
[13] BURDICK JA, PRESTWICH GD. Hyaluronic acid hydrogels for biomedical applications. Adv Mater. 2011;23(12):H41-56.
[14] KONG XB, TANG QY, CHEN XY, et al. Polyethylene glycol as a promising synthetic material for repair of spinal cord injury. Neural Regen Res. 2017;12(6):1003-1008.
[15] 顾亚伟,李牧,范子文,等.3D挤压成型生物打印含细胞水凝胶的理化性能[J].中国组织工程研究,2018,22(22):3583-3588.
[16] ABDOLLAHIYAN P, OROOJALIAN F, MOKHTARZADEH A, et al. Hydrogel-Based 3D Bioprinting for Bone and Cartilage Tissue Engineering. Biotechnol J. 2020;15(12):e2000095.
[17] BROWN TE, ANSETH KS. Spatiotemporal hydrogel biomaterials for regenerative medicine. Chem Soc Rev. 2017;46(21):6532-6552.
[18] CHEN J, ZHANG D, ZHANG T, et al. Effect of the vascularized bone components on the survival of vascularized composite allografts. J Surg Res. 2018;224:132-138.
[19] TENG W, LONG TJ, ZHANG Q, et al. A tough, precision-porous hydrogel scaffold: ophthalmologic applications . Biomaterials. 2014;35(32): 8916-8926.
[20] YING GL, JIANG N, MAHARJAN S, et al. Aqueous Two-Phase Emulsion Bioink-Enabled 3D Bioprinting of Porous Hydrogels. Adv Mater(Deerfield Beach, Fla). 2018;30(50):e1805460.
[21] 屈华伟,韩振宇,卓越,等.骨组织工程多孔生物支架设计研究进展[J].机械工程学报,2019,55(15):71-80.
[22] CHENG A, SCHWARTZ Z, KAHN A, et al. Advances in Porous Scaffold Design for Bone and Cartilage Tissue Engineering and Regeneration. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(1):14-29.
[23] PANSERI S, RUSSO A, CUNHA C, et al. Osteochondral tissue engineering approaches for articular cartilage and subchondral bone regeneration . Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc. 2012;20(6):1182-1191.
[24] ROSETI L, PARISI V, PETRETTA M, et al. Scaffolds for Bone Tissue Engineering: State of the art and new perspectives. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2017;78:1246-1262.
[25] NAAHIDI S, JAFARI M, LOGAN M, et al. Biocompatibility of hydrogel-based scaffolds for tissue engineering applications. Biotechnol Adv. 2017;35(5):530-544.
[26] YAMAMOTO S, OKADA K, SASAKI N, et al. Photoactivatable Hydrogel Interfaces for Resolving the Interplay of Chemical, Mechanical, and Geometrical Regulation of Collective Cell Migration. Langmuir. 2019;35(23):7459-7468.
[27] GIBBS DM, BLACK CR, DAWSON JI, et al. A review of hydrogel use in fracture healing and bone regeneration. J Tissue Eng Regen Med. 2016;10(3):187-198.
[28] AGARWAL R, GARCíA AJ. Biomaterial strategies for engineering implants for enhanced osseointegration and bone repair. Adv Drug Deliv Rev. 2015;94:53-62.
[29] HOSSEINI SA, MOHAMMADI R, NORUZI S, et al. Evolution of hydrogels for cartilage tissue engineering of the knee: A systematic review and meta-analysis of clinical studies. Joint Bone Spine. 2021;88(1):105096.
[30] YUE K, TRUJILLO-DE SANTIAGO G, ALVAREZ MM, et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of gelatin methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 2015;73:254-271.
[31] KLOTZ BJ, GAWLITTA D, ROSENBERG A, et al. Gelatin-Methacryloyl Hydrogels: Towards Biofabrication-Based Tissue Repair. Trends Biotechnol. 2016;34(5):394-407.
[32] JENSEN C, TENG Y. Is It Time to Start Transitioning From 2D to 3D Cell Culture? Front Mol Biosci. 2020;7:33.
[33] BILLIET T, VANDENHAUTE M, SCHELFHOUT J, et al. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 2012;33(26):6020-6041.

