3D打印胶原/壳聚糖支架改善大鼠脊髓损伤后神经功能恢复

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2279

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (22): 3474-3479.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2279

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3D打印胶原/壳聚糖支架改善大鼠脊髓损伤后神经功能恢复

史新宇^1，2，3，李晓红^2，3，叶益超³，王景景³，孙小喆²，张艳龙²，段敬豪²，魏孟广³，张赛³

¹研究生院，天津医科大学，天津市 300070；²医学工程与转化医学研究院，天津大学，天津市 300072；³脑创伤与神经疾病研究所，武警特色医学中心，天津市 300162

收稿日期:2019-09-06 修回日期:2019-09-07 接受日期:2019-12-05 出版日期:2020-08-08 发布日期:2020-04-26
通讯作者: 张赛，教授，脑创伤与神经疾病研究所，武警特色医学中心，天津市 300162
作者简介:史新宇，男，1993年生，陕西省宝鸡市人，天津医科大学在读硕士，主要从事重型颅脑创伤及脊髓损伤方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81771352)

Three-dimensional printed collagen/chitosan scaffold improves neurological recovery after spinal cord injury in rats

Shi Xinyu^{1, 2, 3}, Li Xiaohong^{2, 3}, Ye Yichao³, Wang Jingjing³, Sun Xiaozhe², Zhang Yanlong², Duan Jinghao², Wei Mengguang³, Zhang Sai³

¹Graduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; ²Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, Tianjin 300072, China; ³Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience, Characteristic Medical Center of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China

Received:2019-09-06 Revised:2019-09-07 Accepted:2019-12-05 Online:2020-08-08 Published:2020-04-26
Contact: Zhang Sai, Professor, Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience, Characteristic Medical Center of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China
About author:Shi Xinyu, Master candidate, Graduate School of Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience, Characteristic Medical Center of Chinese People’s Armed Police Force, Tianjin 300162, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81771352

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

壳聚糖：为一种天然多糖，是虾蟹等低等动物外壳的重要成分，具有一定的机械强度，并且具有良好的生物相容性和抗菌性，在生物工程领域具有较好的应用前景。

3D生物打印：是组织工程中最重要的技术之一。目前常用的三维生物打印方法包括喷墨打印、挤压生物打印和激光生物打印，选择好合适的材料后，在计算机指导下根据所选择的生物材料和细胞类型逐层准确地打印出所设计的结构。

背景：3D打印技术可以根据需求制备出满足脊髓植入形状、大小和表面形态要求的生物支架。

目的：观察3D打印胶原/壳聚糖支架对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的影响。

方法：将胶原和壳聚糖按2∶1的质量比混合，采用冷冻干燥法制备普通胶原/壳聚糖支架，采用3D打印机制备3D打印胶原/壳聚糖支架，分别测量两种支架的孔隙率和弹性模量，电镜观察支架形态。将神经干细胞分别与3D打印胶原/壳聚糖支架、普通胶原/壳聚糖支架共培养，进行扫描电镜观察与CCK-8检测。将40只雌性SD大鼠(由中国人民解放军医学科学院军事科学院提供)随机分成4组：假手术组、脊髓损伤组、普通胶原/壳聚糖支架组和3D打印胶原/壳聚糖支架组，后3组制作脊髓全横断损伤模型，普通胶原/壳聚糖支架组和3D打印胶原/壳聚糖支架组损伤处填充对应的支架材料，术后相应时间点进行后肢功能BBB评分、斜坡实验、神经电生理检测与磁共振平扫。实验方案经天津市神经创伤重点实验室伦理委员会批准。

