改性3D打印钛支架对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

doi:10.12307/2022.854

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (27): 4265-4271.doi: 10.12307/2022.854

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改性3D打印钛支架对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

王静1，杨九菊1，王宁宁1，刘超2

1沧州医学高等专科学校口腔系，河北省沧州市 061001；2山东大学齐鲁医院口腔颌面外科，山东省济南市 250012

收稿日期:2021-05-27 接受日期:2021-07-21 出版日期:2022-09-28 发布日期:2022-03-10
通讯作者: 刘超，副主任医师，山东大学齐鲁医院口腔颌面外科，山东省济南市 250012
作者简介:王静，女，1984年生，河北省霸州市人，回族，2013年石河子大学毕业，硕士，讲师，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
沧州医专自然科学课题(19Z015)，项目负责人：王静

Effect of modified three-dimensional-printed titanium scaffold on osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells

Wang Jing1, Yang Jiuju1, Wang Ningning1, Liu Chao2

1Department of Stomatology, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, Hebei Province, China; 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China

Received:2021-05-27 Accepted:2021-07-21 Online:2022-09-28 Published:2022-03-10
Contact: Liu Chao, Associate chief physician, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong Province, China
About author:Wang Jing, Master, Lecturer, Department of Stomatology, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, Hebei Province, China
Supported by:
Natural Science Project of Cangzhou Medical College, No. 19Z015 (to WJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
联合改性的3D打印钛支架：3D打印技术制造的钛片经喷砂酸蚀和阳极氧化改性后在表面形成了微纳米多级复合结构，微米结构可使骨与植入体之间的嵌合力增加，利于细胞的黏附和增殖；纳米结构可通过调控细胞内信号分子通路，影响细胞行为。
钛表面钛阳极氧化处理：阳极氧化工艺是利用钛作为阳极、不锈钢等其他金属作为阴极，借助一定的电解液，通过电化学反应促使钛合金表面发生氧化反应而形成氧化膜。这层氧化膜对光线的反射和折射作用非常明显，且不同厚度的氧化膜会呈现出不同的颜色，同时具有保护性，因此是一种理想的装饰层与耐磨层，被广泛应用于建筑、航空、医学等领域。

背景：3D打印钛支架克服了传统钛支架内部结构可控性差及外形不匹配等缺陷，但由于钛的生物惰性较大，使其在植入体内后难以与周围组织快速稳定地结合。
目的：采用喷砂酸蚀和阳极氧化方法改性3D打印钛支架表面，观察其对脂肪间充质干细胞黏附、增殖和成骨分化能力的影响。
方法：采用喷砂酸蚀联合阳极氧化方法在3D打印钛支架表面构建微纳米多孔结构，扫描电镜观察其表面特征。将第3代大鼠脂肪间充质干细胞分别接种于3D打印钛支架组(A组)、3D打印钛支架+成骨诱导液(B组)、改性3D打印钛支架(C组)上，通过细胞骨架与CCK-8实验检测细胞的黏附和增殖能力，碱性磷酸酶与茜素红染色观察细胞的成骨分化能力，实时定量PCR分析细胞成骨相关基因的表达，免疫荧光染色观察细胞骨钙素与骨桥蛋白的表达。
结果与结论：①扫描电镜下可见，改性后的3D打印钛支架表面出现微米及亚微米级凹坑和沟槽，内部有直径为70-100 nm的纳米级孔隙，孔隙之间相互连通；②共聚焦显微镜下可见，A、B组细胞伪足及触角较少，尚未铺展；C组细胞完全铺展在材料表面，可见大量明显的细胞伪足和触角，紧密附着于材料表面；CCK-8实验显示，改性3D打印钛支架可促进脂肪间充质干细胞的增殖；③碱性磷酸酶与茜素红染色显示，B、C组碱细胞性磷酸酶活性与矿化水平高于A组(P < 0.05)；④B、C组细胞骨钙素、RUNX2、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA表达均高于A组(P < 0.05)，骨桥蛋白与骨钙素蛋白表达均高于A组(P < 0.05)；⑤结果表明，喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架具有良好的生物相容性，可促进脂肪间充质干细胞的黏附、增殖和成骨分化。