引言

车祸、创伤、恶性肿瘤等因素导致的骨缺损是临床常见且难以解决的问题，对此临床常用的治疗方法为植骨[1]。目前植骨常用移植物的来源包括自体骨[2-4]、异种骨[5-6]、各种无活性的人工骨等[7]，但这些植骨材料不仅来源有限且会导致取骨部位并发症、二次手术、传播传染性疾病、免疫排斥等问题，或因金属、高分子聚合物等人工骨支架力学强度较高，存在降解困难、降解速率与骨生长速率不一致及降解产物影响局部微环境等问题。对此，组织工程学提供了解决上述问题的一个可行思路[8-9]。组织工程学支架可由模仿细胞外基质的生物材料和具有促进细胞生长或诱导分化的生长因子构成[10]，从而为细胞附着、增殖和分化提供结构支持。明胶、海藻酸盐[11]、壳聚糖[12]、透明质酸[13]、聚乙二醇等天然或合成的水凝胶材料[14]，由于具备类细胞外基质的仿生特性、高度的三维水化网络结构、高效养分和代谢物交换能力及包裹细胞的强大能力，有利于组织再生和创伤愈合过程中细胞的迁移和生长，可提高骨组织再生和修复速度[15]，非常适用于作为移植细胞和生长因子缓释的载体，现已被广泛应用于制备组织工程水凝胶支架[16-17]。
甲基丙烯酸酐化明胶由明胶与甲基丙烯酸酐反应得到。明胶是由胶原蛋白降解得到的大分子，保留了可供细胞识别的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)及基质金属蛋白酶序列，且来源广泛、价格低廉、可完全降解，因其在加工过程中免疫原性显著降低，故具备良好的生物安全性。明胶侧链的氨基可被甲基丙烯酰基取代，使其具备光敏性。甲基丙烯酸酐化明胶在组织工程支架中已有广泛的应用。
除制备材料本身外，组织工程支架还应该具备相互连接的孔隙结构[18-20]，以允许有效的氧、营养物和废物交换及促进细胞的增殖和舒展。在制孔技术方面，传统的组织工程支架造孔方法有粒子致孔法、冷冻干燥法、气体发泡法等[21]，但由于细胞难以承受造孔加工过程而无法在支架内均匀播种细胞[22]。实验采用甲基丙烯酸酐化明胶为主要材料，实现了细胞三维培养的同时构建孔隙结构可调控的水凝胶支架，并对水凝胶溶液及多孔水凝胶支架进行物理及生物学性能测试。
实验采用甲基丙烯酸酐化明胶为主要材料，实现了骨髓间充质干细胞三维培养的同时构建了孔隙结构可调控的水凝胶支架，并对水凝胶溶液及多孔水凝胶支架进行物理及生物学性能的测试，验证多孔水凝胶支架对细胞增殖及舒展行为的影响，通过三维细胞共培养验证多孔水凝胶的优势。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计材料制备表征及体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年6月在四川大学生物材料工程学院完成。
1.3 材料明胶(VWR-AMRESCO，美国)；甲基丙烯酸酐溶液(阿拉丁，上海)；聚环氧乙烷粉末(百莱奥博，北京，平均相对分子质量300 000)；罗丹明B(索莱宝，北京)；PBS、透析膜(12-14 kD)、苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(Sigma-Aldrich，美国)；α-MEM培养基(Hyclone，美国)；含EDTA的胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco，澳大利亚)；扫描电镜(JSM-5900LV，JEOL)；体视显微镜(ZEISS SteREO Discovery.V20)；动态机械分析仪(TA-Q800，USA)；共聚焦激光扫描显微镜(LSM 880，蔡司)。
1.4 实验方法
1.4.1 甲基丙烯酸酐明胶的制备将100 mL PBS加热至50 ℃，以磁力搅拌子以500 r/min搅拌，加入10 g明胶粉末。待明胶粉末完全溶解后，将5 mL甲基丙烯酸酐溶液缓慢加入明胶溶液中，并维持搅拌速度或调节至更高的搅拌速度。反应两三小时后加入等体积的50 ℃ PBS并继续搅拌10 min中止反应。将产物用滤纸过滤沉渣，将粗产物在40 ℃的超纯水中透析7 d(透析袋截留量为12-14 kD)，随后将透析产物于冻干机中冷冻干燥3-7 d，得到泡沫样甲基丙烯酸酐化明胶固体。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的培养将2只出生3 d的乳兔(恩斯维尔，重庆)浸入1∶50新洁尔灭溶液中处死，浸入体积分数75%乙醇溶液5 min；去除肌肉组织，分离股骨及胫骨，于干骺端分离骨骺及骨干，以含体积分数20%胎牛血清的α-MEM培养液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液。以40 μm滤网过滤杂质后离心去除上清液，加入α-MEM完全培养基重悬后分装至10 cm培养皿培养，24 h后用PBS洗去未贴壁细胞，每3 d换液一次。传代至P3胰酶消化计数备用。