结果与结论：①扫描电镜显示，3D打印胶原/壳聚糖支架具有互连的多孔结构，普通胶原/壳聚糖支架内部结构紊乱；②神经干细胞在3D打印胶原/壳聚糖支架表面生长良好，完全伸展，且3D打印胶原/壳聚糖支架表面神经干细胞的活性显著高于普通胶原/壳聚糖支架组(P < 0.05)；③3D打印胶原/壳聚糖支架的孔隙率与弹性模量均高于普通胶原/壳聚糖支架组(P < 0.05)；④3D打印胶原/壳聚糖支架组术后3-8周的BBB评分高于脊髓损伤组、普通胶原/壳聚糖支架组(P < 0.05)，术后4，6，8周的斜坡实验角度大于脊髓损伤组、普通胶原/壳聚糖支架组(P < 0.05)；⑤3D打印胶原/壳聚糖支架组术后8周的运动诱发电位振幅、体感诱发电位振幅大于脊髓损伤组与普通胶原/壳聚糖支架组(P < 0.05)，运动诱发电位潜伏期、体感诱发电位潜伏期短于脊髓损伤组与普通胶原/壳聚糖支架组(P < 0.05)；⑥磁共振平扫显示与脊髓损伤组及普通胶原/壳聚糖支架组比较，3D打印胶原/壳聚糖支架组损伤处具有较好的连续性与较多的神经纤维束通过；⑦结果表明，3D打印胶原/壳聚糖支架可促进脊髓损伤大鼠神经功能的修复。

ORCID: 0000-0001-5771-8222(史新宇)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 3D打印, 脊髓损伤, 胶原, 壳聚糖, 支架, 修复, 神经电生理, 磁共振

Abstract:

BACKGROUND: Three-dimensional (3D) printing technology can be used to prepare bioscaffolds to meet the requirements of shape, size and surface morphology of spinal cord implantation.

OBJECTIVE: To investigate the effect of 3D printed collagen/chitosan scaffolds on the recovery of neurological function in rats with spinal cord injury.

METHODS: The collagen/chitosan scaffolds were prepared by freeze-drying method with a mass ratio of 2∶1. The 3D printed collagen/chitosan scaffolds were prepared by 3D printer. The porosity and elastic modulus of the scaffolds were measured, and the morphology of the scaffolds was observed by electron microscope. Neural stem cells were co-cultured with 3D printed collagen/chitosan scaffold, and common collagen/chitosan scaffold, respectively, for scanning electron microscope and cell counting kit-8 assay. Forty female Sprague-Dawley rats (provided by Academy of Military Sciences of PLA) were randomly divided into four groups: sham-operated, spinal cord injury, common collagen/chitosan scaffold, and 3D printed collagen/chitosan scaffold groups. The rats in the latter three groups were used to prepare complete spinal cord transected injury model, followed by filled with the corresponding scaffold materials. Basso, Beattie, Bresnahan scores of the posterior limb, slope test, neuroelectrophysiological detection and MRI were conducted at each time point after surgery. The study was approved by the Animal Ethics Committee of Tianjin Key Laboratory of Traumatic Brain Injury.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscope showed that 3D printed collagen/chitosan scaffolds had interconnected porous structure, and the internal structure of common collagen/chitosan scaffolds was disordered. (2) Neural stem cells grew well on the surface of scaffolds and fully extended. The activity of neural stem cells on the surface of 3D printed collagen/chitosan scaffolds was significantly higher than that of the common collagen/chitosan scaffold group (P < 0.05). (3) The porosity and modulus of elasticity in the 3D printed collagen/chitosan scaffold group were higher than those in the common collagen/chitosan scaffold group (P < 0.05). (4) The Basso, Beattie, Bresnahan score in the 3D printed collagen/chitosan scaffold group was higher than that in the spinal cord injury and common collagen/chitosan scaffold groups (P < 0.05) at 3-8 weeks after surgery, and the angle of slope experiment at 4, 6 and 8 weeks after surgery was higher than that in the spinal cord injury and common collagen/chitosan scaffold groups (P < 0.05). (5) The amplitude of motor evoked potential and somatosensory evoked potential in the 3D printed collagen/chitosan scaffold group were higher than those in the spinal cord injury and common collagen/chitosan scaffold groups (P < 0.05), and the latency of motor evoked potential and somatosensory evoked potential were shorter than those in the spinal cord injury and common collagen/chitosan scaffold groups (P < 0.05). (6) MRI plain scan showed that the amplitude of motor evoked potential and somatosensory evoked potential in the 3D printed collagen/chitosan scaffold group were higher than those in the spinal cord injury and common collagen/chitosan scaffold groups (P < 0.05). 3D printed collagen/chitosan scaffold group had good continuity and more nerve fiber bundles passing through the injury site. (7) The results imply that 3D printed collagen/chitosan scaffolds can promote the repair of nerve function in the spinal cord injury rats.

