2.1  载药微球及联合载药水凝胶的表征  聚乳酸-羟基乙酸微球的粒径分布范围为4-15 μm，均值为(9.93±6.56) μm；CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶中的聚乳酸-羟基乙酸微球较为均匀的分布在凝胶中，见图1。

2.2  联合载药水凝胶的体外释放  聚乳酸-羟基乙酸载药微球的异烟肼释放曲线显示，1 h内的突释约为23.3%，2 d内释放率约为42.6%，随后进入缓释期，在25 d后进入平台期，见图2A。聚乳酸-羟基乙酸载药微球中另一种药物基质细胞衍生因子1也显示出高突释，1 h内的累积释放率约为19.8%，2 d内释放率约为44.7%，随后进入缓释期，在25 d后进入平台期，见图2B。CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶由于外层壳聚糖-明胶的堵塞而表现出较长的缓释时间，表现出持续释放作用，异烟肼和基质细胞衍生因子1最初1 h释放的浓度较低分别是8.3%和8.5%，但在第2天异烟肼和基质细胞衍生因子1的累计释放率分别为15.2%和17.6%，这远远低于聚乳酸-羟基乙酸微球，见图2A，B。

2.3  联合载药水凝胶的的体外抗菌评价  4周后，大量结核分枝杆菌菌落包围聚乳酸-羟基乙酸载药微球周围，其抑菌直径为(2.13±0.34) mm，CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶的抑菌直径为(10.33±0.58) mm，见图3。聚乳酸-羟基乙酸载药微球组第1，2周的抑菌率略高于CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶组，但差异无显著性意义(P > 0.05)，第4周时CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶组的抑菌率显著高于聚乳酸-羟基乙酸载药微球组(P < 0.01)，见图4。

2.4  联合载药水凝胶的体外生物相容性及成骨分化作用    CCK-8检测结果表明，CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶具有良好的生物相容性，具有较高的细胞活力(约100%)，与聚乳酸-羟基乙酸载药微球相似，见图5A。碱性磷酸酶活性检测结果表明，CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶上的成骨细胞骨分化能力稍高于聚乳酸-羟基乙酸载药微球上的细胞，但两组组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5B。

世界卫生组织报告显示，2016年全球约有1 040万结核新增病例^[1]。骨关节结核是肺外结核中最常见的一种，占全部结核病例的3%-5%，主要累及椎骨和承重骨，可导致严重的骨质破坏、畸形和神经功能缺损等侵袭性并发症^[2]。营养不良是造成肺外结核的主要原因，故该类患者多集中在发展中国家如东南亚、印度、中国等^[3]。伴有严重并发症的骨关节结核患者需常规手术治疗和口服抗结核药物，但临床上仍难以实现病原菌(结核分枝杆菌)的完全清除，故术后预后较差，甚至出现耐药性结核病^[4]，这使得术后新型抗结核药物的研发变得十分必要。

异烟肼是目前临床上使用的一线抗结核病药物，然而克服血液、组织等屏障后其难以维持病灶区的有效浓度。基质细胞衍生因子1能够刺激成骨干细胞归巢和迁移^[5]，将基质细胞衍生因子1载入支架中用于修复骨缺损和器官再生缺陷已被广泛研究^[6-7]。新型抗菌凝胶在维持局部抗菌药物浓度和骨缺损重建方面具有巨大潜力，是治疗骨关节感染的理想载体^[8-12]。为治疗骨关节感染，课题组设计并制备了具有联合释药作用的壳聚糖-明胶/聚乳酸-羟基乙酸[chitosan-gelatin/poly(lactic acid hydroxyacetic acid)，CS-GEL/PLGA]水凝胶支架，检测了异烟肼和基质细胞衍生因子1在CS-GEL/PLGA支架材料中的体外释放，抗结核和促成骨作用，这项研究满足了骨关节结核、外科手术及其他骨关节感染的原位药物缓释需求。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外观察性实验。

