电针改善脊髓损伤大鼠逼尿肌的形态结构和膀胱功能

doi:10.12307/2024.461

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (28): 4484-4490.doi: 10.12307/2024.461

• 组织构建实验造模 experimental modeling in tissue construction • 上一篇下一篇

电针改善脊髓损伤大鼠逼尿肌的形态结构和膀胱功能

焦子远，卓越，梁柔筠，丁强盛，曾学究，许明，张泓

湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南省长沙市 410208

收稿日期:2023-07-12 接受日期:2023-08-26 出版日期:2024-10-08 发布日期:2023-11-27
通讯作者: 张泓，教授，博士生导师，湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南省长沙市 410208 许明，讲师，湖南中医药大学针灸推拿与康复学院，湖南省长沙市 410208
作者简介:焦子远，女，1998年生，安徽省芜湖市人，汉族，硕士，主要从事常见疾病针灸、康复治疗的机制与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(82274666)，项目负责人：张泓；国家自然科学基金项目(82205255)，项目负责人：许明；湖南中医药大学学科建设揭榜挂帅项目(22JBZ013)，项目负责人：张泓；湖南中医药大学中西医结合一流学科重点项目(2021ZXYJH15)，项目负责人：张泓

Electroacupuncture improves morphological structure of the detrusor muscle and bladder function in rats with spinal cord injury

Jiao Ziyuan, Zhuo Yue, Liang Roujun, Ding Qiangsheng, Zeng Xuejiu, Xu Ming, Zhang Hong

1School of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China

Received:2023-07-12 Accepted:2023-08-26 Online:2024-10-08 Published:2023-11-27
Contact: Zhang Hong, Professor, Doctoral Supervisor, School of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China Xu Ming, Lecturer, School of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
About author:Jiao Ziyuan, Master, School of Acupuncture, Massage and Rehabilitation, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82274666 (to ZH); National Natural Science Foundation of China, No. 82205255 (to XM); Hunan University of Chinese Medicine Discipline Construction Project, No. 22JBZ013 (to ZH); Integrated Traditional Chinese and Western Medicine First-Class Discipline Key Project of Hunan University of Chinese Medicine, No. 2021ZXYJH15 (to ZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

神经源性膀胱：因神经系统病变引起的膀胱和尿道功能障碍，进而产生一系列下尿路症状的疾病总称，是脊髓损伤后严重的合并症，临床上晚期脊髓损伤患者常因神经源性膀胱引起的肾衰竭而死亡。因此，脊髓损伤后神经源性膀胱的研究成为近年来研究的热点与难点。
结缔组织生长因子：首先由BRADHAM等于1991年在人脐静脉内皮细胞条件培养基中探索而获得的，为分子质量34-38 kD的富含半胱氨酸的分泌肽，与肝脏、肾脏、心脏及肺等在内的许多组织器官纤维化发生发展密切相关，其中也包括参与膀胱纤维化重塑过程。

背景：大量临床和基础研究表明，电针能够改善骶上脊髓损伤后神经源性膀胱的功能。

目的：观察电针对骶上脊髓损伤大鼠膀胱功能及结缔组织生长因子表达的影响。
方法：将48只雌性SD大鼠随机分为4组，每组12只：空白组不做任何处理；假手术组仅暴露T8椎体下脊髓；模型组建立T8椎体下脊髓横断损伤模型；电针组建立T8椎体下脊髓横断损伤模型后第19天给予电针干预，选择“次髎”“中极”“三阴交”三穴，20 min/次，1次/d，连续干预10 d。干预结束后，进行相关指标检测。