1.4.3 载细胞多孔水凝胶支架的制备取0.5 g甲基丙烯酸酐化明胶及25 mg光引发剂苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂加入避光的离心管，加入5 mL PBS，于50 ℃水浴中震荡充分溶解，得到可光固化的水凝胶溶液。将0.16 g聚环氧乙烷粉末加入10 mL PBS中充分震荡溶解，得到质量分数为1.6%的聚环氧乙烷溶液。分别将水凝胶溶液和聚环氧乙烷溶液通过0.22 μm滤膜过滤除菌。将除菌后的水凝胶溶液和聚环氧乙烷溶液按不同的体积比(4∶1，3∶1，2∶1，1∶1)混合均匀，以混合溶液重悬骨髓间充质干细胞并混合均匀，得到载细胞的可光固化水凝胶溶液，其中细胞浓度为5×109 L-1。取不同体积比的可光固化水凝胶溶液充分混合均匀后注入高温高压灭菌后的硅胶模具中，以蓝光手电距离模具5 cm处固化30 s。去除硅胶模具后加入PBS洗去聚环氧乙烷溶液，得到载细胞的多孔水凝胶支架。同理制备未加入聚环氧乙烷溶液的载细胞水凝胶支架(命名为纯水凝胶支架)。通过体视显微镜观察支架的俯视图、顶视图、侧视图，以及冻干后甲基丙烯酸酐化明胶固体的宏观形貌。
1.4.4 水凝胶支架的力学表征应力应变曲线及储能模量通过动态机械分析仪测定。应力应变曲线参数设置为：25 ℃，预紧力0.01 N，作用力0.01 N/min增加至0.05 N。储能模量测试参数设置为：25 ℃，振幅20 μm，预紧力 0.001 N，力轨迹125%，频率为1-10 Hz。
1.4.5 水凝胶支架的微观形貌
扫描电镜：通过扫描电镜观察水凝胶支架的微观结构和多孔性质。将光固化后的水凝胶于-20 ℃冰箱中冷冻，通过冷冻真空干燥机冻干来制备样品。然后将干燥的样品放置于载物台暴露其截面，在20 mA电流下用金溅射涂层70 s，使用扫描电镜在10 kV的加速电压下观察样品，使用ImageJ(NIH)进行图像分析。
显微镜观察：将纯水凝胶溶液、复合水凝胶溶液混合均匀后滴加到载玻片上，通过光学显微镜观察水凝胶溶液。将冻干甲基丙烯酸酐化明胶固体撕成薄片置于载玻片上，光学显微镜下观察。
1.4.6 水凝胶支架孔隙观察将带有罗丹明B红色荧光的甲基丙烯酸酐化明胶(100 g/L)和苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(5 g/L)溶解于PBS，充分溶解后通过0.22 μm滤膜过滤。将聚环氧乙烷粉末及苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(5 g/L)溶解在PBS中，0.22 μm滤膜过滤，得到聚环氧乙烷溶液。将两种溶液按照4∶1，3∶1，2∶1，1∶1的体积比充分混合均匀，共聚焦激光扫描显微镜下观察。使用ImageJ(NIH)进行图像分析。
1.4.7 活死染色将水凝胶封装的兔骨髓间充质干细胞在体外培养，于1，3，7，14 d取出样品。将样品用PBS洗涤2次，并浸入含有1 mg/L荧光素双乙酸盐和1 mg/L的碘化丙啶的PBS溶液中分别对活细胞和死细胞染色，然后再次用PBS洗涤1 min，共聚焦激光扫描显微镜下观察。使用Zen Blue(Zeiss)软件对图像进行处理，使用ImageJ(NIH)进行图像分析。
1.4.8 细胞骨架染色将水凝胶封装的兔骨髓间充质干细胞在体外培养，于7，14 d取样品拍照。将样品以40 g/L多聚甲醛溶液固定1 h，以PBS洗涤2次，浸入浓度为0.5%的Triton X-100溶液中5 min，用PBS洗涤样品2次，浸入浓度为100 nmol/L的鬼笔环肽工作液中室温避光孵育2 h；再次用PBS洗涤样品，将样品浸入浓度为100 nmol/L的DAPI工作液中30 s，取出样品，置于共聚焦激光扫描显微镜下观察。使用Zen Blue(Zeiss)软件对图像进行处理。