Key words: 3D printing, spinal cord injury, collagen, chitosan, scaffold, repair, neuroelectrophysiology, MRI

中图分类号:

史新宇, 李晓红, 叶益超, 王景景, 孙小喆, 张艳龙, 段敬豪, 魏孟广, 张赛. 3D打印胶原/壳聚糖支架改善大鼠脊髓损伤后神经功能恢复[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(22): 3474-3479.

Shi Xinyu, Li Xiaohong, Ye Yichao, Wang Jingjing, Sun Xiaozhe, Zhang Yanlong, Duan Jinghao, Wei Mengguang, Zhang Sai. Three-dimensional printed collagen/chitosan scaffold improves neurological recovery after spinal cord injury in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(22): 3474-3479.

图/表（结果） 5

2.1 支架扫描电镜及生物相容性检测结果 3D打印胶原/壳聚糖支架由3D生物打印机制造，见图1A，使用Solidworks软件设计多孔生物支架模型。扫描电镜图像显示3D打印胶原/壳聚糖支架中的通道彼此连接，见图1B。使用3D打印可以控制支架的形态，使3D胶原/壳聚糖支架具有互连的多孔结构，该特征为细胞黏附和生长提供了足够的空间。扫描电镜图像显示普通胶原/壳聚糖支架内部结构紊乱，见图1C。神经干细胞与3D打印胶原/壳聚糖支架共培养后，细胞在支架表面生长，呈现球形或伸展，见图1D，E，CCK-8结果示3D打印胶原/壳聚糖支架较普通胶原/壳聚糖支架使细胞具有更好的细胞活力，即该3D打印支架具有更好的生物相容性，见图1F。

2.2 支架物理性质检测结果 3D打印胶原/壳聚糖支架的孔隙率高于普通胶原/壳聚糖支架(t=3.293，P < 0.05)，这种特性为细胞的黏附和生长提供了足够的空间。3D打印胶原/壳聚糖支架的弹性模量大于普通胶原/壳聚糖支架(t=6.925，P < 0.05)，证明了3D打印胶原/壳聚糖支架的抗压强度明显提高，见表2。

2.3 支架动物体内实验结果

2.3.1 实验动物数量分析造模后，大鼠双下肢肌张力降低，自主活动消失即为成功，术后因尿潴留及感染死亡8只，其中脊髓损伤组4只、普通胶原/壳聚糖支架组1只、3D打印胶原/壳聚糖支架组3只，均已用雌性SD大鼠补充完成实验。

2.3.2 行为学观察结果造模成功后，脊髓损伤大鼠BBB评分为0分，仅靠前肢拖行，随着时间推移，自第2周开始，胶原/壳聚糖支架组和3D打印胶原/壳聚糖支架组大鼠BBB评分较脊髓损伤组明显上升，3D打印胶原/壳聚糖支架组BBB评分上升最明显(F=152.7，125.7，165.7，156.4，176.4，147.5，191.1，P < 0.01)，见图2A。

造模后1，2，4，6，8周对各组大鼠进行斜坡实验，结果显示从第2周开始，普通胶原/壳聚糖支架组、3D打印胶原/壳聚糖支架组较脊髓损伤组相比斜坡角度明显上升，其中3D打印胶原/壳聚糖支架组斜坡角度提升最明显(F= 12.68，31.46，83.61，122.3，P < 0.01)，见图2B。