结果与结论：①尿流动力学检测：与空白组比较，模型组大鼠漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力均升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组大鼠漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力均下降(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色：与空白组比较，模型组大鼠膀胱上皮细胞排列紊乱，固有膜被破坏，逼尿肌肌束肥大，肌纤维排列紊乱，组织水肿明显；与模型组比较，电针组大鼠膀胱上皮细胞排列相对规则有序，膀胱纤维化及组织水肿程度相对减轻；③Masson染色：模型组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度较重，电针组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度轻于模型组；④透射电镜观察：模型组大鼠膀胱逼尿肌线粒体肿胀、发生空泡化，逼尿肌形态发生扭曲变形，肌间隙增宽；与模型组比较，电针组大鼠膀胱逼尿肌线粒体轮廓略清晰可见，线粒体发生空泡化减少，肌间隙缩小；⑤Western blot检测：与空白组比较，模型组大鼠膀胱逼尿肌结缔组织生长因子的蛋白表达升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组大鼠膀胱逼尿肌结缔组织生长因子的蛋白表达降低(P < 0.05)；⑥结果表明：电针“次髎”“中极”“三阴交”穴可改善骶上脊髓损伤大鼠膀胱的形态结构和功能，其作用机制可能与下调逼尿肌组织结缔组织生长因子蛋白的表达相关。

https://orcid.org/0009-0008-9140-6132(焦子远)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 电针, 骶上脊髓损伤, 神经源性膀胱, 膀胱功能, 结缔组织生长因子, 逼尿肌

Abstract: BACKGROUND: Numerous clinical and basic studies have shown that electroacupuncture can improve the function of neurogenic bladder after suprasacral spinal cord injury.
OBJECTIVE: To observe the effects of electroacupuncture on bladder function and connective tissue growth factor expression in rats with suprasacral spinal cord injury.
METHODS: Forty-eight female Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=12 per group): the blank group did not receive any treatment; the sham-operated group only exposed the T8 subvertebral spinal cord; in the model group established, a T8 subvertebral spinal cord transection injury model was established; in the electroacupuncture group, the T8 subvertebral spinal cord transection injury model was established, and electroacupuncture intervention at Ciliao (BL32), Zhongji (RN03) and Sanyinjiao (SP06) was given at 19 days after modeling, 20 minutes once a day, for 10 continuous days. After the intervention, the relevant indicators were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Urodynamics: Compared with the blank group, the leakage point pressure, maximum bladder capacity and maximum bladder pressure of rats in the model group increased (P < 0.05). Compared with the model group, the leakage point pressure, maximum bladder capacity and maximum bladder pressure of rats in the electroacupuncture group decreased (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining: Compared with the blank group, the bladder epithelial cells in the model group were arranged in a disordered manner, the lamina propria was destroyed, the detrusor muscle bundles were hypertrophied, the muscle fibers were arranged in a disordered manner, and the tissue edema was obvious. Compared with the model group, the bladder epithelial cells in the electroacupuncture group were arranged in a regular and orderly manner, and the degree of bladder fibrosis and tissue edema was relatively reduced. Masson staining: The degree of bladder detrusor muscle fibrosis was severe in the model group and it was lighter in the electroacupuncture group than in the model group. Transmission electron microscopy: Mitochondria in the bladder tissue in the model group were swollen and vacuolated, the morphology of the detrusor muscle was twisted and distorted, and the muscle gap was widened. Compared with the model group, mitochondria in the electroacupuncture group had a slightly clearer contour and were less vacuolated, and the muscle gap was narrowed. Western blot detection: The protein expression of connective tissue growth factor in the detrusor muscle of the bladder was elevated in the model group compared with the blank group (P < 0.05). Compared with the model group, the protein expression of connective tissue growth factor in the bladder detrusor muscle was decreased in the electroacupuncture group (P < 0.05). To conclude, electroacupuncture at Ciliao (BL32), Zhongji (RN03) and Sanyinjiao (SP06) acupoints can improve the morphology, structure and function of the bladder in rats with suprasacral spinal cord injury, and the mechanism of action may be related to the down-regulation of connective tissue growth factor protein expression in the detrusor muscle.