1.5 主要观察指标各组水凝胶支架的微观形貌与细胞相容性。

讨论

组织工程支架修复骨缺损是现阶段的研究热点[23-24]。水凝胶类材料由于具备类细胞外基质的仿生特性[25]、高度的三维水化网络结构、输送养分和排泄代谢物的高效性及包裹细胞的强大能力，有利于组织再生和创伤愈合过程中细胞的迁移和生长[26]，非常适用于作为移植细胞或生长因子缓释的载体[27]，可提高组织再生和修复的速度[28-29]。甲基丙烯酸酐化明胶由甲基丙烯酸酐与明胶制备而来，是一种光敏性的生物水凝胶材料[30-31]，具有优异的生物相容性，可由紫外光或可见光激发固化反应，固化条件温和，对细胞刺激较小，固化后可形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。甲基丙烯酸酐化明胶的生物相容性远优于基质胶、纤维蛋白胶，与胶原的性能相近，但成形性能远优于胶原[31]，是替代这类材料的理想选择之一。
传统水凝胶类组织工程支架是在体外预制支架后将细胞悬液滴加在冻干的水凝胶类支架表面[32]，此类支架存在细胞黏附差、分布不均匀的问题[33]，同时水凝胶类材料在凝胶化过程中形成的致密生物材料网络限制了细胞的舒展和增殖。
实验制备的多孔水凝胶支架，可在实现在三维培养细胞的同时构建互相连通的微观孔隙。首先制备了中等取代度甲基丙烯酸酐化明胶，取代度过高则水凝胶中分子网络过于密集，不利于细胞迁移和舒展，取代度过低则水凝胶的力学强度差。甲基丙烯酸酐化明胶具有优秀的生物相容性及可降解性和光固化能力，非常适合作为三维培养细胞的载体。常用的甲基丙烯酸酐化明胶浓度为5%-20%，低于5%浓度的甲基丙烯酸酐化明胶固化较为困难或固化后力学强度不佳，高于20%浓度的甲基丙烯酸酐化明胶虽力学强度较好，但细胞的增殖和舒展均较为困难，冻干后需保证完全干燥以便称质量时结果准确。实验配置了10%的水凝胶溶液和1.6%的聚环氧乙烷溶液，经过0.22 μm过滤后为无色透明均一稳定的溶液。制备成水凝胶支架后，通过光学显微镜可以观察到水凝胶样品成分均一稳定，但普通光学显微镜无法观察到支架内部的孔隙结构，故在后续实验中通过扫描电镜及激光共聚焦显微镜对支架的内部孔隙结构进行表征。多频应变曲线可观察到所有分组水凝胶支架的应变均可达到40%以上，而体积比1∶1多孔水凝胶支架的应变可达到60%，这可能是由于孔隙结构导致水凝胶网络变得更为稀疏，可更好地抵抗形变。但与此同时，多孔水凝胶支架的储能模量随着聚环氧乙烷溶液比例的增加而下降，体积比1∶1多孔水凝胶支架的力学强度较差，仅能勉强维持支架的形态，无法达到临床应用的要求。
通过光学显微镜观察到聚环氧乙烷溶液在水凝胶溶液中分散均匀且两者互不相容，体积比为4∶1时聚环氧乙烷溶液呈均匀分散的圆形液滴，随着聚环氧乙烷溶液比例的增加，液滴直径随之增加；当水凝胶溶液与聚环氧乙烷溶液体积比达到1∶1时，聚环氧乙烷小液滴之间呈现聚集融合的趋势。通过扫描电镜观察冻干后的样品，发现所有分组均可形成稳定、相互连通的孔隙结构，但随着聚环氧乙烷溶液比例的增加，孔径与孔隙率均随之增加，这可能是聚环氧乙烷溶液的占位效应导致单位体积内的水凝胶网络结构更为稀疏。通过激光共聚焦显微镜可以观察到纯水凝胶中无任何孔隙结构，体积比4∶1水凝胶支架的孔隙为均匀分散球形小孔，小孔之间互相独立，未见互相连通的孔隙结构，故后续细胞实验该组被舍弃；体积比为3∶1水凝胶支架开始出现相互连通的孔隙结构，且随着聚环氧乙烷溶液比例的增加，孔隙结构更加密集，孔径更大。结合扫描电镜及激光共聚焦显微镜的观察结果可以认为，此方法可成功构建水凝胶内部可调控的微观互连孔隙结构。
激光共聚焦活死染色图像可观察到各组支架中的细胞均具有较高的存活率，第1天时细胞存活率较其他时间点低，可能是由于消化过程中对细胞产生了损伤，但总体存活率均> 85%，证实水凝胶支架中的各个组分均具有良好的生物安全性。从细胞数量来看，纯水凝胶支架组具有较高的初始数量，但增殖速度缓慢；多孔水凝胶支架组随着聚环氧乙烷溶液比例的增加，第1天的初始数量随之降低，可能是由于配置载细胞的复合溶液重悬细胞过程中部分细胞进入了聚环氧乙烷溶液，光固化后聚环氧乙烷溶液仍然保持为液态，细胞随着洗脱聚环氧乙烷溶液的过程丢失了。通过细胞骨架染色可以观察到，纯水凝胶支架中的骨髓间充质干细胞在14 d的培养中难以舒展，无法形成细胞间连接，体积比3∶1的多孔水凝胶组虽可以舒展，但也无法形成细胞间连接；体积比2∶1、1∶1多孔水凝胶支架中的骨髓间充质干细胞均呈星形或长梭形，细胞间可形成广泛的细胞间连接，故可以认为多孔水凝胶支架对细胞的增殖和舒展有促进作用。结合水凝胶的力学实验表征，多孔水凝胶降低了支架的力学强度，但对细胞的增殖和舒展具有促进作用。作者认为体积比2∶1多孔水凝胶支架兼具了一定的力学强度和较好的生物学性能，适合用于构建骨髓间充质干细胞三维培养的研究平台。