https://orcid.org/0000-0002-7773-2213 (王静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 3D打印钛, 脂肪间充质干细胞, 黏附, 增殖, 生物相容性, 成骨蛋白, 成骨基因, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: The three-dimensional (3D)-printed titanium scaffold overcomes the disadvantages of traditional titanium scaffolds, such as poor controllability of the internal structure and mismatch in shape. However, due to the relatively large biological inertia of titanium, it is difficult to combine with surrounding tissues quickly and stably after implantation in the body.
OBJECTIVE: To modify the surface of 3D-printed titanium by sandblasting acid etching and anodic oxidation and observe its effect on the adhesion, proliferation, and osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Micro-nano porous structure was constructed on the surface of 3D-printed titanium by sandblasting acid etching and anodic oxidation. The surface was characterized by scanning electron microscopy. Adipose-derived mesenchymal stem cells at passage 3 were inoculated in the Ti group (group A), Ti+osteogenic induction group (group B), and modified Ti group (group C). Cytoskeleton and CCK-8 assay were used to detect cell adhision and proliferation. Alkaline phosphatase staining and Alizarin red staining were used to observe osteogenesis. Real-time PCR was applied to analyze the expression of osteogenic genes. Immunofluorescence staining was employed to observe the expression of osteocalcin and osteopontin in cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Scanning electron microscopy showed that micro and submicron scale pits and grooves could be seen on the surface of the modified 3D-printed titanium scaffold. There were nanoscale pores with a diameter of 70-100 nm inside the scaffold and the pores were connected with each other. (2) Under a confocal microscope, there were few pseudopods and antennae in groups A and B, and they had not been spread; the cells in group C were completely spread on the surface of the material, and a large number of obvious pseudopods and antennae were visible, which were closely attached to the surface of the material. CCK-8 assay showed that modified 3D-printed titanium scaffolds could promote the proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells. (3) Alkaline phosphatase staining and Alizarin red staining exhibited that alkaline phosphatase activity and the mineralization ability were higher in the groups B and C than those in the group A (P < 0.05). (4) Osteocalcin, RUNX2, alkaline phosphatase, and type I collagen mRNA expression levels were higher in the groups B and C than those in the group A (P < 0.05). Osteopontin and osteocalcin protein expression levels were higher in the groups B and C than those in the group A (P < 0.05). (5) These results suggest that 3D-printed titanium scaffold modified by sandblasting acid etching and anodic oxidation has good biocompatibility and can promote the adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells.

Key words: 3D-printed titanium, adipose-derived mesenchymal stem ells, adhesion, proliferation, biocompatibility, osteogenic protein, osteogenic gene, osteogenic differentiation

中图分类号:

王静, 杨九菊, 王宁宁, 刘超. 改性3D打印钛支架对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4265-4271.

Wang Jing, Yang Jiuju, Wang Ningning, Liu Chao. Effect of modified three-dimensional-printed titanium scaffold on osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(27): 4265-4271.

图/表（结果） 7

2.1 改性3D打印钛支架的表面特征实验通过喷砂酸蚀和阳极氧化联合改性在3D打印钛支架表面构建了微纳米多级复合结构。支架的多孔结构可以为细胞的生长提供空间，并且可有效促进细胞的黏附、增殖及成骨分化，适用于大面积骨缺损的修复。
改性前后3D打印钛支架的扫描电镜观察结果见图1。改性前的3D打印钛支架材料表面光滑平整，可观察到高低起伏的峰-谷结构。改性后的3D打印钛支架在材料表面可看到微米及亚微米级凹坑和沟槽，材料基底部随机分布着较多的球形颗粒，大小不均，在垄沟底部的放大图像中可以看到突起状结构散在分布，呈不规则的小梁状，突起是由七八个直径为50-70 nm的纳米颗粒聚集而成，放大后可以看到突起之间有较多直径为70-100 nm的孔隙，孔隙之间互相连通。

2.2 脂肪间充质干细胞的形态学观察及鉴定提取的细胞培养7 d后，显微镜下可观察到大部分细胞贴壁延伸，形态为均一的长梭形，类似于成纤维细胞，细胞排列紧密，漩涡状分布，见图2A。流式细胞术检测脂肪间充质干细胞的表面特异性标记物，结果显示CD29和CD90的共同阳性表达率为97.97%，见图2B。符合脂肪间充质干细胞的表面抗原特性，表明所提取的细胞属于脂肪来源间充质干细胞。