2.3.3 电生理检测结果在造模后8周通过神经电生理证实了轴突的再生^[16]。与脊髓损伤组相比，普通胶原/壳聚糖支架组运动诱发电位振幅和潜伏期明显恢复[振幅：(0.28± 0.01)，(0.69±0.06) mV，P < 0.01；潜伏期：(27.42±1.86)，(18.60±1.48) ms，P < 0.05]，3D打印胶原/壳聚糖支架组振幅和潜伏期的进一步改善[振幅(0.91±0.04) mV，P < 0.01；潜伏期：(12.83±1.35) ms，P < 0.01]；与脊髓损伤组相比，胶原/壳聚糖组、3D打印胶原/壳聚糖组体感诱发电位潜伏期和振幅均有显著改善[振幅：(1.19±0.06)，(1.62±0.11) mV，P < 0.01；潜伏期：(25.62±2.16)，(19.31± 1.08) ms，P < 0.05]，见图3。

2.3.4 核磁共振影像学表现由T2WI图像可以发现，3D打印胶原/壳聚糖支架组损伤处的连接比单纯脊髓损伤组和普通胶原/壳聚糖支架组较好，具有明显的连续性，见图4A。在T2WI图像中3D打印胶原/壳聚糖组损伤处首尾两端均呈低信号，与普通胶原/壳聚糖支架组和脊髓损伤组相比呈现明显的低信号表现，接近假手术组的信号强度。弥散张量成像中，脊髓全横断大鼠的神经纤维明显横断，普通胶原/壳聚糖支架组通过的神经纤维束较脊髓损伤组增加，而3D打印胶原/壳聚糖支架组通过损伤区域的纤维束较普通支架组增加更明显，见图4B，证明了3D打印胶原/壳聚糖支架组神经纤维再生能力高于普通胶原/壳聚糖支架组。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2018年11月至2019年7月在武警特色医学中心神经创伤重点实验室完成。

1.3 材料

实验动物：选用8周龄雌性SD大鼠40只，体质量250-280 g，由中国人民解放军医学科学院军事科学院提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006。将大鼠随机分成4组：假手术组、脊髓损伤组、普通胶原/壳聚糖支架组、3打印胶原/壳聚糖支架组，每组10只。实验方案经天津市神经创伤重点实验室伦理委员会批准。

主要试剂与仪器：壳多糖(sigma，USA)见表1；3D生物打印机(Regenovo，中国杭州)；手术器材(上海医疗器械有限公司手术器械厂)；神经电生理仪(VIKING QUEST 4，美国)；扫描电子显微镜(Hitachi，Tokyo，Japan)；控制软件Solid Works(DassaultSystèmes，Vélizy，France)；MRI(型号：MAGNETOM VERIO，德国)；Instron 5865机器(Instron，Norwood，MA，USA)。

1.4 实验方法

1.4.1 普通胶原/壳聚糖支架的制备将市售新鲜牛腱完全粉碎，浸泡在0.05 mol/L Tris缓冲液中过夜以除去杂质，然后离心收集沉淀。向沉淀中加入含有胃蛋白酶的乙酸溶液，在沉淀充分溶解后离心收集上清液，加入3.5 mol/L NaCl溶液并充分搅拌混合物。收集沉淀物并在去离子水中4 ℃透析5 d，每天更换去离子水以获得胶原凝胶。将脱乙酰壳多糖粉末溶解在1%乙酸溶液中，然后按照胶原和壳聚糖质量比2∶1混合，搅拌后离心以除去上清液并获得普通胶原/壳聚糖材料^[7]，4 ℃保存。