综上所述，实验通过合成甲基丙烯酸酐化明胶、配置水凝胶溶液及聚环氧乙烷溶液成功构建了复合水凝胶溶液，经过模具浇筑后光固化可实现多孔三维水凝胶支架的构建，通过三维培养骨髓间充质干细胞证实了支架的生物安全性，验证了多孔水凝胶支架对细胞的舒展和增殖行为具有明显的促进作用，为后续制备载药、3D打印多孔水凝胶支架提供了理论支撑。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

载细胞多孔甲基丙烯酸酐化明胶三维支架及对细胞行为的影响

Cell-carrying porous methacrylate anhydride gelatin three-dimensional scaffolds and their effects on cell behavior

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[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	薛亚东, 周新社, 裴立家, 孟繁宇, 李键, 王金子. 自体髂骨块联合钛板重建Paprosky Ⅲ型髋臼骨缺损为假体提供坚强的初始固定#br#[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1424-1428.
[3]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[4]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[5]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[6]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.
[7]	吴玮玥, 郭晓东, 包崇云. 工程化外泌体在骨修复再生中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1102-1106.
[8]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[9]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[10]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[11]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[12]	杨峰, 赵骞, 张世轩, 赵铁男, 冯博. 雷帕霉素联合CD133抗体支架预防血管再狭窄的有效性和安全性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 579-584.
[13]	陈晓旭, 罗雅馨, 毕浩然, 杨琨. 脱细胞支架制备及其在组织工程和再生医学中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 591-596.
[14]	康坤龙, 王新涛. 生物支架材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的研究热点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 597-603.
[15]	沈佳华, 付勇. 基于石墨烯的纳米材料可否在干细胞领域应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 604-609.