2.3 改性3D打印钛支架对细胞黏附和增殖能力的影响图3A为脂肪间充质干细胞在各组钛支架上培养3 d后的黏附形态，A、B组细胞伪足及触角较少，尚未铺展；C组细胞完全铺展在材料表面，呈扁平多角形，可见大量明显的细胞伪足和触角，紧密附着于材料表面，这可能和改性3D打印钛支架表面的多孔结构有关。采用CCK-8法测定细胞的增殖能力，图3B为脂肪间充质干细胞在不同组的材料表面生长的结果。培养前4 d，3组材料表面的细胞活力未见明显差异；培养6 d后，C组细胞的增殖水平明显高于其他两组(P < 0.05)，到第8天时C组增殖水平最强(P < 0.05)。

2.4 改性3D打印钛支架对细胞成骨分化的影响
2.4.1 磷酸酶染色及茜素红染色细胞内碱性磷酸酶活性越高，成骨潜能越大。图4A为复合培养7 d后的碱性磷酸酶染色结果，与A组相比，B、C组细胞内碱性磷酸酶染色明显增强。半定量分析结果显示，复合培养7，14 d后，B、C组碱性磷酸酶活性均高于A组(P < 0.05)，第14天时更显著，分别是A组的1.5，1.7倍，见图4B。图4C为复合培养21 d的茜素红染色结果，与A组相比，B、C组细胞内茜素红染色明显增强。半定量分析结果显示，B、C组细胞矿化水平高于A组(P < 0.05)，见图4D。

2.4.2 实时定量PCR检测成骨相关基因的表达为了进一步探究改性3D打印钛支架对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响，通过RT-PCR技术检测了细胞与支架复合培养14 d后骨钙素、RUNX2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原4种促成骨分化基因的表达水平，结果见图5所示。与A组相比，B、C组成骨基因骨钙素、RUNX2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的mRNA表达都明显增强(P < 0.01)，其中以C组更明显。

2.4.3 免疫荧光检测骨钙素和骨桥蛋白的表达利用免疫荧光染色检测各组钛支架上细胞骨钙素和骨桥蛋白的表达，并对其荧光强度进行定量分析。图6A为骨钙素和骨桥蛋白在各组材料表面的表达情况，A组中出现极少量骨钙素和骨桥蛋白的表达，B组中可观察到少量的蛋白表达，C组检测到非常明显的骨钙素和骨桥蛋白的表达。图6B为Image J软件对免疫荧光染色荧光强度的定量分析结果，B、C组骨钙素荧光强度分别为A组强度值的5.14，2.04倍，骨桥蛋白荧光强度分别为A组的7.07，2.95倍，表明3D打印钛植入体表面经喷砂酸蚀和阳极氧化处理后能够显著促进成骨相关蛋白的表达。

2.5 支架的生物相容性由细胞黏附与细胞增殖实验可知，喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架具有良好的生物相容性。

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引言

累及颌骨的肿瘤切除、创伤、感染、先天畸形及术后骨折不愈合容易造成较大范围的颌骨缺损，当骨缺损达到临界范围时就不能完全自行愈合[1]，可导致患者面部畸形甚至伴随咀嚼、吞咽及语言功能障碍。在临床治疗颌面部缺损时，恢复颌面部的正常结构和功能是外科医生面临的一大难题[2]。利用组织工程技术构建仿生骨进而对各类颌骨缺损进行修复及重建，是目前解决骨缺损问题的最佳方案。骨组织工程的核心问题是支架材料和种子细胞的选择。
近年来随着3D打印技术的快速发展，该技术已被广泛应用于医疗领域。3D打印技术是基于计算机三维图形数据，利用纤维激光逐层熔化烧结金属粉末，并逐层增加层叠打印构造三维实体。用3D打印技术制备的骨组织工程支架个性化程度高、内部结构精确，能够克服传统钛支架内部结构可控性差及外形不匹配等缺陷[3-4]。钛及其合金具有质量轻、强度高、生物相容性和耐腐蚀好等特点，且能与骨组织良好结合，常被作为钛网来复合细胞和生长因子进行颌骨缺损的修复。然而，由于钛的生物惰性较大，使其在植入体内后难以与周围组织快速稳定地结合，影响了其生物活性的发挥和广泛应用。因此，对钛植入体进行表面改性提高其生物活性和骨结合能力，缩短种植体的骨结合时间，是目前国内外研究的热点问题。
脂肪间充质干细胞取材容易、增殖能力强、分泌活性高[5]，具有多向分化潜能[6]，可通过其免疫调节能力提高移植后的愈合效果。植入机体后，脂肪间充质干细胞能够适应受区的生理、病理、应力等微环境并保持成骨活性[7-8]。多项研究证实，脂肪间充质干细胞结合支架材料后成骨能力可显著提高[9-12]。ZHOU等[13]将脂肪间充质干细胞接种到3D打印钛支架上，细胞的增殖和成骨能力都有所提高。以上提示脂肪间充质干细胞可与3D打印钛支架良好的结合。
实验对3D打印钛支架进行喷砂酸蚀/阳极氧化联合改性后与脂肪间充质干细胞复合培养，构建了骨组织工程支架，探讨改性3D打印钛支架支架对脂肪间充质干细胞黏附、增殖及成骨分化能力的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外观察性实验，组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年5月在沧州医学高等专科学校科技实训中心与天津血研所完成。
1.3 材料 3D打印钛支架的介绍，见表1。