1.2  时间及地点  实验于2017年7月至2019年3月在河北胸科医院实验室完成。

1.3  材料  异烟肼购自上海麦克林生化有限公司；聚乳酸-羟基乙酸(构成比50∶50，M_w=30 000-60 000；构成比85∶15，M_w=190 000-240 000)购自Sigma公司，见表1；壳聚糖粉末、明胶粉末、聚乙烯醇购自Sigma公司；β-甘油磷酸钠粉末购自德国Merck公司；二氯甲烷(分析纯)、冰醋酸(分析纯)购自北京化工厂；安泰购自吉林省方正动物药业科技有限公司；Quantichrom™碱性磷酸酶检测试剂盒购自Bioassay Systems Biotechnology Inc.，Hayward，CA，USA；大鼠来源重组基质细胞衍生因子1(在大肠杆菌中表达，≥98%)购自美国Amgen公司；CCK-8、PBS购自美国GIBCO 公司；光学显微镜(Olympus)；扫描电子显微镜(JEOL JEM-6700F)；动态光粒子尺寸分析仪Zetasizer-nanozs；普通台式离心机(上海安亭离心机械厂)；JB-2型恒温磁力搅拌器(上海雷磁新泾仪器有限公司)；荧光分光光度计(RF-1501，Shimadzu日本)；医用型洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.4  实验方法            

1.4.1  CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶的制备  

制备聚乳酸-羟基乙酸载药微球：运用复乳溶剂蒸发法(W/O/W)制备聚乳酸-羟基乙酸微球。取0.6 mL去离子水作为内水相，加入到2 mL的聚乳酸-羟基乙酸溶液(20 g/L)中，冰浴条件下用手持式匀浆机5 000 r/min高速搅拌10 s，形成初乳溶液；迅速将初乳溶液倒入10 mL 3%聚乙烯醇中，冰浴下10 000 r/min搅拌10 s，形成复乳溶液；将复乳溶液倒入0.5%聚乙烯醇中室温下磁力搅拌2 h，减压蒸馏法去除其中残余的有机溶剂，5 000 r/min离心15 min，去离子水洗3次，将沉淀冻干可得到聚乳酸-羟基乙酸空白微球粉末，4 ℃保存。制备载药物微球时，取500 g/L异烟肼和30 mg/L基质细胞衍生因子1溶液各0.6 mL代替水溶液，重复空白微球的制备方法，即可得到聚乳酸-羟基乙酸载药微球。使用扫描电镜表征聚乳酸-羟基乙酸微球，用Nano measure1.2软件统计200个微球直径，计算平均值和粒径分布范围。

制备CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶：移取一定体积的2%壳聚糖醋酸溶液到容积为10 mL的圆柱形无菌安瓶中，按比例逐滴加入0.5%明胶水溶液和56%β-甘油磷酸钠溶液，振荡混匀后，以少量0.02 mol/L NaOH溶液调节混合液至需要的pH值。然后将载药微球以壳聚糖和明胶总质量的8%加入壳聚糖和明胶溶液中(体积比为1∶1)，经冷冻干燥和化学交联后制备CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶。采用扫描电镜对CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶的形态表征进行检测。

1.4.2  CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶的体外释药  将载药聚乳酸-羟基乙酸微球、CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶在37 ℃下分别添加到含2 mL的PBS(pH=7.4)的透析袋中，在5 mL PBS试管中浸泡并放置在恒温摇床上。在1 h、2 h、2 d、4 d、5 d、6 d、10 d、12 d、16 d、20 d、27 d、30 d、40 d、50 d和60 d时，取出试管中的5 mL PBS进行测试，同时添加另一5 mL新鲜PBS。用紫外分光光度计的在263 nm测定异烟肼含量，利用荧光分光光度计测试上清液中游离基质细胞衍生因子1含量。

1.4.3  体外抗菌实验  将CS-GEL/PLGA支架分为2组：实验组为含CS-GEL/PLGA载药支架，对照组为聚乳酸-氰基乙酸载药微球支架。选择结核分枝杆菌标准株H37Rv(北京胸科医院国家结核病临床实验室菌株库)进行实验。用接种环选择一个菌落，充分研磨并在均质机中混匀。用标准的麦金托什比浊管(1 g/L)测量比浊度，进一步稀释培养物，得到浓度为0.01 g/L的结核杆菌，然后将0.1 mL悬浮液均匀地铺在MHA琼脂上，在培养皿中间分别加入CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸载药微球，在37 ℃下培养4周，通过测量抑制区的直径来测定抗菌活性。

将核分枝杆菌标准株H37Rv在MHA肉汤中的浓度调整为10⁶ CFU/mL。将1 mL细菌悬浮液分别与CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸载药微球在37 ℃共培养1，2，4周。孵育后用PBS轻轻冲洗附着在各种标本上的细菌，并用10 mL PBS超声分离5 min。细菌悬浮液在MHA板上重新培养，用于菌落计数。抗菌率的计算公式：抗菌率(%)=(对照组CFU-实验组CFU)/对照组CFU×100%。以空白培养的细菌为对照，CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸载药微球为实验组。