Key words: electroacupuncture, suprasacral spinal cord injury, neurogenic bladder, bladder function, connective tissue growth factor, detrusor muscle

中图分类号:

焦子远, 卓越, 梁柔筠, 丁强盛, 曾学究, 许明, 张泓. 电针改善脊髓损伤大鼠逼尿肌的形态结构和膀胱功能[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(28): 4484-4490.

Jiao Ziyuan, Zhuo Yue, Liang Roujun, Ding Qiangsheng, Zeng Xuejiu, Xu Ming, Zhang Hong. Electroacupuncture improves morphological structure of the detrusor muscle and bladder function in rats with spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(28): 4484-4490.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析整个实验过程中，造模大鼠因腹胀、感染及死亡等原因排除12只，剩余24只大鼠全部进入结果分析。空白组与假手术组总共24只大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组大鼠一般情况观察空白组和假手术组大鼠活动灵活自如，爬行正常；模型组和电针组大鼠双下肢拖曳不能行走，需每日进行手法排尿，模型组大鼠膀胱以尿潴留症状为主要表现，电针组大鼠膀胱尿量较模型组下降，膀胱肿胀情况有所减轻。
2.3 各组大鼠尿流动力学结果的比较与空白组及假手术组比较，模型组大鼠漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力显著增加(P < 0.05)；与模型组比较，电针组大鼠漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力均下降(P < 0.05)，见表2。

2.4 各组大鼠膀胱组织病理形态学改变苏木精-伊红染色显示，空白组和假手术组膀胱上皮细胞排列整齐，固有膜完整，逼尿肌肌纤维排列有序且层次清晰，胞浆均匀、胞核清晰；模型组大鼠膀胱上皮细胞结构排列紊乱，固有膜被破坏，逼尿肌肌束肥大，肌纤维排列紊乱，组织水肿明显；与模型组比较，电针组大鼠膀胱上皮细胞排列相对规则有序，肌纤维排列相对完整，组织水肿相对减轻，见图2。

2.5 各组大鼠膀胱逼尿肌纤维化情况 Masson染色显示，空白组与假手术组大鼠膀胱逼尿肌排列规整，肌束间含有少量的胶原纤维；与空白组和假手术组比较，模型组大鼠逼尿肌排列紊乱，肌束间的间隙被胶原纤维填满；与模型组比较，电针组肌束间的间隙胶原纤维相对减少，见图3。

空白组、假手术组、模型组、电针组大鼠膀胱组织中胶原纤维面积的比值分别为(20.78±0.80)%，(20.79±0.54)%，(31.33±1.35)%，(23.69±0.78)%。与空白组和假手术组比较，模型组胶原纤维面积的比值升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组胶原纤维面积的比值降低(P < 0.05)，见图4。

2.6 各组大鼠膀胱逼尿肌超微结构改变透射电镜下可见，空白组与假手术组大鼠膀胱逼尿肌中线粒体轮廓形态规则整齐，肌束排列有序；与空白组和假手术组比较，模型组大鼠膀胱逼尿肌线粒体肿胀、发生空泡化，逼尿肌形态发生扭曲变形，肌间隙增宽；与模型组比较，电针组大鼠膀胱逼尿肌线粒体轮廓略清晰可见，线粒体空泡化减少，肌间隙缩小，见图5。

2.7 各组大鼠膀胱逼尿肌结缔组织生长子的蛋白表达 Western blot检测显示，与空白组和假手术组比较，模型组大鼠膀胱逼尿肌内结缔组织生长因子的蛋白表达升高(P < 0.05)；与模型组比较，电针组大鼠膀胱逼尿肌内结缔组织生长因子的蛋白表达降低(P < 0.05)，见图6。