1.3.1 实验动物实验选用6-8周雄性SD大鼠10只，体质量约为250 g，购于河北省实验中心，许可证号：SCXK(冀)2018-004。动物方案按照沧州医学高等专科学校动物保护与伦理委员会的意见进行。
1.3.2 主要试剂 L-DMEM、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、胎牛血清(Gibco公司，美国)；CCK-8(博士德生物工程有限公司，中国)；单克隆抗体CD29、CD90(Abcam公司，美国)；碱性磷酸酶试剂盒(碧云天生物技术有限公司，中国)；茜素红染色试剂盒(Solarbio公司，中国)；RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)；RT-PCR试剂盒(天根生化科技有限公司，中国)；骨钙素、骨桥蛋白单克隆抗体(Thermo公司，美国)；地塞米松、β-磷酸甘油钠、抗坏血酸(Sigma公司，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 3D打印钛支架的表面改性处理将3D打印钛支架切割为10 mm×10 mm×1 mm的薄片，用水磨砂纸逐级打磨，随后依次在丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗15 min，干燥。以白刚玉(Al2O3，粒径为125-150 μm)进行喷砂处理，压力0.34 MPa，喷射距离10 cm，时间20 s。为了去除残余的喷砂颗粒，将喷砂后的钛片放入酸蚀溶液中(质量分数2%氢氟酸和质量分数1.8%盐酸的混合液)室温处理5 min。之后在喷砂酸蚀处理后的钛片表面进行阳极氧化，置于含有质量分数0.25%氟化铵和质量分数2%去离子水的乙二醇电解液中，阴极为铂片、阳极为样品，阳极和阴极之间的距离设置为40 mm，氧化电压为15 V恒定直流电压，氧化时间1 h，构建微纳米复合表面结构。最后用蒸馏水冲洗并干燥，高压蒸汽灭菌后备用。在改性前后的支架表面镀一层导电金钯膜，扫描电镜(SUPRATM55 SAPPHIRE，德国)下观察其表面形貌。
1.4.2 大鼠脂肪间充质干细胞的提取与鉴定
细胞的提取：过量麻醉处死SD大鼠，无菌条件下分离腹股沟及附睾周围脂肪组织，置于含5%抗生素的PBS中清洗2次，去掉结缔组织，放入培养皿中用眼科剪剪成浆糊状，加入2倍体积的Ⅰ型胶酶，37 ℃消化60 min，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化；200目筛网过滤，1 000 r/min离心10 min，弃上清，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，置于37 ℃、体积分数为5%CO2 的培养箱培养。每3 d换液1次，细胞融合达80%时传代。
细胞的鉴定：取第3代大鼠脂肪间充质干细胞，胰蛋白酶消化后调整细胞浓度为5×108 L-1。将200 µL细胞悬液加入到1.5 mL离心管中，每管加入 CD29抗体5 µL、 CD90抗体2 µL，冰上避光孵育30 min，PBS冲洗2次，用100 µL PBS重悬细胞，1 h内上Guava流式细胞仪(Milipore公司，美国)检测。
1.4.3 实验分组实验分3组：A组将3D打印钛支架置于24孔板内，将1 mL脂肪间充质干细胞接种至材料表面，细胞浓度为5×108 L-1，加入DMEM培养基培育；B组将3D打印钛支架置于24孔板内，将1 mL脂肪间充质干细胞接种至材料表面，细胞浓度为5×108 L-1，加入成骨诱导培养液(含体积分数10%胎牛血清的DMEM +0.1 μmol/L地塞米松+10 mmol/L β-磷酸甘油钠+0.05 g/L抗坏血酸)培育；C组将改性后的3D打印钛支架置于24孔板内，将1 mL脂肪间充质干细胞接种至材料表面，细胞浓度为5×108 L-1，加入DMEM培养基培育。
1.4.4 细胞形态观察孵育3 d后，PBS清洗样品3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定细胞30 min，0.5% TritonX-100透膜处理10 min。每孔添加FITC标记的鬼笔环肽染色90 min，再用Hoechst 33258复染15 min，Dragonfly 200转盘式共聚焦显微镜(Andor公司，英国)下观察细胞形态。
1.4.5 细胞增殖检测孵育第2，4，6，8天，胰蛋白酶消化细胞，将100 µL细胞浓度为 2×1010 L-1的细胞悬液加入96孔板，每孔加CCK-8培养液10 µL，培养箱孵育1.5 h，采用SpectraMax M4酶标仪(Molecular Devices公司，美国)测量450 nm下的吸光度值。
1.4.6 碱性磷酸酶与茜素红染色
碱性磷酸酶染色：孵育第7，14天，PBS冲洗样品2次，1%TritonX-100冰上裂解40 min后，将细胞裂解液吸入离心管中，4 ℃离心5 min，取上清。按试剂盒说明书配置溶液，制备标准曲线。向96孔板加入上清样品50 μL、显色底物50 μL，枪头吹打混匀，37 ℃孵育10 min，每孔加入100 μL反应终止液终止反应，采用酶标仪测定405 nm下的吸光度值。绘出标准曲线，根据样品的吸光度值在标准曲线上查出样品的浓度。
茜素红染色：孵育第21天，PBS清洗样品3次，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定细胞25 min，每孔加入1 mL 40 mmol/L茜素红(pH=4.1)室温染色20 min，显微镜下观察并拍照。之后每孔加入400 μL的10%醋酸溶液，震荡30 min后蒸馏水冲洗3次，刮取材料表面黏附的细胞，转移到EP管中，80 ℃加热10 min；20 000 r/min离心15 min，将上清液转移到新管中，加入与醋酸等量10%的氢氧化铵溶液中和残余酸，测量405 nm下的吸光度值。
1.4.7 成骨相关基因的检测孵育14 d后，利用RNA提取试剂盒提取各组细胞总的mRNA，取2 μg mRNA用cDNA第一链合成试剂盒将其反转录为cDNA。最后使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix为染料，在QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪(Thermo公司，美国)上进行RT-PCR定量分析。PCR反应条件：95 ℃预变性15 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火40 s，运行40个循环。每组设置3个复孔，每孔重复3次，取平均值进行分析。目的基因引物序列见表2。