1.4.4  体外细胞毒性与成骨分化

细胞毒性：将CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸载药微球材料消毒后置于24孔板中备用。将成骨前体细胞MC3T3-E1在含体积分数20%胎牛血清的DMEM基础培养基中培养，2 d后用0.25%胰蛋白酶和0.1%乙二胺四乙酸消化，离心后计数细胞，将细胞浓度调节至1×10⁸ L^-1，然后加入置有材料的24孔板中，每孔加入1 mL，37 ℃孵育在体积分数5%二氧化碳培养箱内，以单独培养的细胞为空白对照。培养24 h后，每孔加入0.5 g含10% CCK-8的DMEM，2 h后将100 μL上述溶液转移到96孔板上，用微型读板器测量450 nm处的吸光度。90 mL a-MEM和10 mL CCK-8混合物的吸光度被减去作为背景吸光度，每个样品测量3次。

碱性磷酸酶活性：将MC3T3-E1细胞分别接种于CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸载药微球中(重复3次)，每孔5×10⁴个细胞。培养5，10 d后，使用Quantichrom™碱性磷酸酶检测试剂盒进行碱性磷酸酶染色。将细胞与1%Nonidet P-40孵育40 min后，通过测量405 nm波长处的光密度来测定碱性磷酸酶活性。最后碱性磷酸酶的活性被标准化为总蛋白浓度，由双辛酸(BCA)蛋白测定法测定。

1.5  主要观察指标  CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶的体外释药性能、细胞毒性、抗菌性能及成骨能力。

1.6  统计学分析  结果采用SPSS 20.0统计软件包进行处理分析，数据符合正态分布，所得数据为计量资料以x(_)±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析以P < 0.05为差异有显著性意义。

自体骨移植和异体骨移植是临床上治疗不可自愈骨缺损的主要方法。通过移植自身骨组织对骨缺损进行治疗被广泛认为是治疗不可自愈骨缺损的首选方法^[13-14]，该方法虽能有效避免免疫排斥反应，但其存在供骨量有限、供骨部位易产生炎症等并发症^[15]。异体骨移植法虽来源广泛，但存在愈合能力差、易感染和免疫排斥反应等弊端^[16]。水凝胶作为一种新型生物友好材料已被广泛用于组织修复和药物递送领域。水凝胶拥有良好的生物亲和性和生物黏附性以及独特的物理化学结构，同时水凝胶的蜂窝状结构允许毛细血管进入内侧，并为孔隙内的成骨细胞输送足够营养，使其在骨缺损修复方面具有独特的优势。近年来水凝胶的生物医用已成为科学家研究的热点^[17-18]。

实验设计具有多孔结构的CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶，作为抗结核感染的原位成骨缓释材料。研究表明壳聚糖-明胶水凝胶在适宜凝胶温度时是流动性的液体，因此其具有可注射性，通过此种方式将材料注射于组织腔隙内，操作简便易行，给药入路要求低，属微创给药^[19-20]。作为给药载体，壳聚糖-明胶水凝胶包载抗菌和促成骨药物后注射于硬组织损伤的腔隙内，可在短时间内形成固体而显著减少流动性，防止了药物流失或异位发挥作用，从而使负载药物得以持续、稳定、安全的作用于病灶区^[21-24]。

扫描电镜结果显示聚乳酸-羟基乙酸微球粒径的分布范围为4-15 μm，较为均匀地分布在壳聚糖-明胶水凝胶中。体外释放实验显示，在pH=7.4的PBS中异烟肼和基质细胞衍生因子1持续释放周期长达50 d，其中异烟肼的浓度仍高于最小抑菌浓度^[25]。缓释制剂控制药物的扩散，最大限度地维持峰值浓度，同时最小化细胞毒性效应时间^[26]。CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶由于外层壳聚糖-明胶的堵塞，较聚乳酸-羟基乙酸载药微球展现出较长的缓释周期。CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶中异烟肼和基质细胞衍生因子1的1 h释放率较低分别是8.3%和8.5%，第2天的累计释放率分别为15.2%和17.6%，远低于聚乳酸-羟基乙酸载药微球组。众所周知，给药频率高、治疗周期长及化疗相关不良反应会降低患者的依从性，同时过量的抗结核药物会导致严重的肝功能损害、肾功能不全、胃肠道反应等。CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶具有药物峰值浓度低和释放周期长的优点。