1.4.2 3D打印胶原/壳聚糖支架的制备使用3D生物打印机在-25 ℃下产生多孔结构。将3D结构模型转化为控制软件Solid Works，使用直径为160 μm的印刷喷嘴印刷支架并设定相应的印刷参数：挤出速度0.17 mm/min，印刷速度12 mm/s，层厚0.3 mm。通过印刷喷嘴将复合材料填充到打印机墨盒，在逐层印刷之后，将3D固体模塑物在-80 ℃下放置过夜以进行保存，然后将支架真空冷冻干燥 24-48 h，将冷冻干燥的支架浸入体积分数为1%的NaOH溶液(0.1 mmol/L)中12 h，以调节支架的pH值(pH=7)，去离子水漂洗并获得3 mm×3 mm×3 mm圆柱形支架。

1.4.3 支架的物理性质与生物相容性

支架的孔隙率和弹性模量性质测定：将支架浸入体积为V₀的无水乙醇浸泡5 min。负压脱气至没有明显气泡渗出后测量乙醇的体积(V₁)。取出支架，测量残余乙醇的体积(V₂) 。孔隙率通过下式计算：孔隙率(%)=(V₀-V₂)/ (V₁-V₂)× 100%。然后用Instron 5865机器检测压缩应力和应变的关系曲线，预设载荷0.1 kN，正弦波形5 Hz，最大压缩应变10%计算弹性模量。检测所有样品至少3次以获得平均孔隙率和弹性模量^[8]。

支架与神经干细胞的相容性测定：将3D打印支架浸入乙醇(70%)中24 h，然后用PBS洗涤3次，与SD大鼠来源神经干细胞(PR2028，无锡欣润生物科技有限公司)共培养3 d，采用扫描电子显微镜观察支架的相容性^[9]。将SD大鼠来源神经干细胞分别与普通胶原/壳聚糖支架、3D打印胶原/壳聚糖支架共培养3 d，利用CCK-8法测定细胞活力。

扫描电子显微镜观察支架形态：将3D打印与普通胶原/壳聚糖支架在含有25 g/L戊二醛的缓冲液中(戊二醛溶于0.1 mol/L二甲胂酸钠缓冲液中)固定过夜，用一系列分级乙醇脱水后，将支架冷冻并干燥2 d，然后喷金，扫描电子显微镜下观察。

1.4.4 支架动物体内实验

大鼠脊髓损伤模型的制备：将SD大鼠以戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉后，在T₈椎体处进行椎板切除以暴露脊髓的T₇-T₉区段。在手术显微镜下将硬脊膜打开，用眼科剪去除T₈水平的长度为2 mm脊髓^[10]。观察到双侧后肢的抽搐，脚底向后伸展，肌肉松弛和虚弱即为造模成功。造模成功后，普通胶原/壳聚糖支架组、3D打印胶原/壳聚糖支架组立即移植支架以填充横切的间隙。每8 h对大鼠膀胱进行人工挤压，直到膀胱排尿自动恢复^[11]。假手术组硬脊膜暴露后直接缝合，无损伤。

BBB评分：术后8周每周运用BBB评分表评估大鼠后肢运动功能恢复情况^[12]，根据症状轻重计分，完全正常为21分，完全截瘫为0分，采用盲法评估。

斜坡实验^[13]：术后1，2，4，6，8周，将大鼠身体轴线垂直于斜板纵轴放置于斜板上，大鼠头朝斜板高侧，斜板倾斜角度从0°开始上升，记录每次大鼠停留在斜板上至少维持5 s的最大斜板角度，每次升高5°，每次最少测试3次，取平均值。

神经电生理分析：脊髓损伤后8周对大鼠分别进行神经电生理检测^[14]。运动诱发电位：将刺激电极插入皮质运动区域冠状缝合和矢状缝合的交叉点，将记录电极插入胫后神经，刺激强度为46 V，脉冲宽度为0.2 ms，刺激频率为 1 Hz。体感诱发电位：将刺激电极插入胫后神经，将记录电极插入前囟点前和中线两侧的2 mm处，刺激强度选择 32 mA，通过持续的电刺激获得体感诱发电位潜伏期、振幅和波形。