1.4.8 免疫荧光染色孵育14 d后，采用免疫荧光染色观察骨钙素与骨桥蛋白的表达情况。PBS冲洗样品2次，40 g/L多聚甲醛固定细胞25 min，0.5%Triton X-100透膜处理15 min，5%BSA封闭1 h；加入骨钙素(1∶100)和骨桥蛋白(1∶100)一抗，4 ℃孵育过夜；第2天，PBS清洗样品2遍，相应二抗(1∶50)避光孵育1 h，DAPI染色15 min，共聚焦显微镜下观察。
1.5 主要观察指标各组脂肪间充质杆细胞的增殖、黏附与成骨分化能力。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0 软件分析处理实验数据，数据以x±s表示，实验数据组内比较采用单因素方差分析，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近年来随着颌面部缺损修复的高精度和个性化发展，3D打印成为了研究热点，在口腔医学领域被广泛应用[14-15]。3D打印技术制备的骨组织工程支架个性化程度高，可依据骨缺损的形态改变形状，与宿主骨间的匹配度更好[16-17]。成骨相关细胞对植入体表面微观形貌的改变表现出不同的反应特性，在材料表面直接构建多孔结构或制备多孔结构涂层可增加植入体与周围骨组织的接触面积，利于细胞的黏附、增殖及成骨分化[18-19]。3D打印钛片经喷砂酸蚀和阳极氧化改性后在表面形成了微纳米多级复合结构，微米结构可使骨与植入体之间的嵌合力增加，利于细胞的黏附和增殖；而纳米结构可通过调控细胞内信号分子通路，影响细胞行为。有研究发现，材料表面粗糙度越大越利于细胞黏附生长[20-21]。微纳米结构可增加材料表面的粗糙度，提高材料的亲水性，从而促进细胞的黏附、增殖和成骨分化。
支架材料的孔径、孔隙率及多孔结构形状均对脂肪间充质干细胞的成骨分化效果有不同的影响[22]。近期研究发现，支架基底部形成直径在20-70 nm的纳米管结构最利于细胞黏附，能显著增加碱性磷酸酶活性和成骨相关基因的表达[23-25]。LV等[26]采用阳极氧化工艺制备二氧化钛纳米管，发现纳米管直径在70 nm时可以抑制视黄醇结合蛋白2的表达，使成骨相关基因区域H3K4的甲基化水平提高，从而促进成骨。课题设计的改性3D打印钛支架表面有大量互相连通的孔隙，孔隙大小为70-100 nm，孔隙率高达70%-80%。改性3D打印钛支架的多孔结构为细胞长入支架提供了良好的框架结构，扩大了细胞与支架的接触面积，从而为细胞的黏附、增殖提供了足够的空间；相互通连的孔隙结构为血管性组织的长入提供了空间，利于营养物质的运输及代谢废物的排出。
细胞的生物学行为受支架材料结构的影响，其中细胞的黏附和增殖情况是评估支架对细胞生物学行为影响的主要指标。早期骨整合是种植成功的关键因素[27]，而骨整合的成功有赖于骨形成细胞与支架表面产生稳定的黏附。细胞黏附是细胞与支架表面反应的第一步，同时也是早期骨整合的始动因素，因此提高支架表面细胞的黏附活性是优化组织工程骨支架材料的首要目标[28]。细胞骨架实验结果发现，细胞在喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架表面黏附形态好，呈多边形，铺展最充分，有丰富的伪足和触角。由此可见，喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架的多孔结构为细胞黏附提供了广泛的接触面积。细胞在支架表面的早期黏附是良好生长的基础，CCK-8结果显示喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架能够显著促进细胞的增殖，提示喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架为脂肪间充质干细胞的生长提供了充足的空间。多孔结构的存在提高了喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架的比表面积，进而促使更多的细胞在支架表面黏附。研究结果同样表明，细胞黏附和活性与支架材料的比表面积之间具有很强的相关性[29-30]。