为评价结核分枝杆菌的治疗效果，进行了细菌抑制环实验和抑菌率测定。在Middlebrook7H9培养基上培养结核分枝杆菌H37Rv4周后，大量结核分枝杆菌菌落包围聚乳酸-羟基乙酸载药微球周围，其抑菌直径为(2.13±0.34) mm；然而CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶的抑菌直径高达(10.33± 0.58) mm，远高于聚乳酸-羟基乙酸载药微球组。抑菌率测定结果显示，在第1，2周聚乳酸-羟基乙酸载药微球组的抑菌率略高于CS-GEL/PLGA联合载药水凝较组(P > 0.05)，而第4周时其抑菌率显著低于CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶组(P < 0.01)。这是由于聚乳酸-羟基乙酸载药微球中的异烟肼前期释放量高于CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶组，随着时间的延长其缺乏维持有效浓度的能力，使其4周后的抑菌率显著低于与CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶组。与其他类型的细菌不同，结核杆菌的增殖周期很长^[27]，因此彻底消除结核分枝杆菌通常需要长时间维持药物的有效^[28]。体外抗菌实验结果，联合载药水凝胶在第2周未显示出显著的抑菌活性，这可能是由于使用的H37Rv菌株对于异烟肼有一定的耐药性；但第4周CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶显现出了长效释放特点和对结核分枝杆菌显著的抑制作用。异烟肼的抗菌作用和释放曲线匹配很好，说明异烟肼的抗菌作用良好，未受到材料和基质细胞衍生因子1引入的影响。

用CCK-8法评价复合材料对前体成骨细胞MC3T3-E1的生物相容性，结果表明CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶具有良好的生物相容性，共培养的细胞具有较高的细胞活力(约100%)。MC3T3-E1细胞与CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶、聚乳酸-羟基乙酸载药微球共孵育24 h后，MC3T3-E1细胞在两种支架上均能贴壁生长，进一步验证支架的生物相容性。通过碱性磷酸实验评估CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸载药微球上MC3T3-E1细胞的成骨分化，结果表显示CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶和聚乳酸-羟基乙酸载药微球均具有良好的促成骨分化能力，CS-GEL/ PLGA联合载药水凝胶上的成骨细胞的成骨分化能力稍高于聚乳酸-羟基乙酸载药微球，两组组间比较无差异(P < 0.05)。高浓度异烟肼的引入未见显著细胞毒性，此外异烟肼和基质细胞衍生因子1联合用药时基质细胞衍生因子1表现出良好的体外促成骨作用。虽然高浓度的异烟肼在体外具有良好的生物相容性，但体内毒性作用更加重要，特别是其对肝脏的毒性作用。

结论：为了治疗在发展中国家广泛流行的骨关节结核，开发了一种CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶支架，以聚乳酸-羟基乙酸为“中间”材料载负临床抗结核药物异烟肼及促成骨细胞因子基质细胞衍生因子1，证实CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶支架有良好的释放曲线和释放周期，具有抑制分枝杆菌增殖和促成骨的双重作用，显示具有双重释药作用的CS-GEL/PLGA联合载药水凝胶有用于治疗骨关节结核或其他感染的潜力。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

基质细胞衍生因子1：是一种参与免疫细胞活化、分化和迁移及伤口愈合、角膜上皮再生和组织修复等过程的趋化因子，能促进干细胞的生长和发育，参与调节成骨分化，可通过细胞归巢提高干细胞向病灶区的趋化作用。而基质细胞衍生因子1的失活会损害成骨细胞的发育和分化。此外，其还与血管生成密切相关。

异烟肼：具有较高的杀菌活性，是治疗结核病的一线药物。世卫组织建议将异烟肼作为结核病的标准疗法，用于潜伏性结核病感染者的预防治疗，与利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇一起用于治疗活动性肺结核。异烟肼的活化形式与脂肪酸生物合成Ⅱ型系统中的NADH依赖型烯醇酰基载体蛋白还原酶异烟肼a结合，阻断细菌细胞壁关键成分支原体酸的合成。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

基质细胞衍生因子1能够刺激干细胞归巢和迁移，将基质细胞衍生因子1载入支架材料修复骨组织或再生缺陷已被广泛研究。异烟肼是治疗结核杆菌的常规药物，过量应用会导致严重的肝肾功能损害。实验首次利用聚乳酸-羟基乙酸载体将疏水性的基质细胞衍生因子1和亲水性的异烟肼同时载入，共混于壳聚糖-明胶水凝胶中，形成复合载药支架。结果显示，载基质细胞衍生因子1和异烟肼的复合支架具有良好的释放曲线和较长的释放周期，体外细胞实验显示联合载药支架具有抗结核杆菌和促成骨的双重作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程