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引言

脊髓损伤是指因脊髓遭受损害造成暂时或永久性功能障碍，包括出现各种运动、感觉、心理障碍等，从而严重影响患者的生活质量[1-2]。神经源性膀胱作为脊髓损伤后严重的合并症可引起膀胱和尿道功能障碍，是临床研究的难点与热点课题[3-5]。据相关调查表明，因交通事故和枪击伤害等，预计全球人口中创伤性脊髓损伤的总发病率为每百万人27.5例[6]。脊髓损伤后神经源性膀胱典型的病理改变是平滑肌和成纤维细胞大量增殖，逼尿肌肌束内和肌束间过多的胶原纤维沉积，造成膀胱组织纤维化，从而造成膀胱内压升高等，是出现膀胱功能障碍的重要原因[7-8]。有研究表明，膀胱功能受损时纤维化相关因子表达上调，肌束变形，胶原沉积增加，线粒体发生肿胀并缺失完整的结构[9]。因此，减轻骶上脊髓损伤后膀胱逼尿肌的纤维化程度进而改善膀胱功能是研究的重要课题。结缔组织生长因子是纤维化过程中的重要调节因子，与肝脏、肾脏、心脏及肺等在内的许多组织器官纤维化发生发展密切相关。结缔组织生长因子也参与膀胱重塑过程，可作用于多种不同的细胞类型以增加细胞外基质的产生，从而促进膀胱纤维化[10-12]。
对于脊髓损伤后神经源性膀胱患者，不同国家和地区的首选治疗方式有所差异，一般优选清洁间歇导尿或留置导尿[13-14]，此外，还有Crede和Valsalva手法排尿、药物干预、手术治疗、中医综合康复等多种治疗方式[15-16]。在众多治疗方法中，电针治疗脊髓损伤后神经源性膀胱因具有创伤小、操作方便、成本低、疗效确切等优势，成为近年来研究的热点。已有大量临床和基础研究表明，电针能够改善骶上脊髓损伤后神经源性膀胱的功能[17-20]。课题组前期研究也证实，电针骶上脊髓损伤后大鼠“次髎”“中极”“三阴交”穴能够修复膀胱组织，一定程度上改善膀胱功能[17，21-22]。因此，此次实验通过建立T8椎体下完全性骶上脊髓损伤模型，观察电针“次髎”“中极”“三阴交”对骶上脊髓损伤后大鼠膀胱功能及结缔组织生长因子蛋白表达水平的影响，初步研究电针治疗骶上脊髓损伤后神经源性膀胱可能的修复机制，也为临床治疗此类患者提供理论参考与借鉴。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2022年12月在湖南中医药大学实验动物中心及科研楼完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康SD雌性大鼠60只(根据前期预实验中约72%的成模率计算得出)，SPF级，鼠龄10-12周，体质量220-250 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。所有动物分笼饲养于湖南中医药大学动物实验中心，饲养温度24-26 ℃，湿度50%-70%，适应性喂养1周后进行实验。实验过程严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》，并经湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理编号为LL2021091504。
1.3.2 主要试剂苏木精-伊红染液套装(货号G1003，Servicebio)；Masson 染液套装(货号G1006，Servicebio)；2.5%戊二醛电镜固定液(货号AWI0092a，Abiowell)；ECL高效化学发光试剂盒(货号GE2301-100ML，Abiowell)；结缔组织生长因子兔多克隆抗体(货号25474-1-AP，Proteintech)；山羊抗兔IgG抗体(H+L)/HRP(货号AWS0002a，Abiowell)；GAPDH小鼠单克隆抗体(货号60004-1-Ig-20ul，Proteintech)；TRITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)/HRP(货号AWS0001a，Abiowell)。
1.3.3 主要仪器多通道生理记录仪(型号MP150，美国BIOPAC)；微量注射泵(型号WZ-50C6，浙江史密斯医学仪器有限公司)；包埋机(型号JB-P5，武汉俊杰电子有限公司)；病理切片机(型号RM2016，上海徕卡仪器有限公司)；烤箱(型号GFL-230，天津市莱玻瑞仪器设备有限公司)；正置光学显微镜(型号Nikon Eclipse E100，日本尼康)；透射电子显微镜(型号HT7800，hitachi)；华佗牌电针治疗仪(型号SDZ-V型，苏州医疗用品厂有限公司)；化学发光成像系统(型号ChemiDoc XRS，伯乐)。
1.4 实验方法
1.4.1 建立骶上横断脊髓损伤模型将60只大鼠按照随机数字表法分为空白组(n=12)和假手术组(n=12)，剩余36只进行手术造模。空白组大鼠不做任何处理。
建立骶上脊髓横断损伤模型：取剩余的36只SD大鼠，采用改良Hassan Shaker脊髓完全性横断法结合前期研究基础进行造模，造模椎体间隙为T8-9(约对应脊髓横断为T10节段)[17，22-25]。①术前准备：36只造模大鼠术前1 d禁食不禁水。②麻醉备皮：腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠，待其完全麻醉后进行消毒、备皮、铺无菌单。③分离筋膜肌肉：以明显宽大凸起的大鼠T10棘突为骨性突出标志，再向上定位2个椎体即为T8。于大鼠背部正中T8-9脊柱椎体间隙处做3 cm纵向切口，钝性分离筋膜和椎旁肌至显露棘突和椎板。④暴露脊髓：用咬骨钳咬断T8棘突和椎弓根，使脊髓完整显露出来。⑤完全性横断脊髓：用眼科剪整齐迅速地横断脊髓，确保无神经纤维残留。⑥逐一缝合肌肉筋膜层和外层皮肤。假手术组切开肌层，暴露相应棘突和椎板后缝合。⑦复温：造模后大鼠呈俯卧位、四肢摊开放在电热毯上复温，待大鼠苏醒后转移到笼内。⑧术后管理：术后皮下注射乳酸钠林格注射液(20 mL/kg)防止电解质紊乱，腹腔注射青霉素钠(20×104 U/只)以抗感染，进行手法排尿(图1A)及排便等相应护理措施。术后至实验结束期间，大鼠若出现自残双下肢及尾根部、恢复自主排尿、反复性血尿等不良情况予以剔除。