骨组织工程支架除了具有良好的生物相容性，还需具备较好的骨诱导和骨结合能力。碱性磷酸酶是成骨细胞早期分化、细胞外基质成熟的重要标志物，它在体外钙化过程中起关键作用，其活性随细胞成骨分化能力的增强而提高[31-32]。喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架表面脂肪间充质干细胞的碱性磷酸酶活性显著增强。骨钙素、Ⅰ型胶原、RUNX2、骨桥蛋白是成骨细胞合成并分泌的细胞外基质。骨钙素可调节细胞外基质蛋白的形成及骨组织的矿化过程[33]，是成骨细胞向基质矿化的标志[34-35]。Ⅰ型胶原是细胞黏附和钙盐沉积的支架[36-38]。RUNX2作为一种正性调节因子是细胞成骨分化早期的调控基因，可通过上调骨基质蛋白的表达来促进脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化，敲除RUNX2基因可抑制成骨细胞的发育[39-42]。RUNX2基因的表达标志着细胞成骨分化的开始。骨桥蛋白同样是成骨细胞转向矿化期分化的重要标志性蛋白。RT-PCR检测结果显示，喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架能上调成骨基骨钙素、RUNX2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原mRNA的表达水平。免疫荧光结果进一步提示，喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架可增强骨钙素和骨桥蛋白的蛋白表达。以上结果提示，喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架可诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞分化。
血管化是组织工程骨修复骨缺损的基础，组织工程骨植入体内后，如果周围血管长入的速度过慢或达不到内层会导致血液循环障碍，使植入体因营养不足而成骨效果不稳定[43-44]。血管新生对骨的再生和修复至关重要，可为其提供良好的营养支持、促进新陈代谢，为后期新骨的形成创造条件[45]。SOJO等[46]应用牵张成骨模型发现血管再生发生在成骨之前，新生血管保证了成骨前体细胞能稳定运送到骨重建部位，成骨是一个血管依赖的过程。组织工程骨能否实现血管化将直接影响骨缺损治疗的成败。但此次实验对于喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架是否能刺激脂肪间充质干细胞成血管分化的研究并未完全展开，后期将在研究中进一步充实。
综上所述，喷砂酸蚀联合阳极氧化改性3D打印钛支架具有良好的生物相容性，可促进人脂肪间充质干细胞的增殖、黏附和成骨分化过程，在再生组织工程学中有极大的应用价值。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

改性3D打印钛支架对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

Effect of modified three-dimensional-printed titanium scaffold on osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells

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