磁共振检测：术前和术后8周吸入麻醉大鼠，将大鼠俯卧位固定在8通道的小动物专用核磁线圈内进行MRI扫描，重复时间=3 000 ms，回波时间=77 ms，截面厚度=1.5 mm，矩阵256×256，视场=80 mm×64 mm。扩散张量成像图像重复时间=6 100 ms，回波时间(te)=77 ms，截面厚度=1.5 mm，矩阵96×96，b-value=600 s/mm²，带宽200 kHz，12个扩散方向，视场=110 mm×46 mm^[15]。

1.5 主要观察指标 3D打印胶原/壳聚糖支架的物理性质、生物相容性及动物体内修复脊髓损伤效果。

1.6 统计学分析使用Graphpad Prism 7.0软件进行数据统计处理，数据以x(_)±s表示，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

脊髓损伤引起神经纤维挤压导致了运动和感觉神经元缺陷^[17-18]。脊髓损伤后功能的恢复仍然是重大难题。越来越多的证据表明，生物材料植入可能是脊髓损伤后神经修复的有效策略^[19-20]。胶原蛋白是人体内最丰富、分布最广的蛋白质。纤维结构胶原蛋白有助于细胞行为，如黏附、生长和繁殖^[21]。由于具有低抗原性和良好的生物相容性及生物降解性，胶原蛋白是一种理想的载体，但其机械性能较低、分解速度快，不适合单独用于支架制备。糖胺聚糖是细胞外基质的主要成分，而壳聚糖的结构和性质与其相似^[22]。壳聚糖具有无毒性、成本低廉、易于加工等特点，使之成为理想的支架材料^[23]。虽然单纯壳聚糖支架对损伤组织具有支撑和桥接作用^[24]，但壳聚糖降解速度慢也不适合单独制备支架，因此两种材料的组合可克服单纯材料的限制。生物支架通过抑制细胞凋亡或坏死、减少局部炎症反应、减少胶质瘢痕的形成改善损伤周围的微环境^[25-27]。理想的神经修复支架应提供3D多孔结构的物理化学性质，如恰当放入孔径、刚度、弹性和强度等^[28]。增生性瘢痕和轴突再生能力差是脊髓损伤修复的主要障碍。适度的孔隙结构通过多种细胞机制减少啮齿类动物脊髓损伤后瘢痕的形成，包括抑制转化生长因子β信号转导，阻止硫酸软骨素蛋白聚糖的积累，使病变部位允许感觉神经元轴突再生。因此，3D结构可减少纤维化瘢痕形成，增强轴突生长的能力。3D打印技术具有良好的稳定性和成型能力，可在不破坏胶原和壳聚糖两种生物材料生物性能的前提下制备出功能和结构良好的支架，引导轴突的对接和延伸促进神经功能的恢复^[29]。

功能恢复是脊髓损伤的恢复的最终目的。实验结果显示，3D打印胶原/壳聚糖支架植入大鼠的BBB评分和斜坡实验角度显著升高，表明运动功能恢复较好；通过神经电生理检测，与脊髓损伤组和普通胶原/壳聚糖支架组相比，3D打印胶原/壳聚糖支架组的运动诱发电位和体感诱发电位均观察到潜伏期缩短和振幅增加，进一步证明了神经功能的恢复，同时核磁共振平扫及弥散张量成像结果支持了3D打印胶原/壳聚糖支架可更好地恢复大鼠神经功能。

总之，实验利用3D打印技术成功制备了一种新的胶原/壳聚糖支架，该支架可改善大鼠神经功能的恢复，对大鼠完全横断脊髓模型显示出显著治疗效果，这为脊髓损伤提供了新的治疗方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

3D打印胶原/壳聚糖支架改善大鼠脊髓损伤后神经功能恢复

Three-dimensional printed collagen/chitosan scaffold improves neurological recovery after spinal cord injury in rats

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