后肢运动功能评估：术后每日由同一人采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)评分进行评估，在脊髓休克期内，大鼠后肢运动功能为完全性丧失状态，BBB评分应为0分，表现为大鼠双下肢呈拖曳状态(图1B)，不能行走；反之，说明脊髓横断不彻底，予以剔除。

膀胱排尿功能评估：在脊髓休克期内，大鼠膀胱处于尿潴留状态，膀胱涨大明显，出现排尿障碍，需要每日手法辅助排尿；脊髓休克期结束后表现为大鼠尿道口周围和笼内垫料偶见潮湿现象，膀胱胀大情况较休克期有所减轻，但仍需每日手法排尿，以尿潴留为主要症状，为此次实验模型的纳入对象。

1.4.2 电针干预方法脊髓损伤后损伤平面越高造成的伤害相对越大，脊髓休克期时间相对越长，休克期内模型差异较大，各项体征不稳定。通过前期研究发现，在脊髓损伤后1周渡过休克期[23]，而模型在术后第18天趋于稳定，故选择经模型评估成功的大鼠在第19天进行电针治疗。

参照“十三五”国家规划统编教材《实验针灸学》中大鼠标准穴位图谱定位，并模拟人体腧穴骨度分寸法量取，各腧穴定位如表1所示。

造模后第19天，电针组大鼠给予电针干预。用30号1寸针，采用双手进针法进行次髎直刺10-15 mm、中极斜刺5 mm、三阴交直刺5 mm，中极与一侧三阴交接为一组(三阴交左右两侧交替进行)，背部两侧次髎穴接为一组。电针选用疏密波(疏波f=10 Hz，密波f=50 Hz)，电流约为0.1 mA，当大鼠双下肢出现轻微颤动时提示为适宜强度，根据每只大鼠的耐受程度调整。治疗频次和时间为20 min/次，1次/d，连续治疗10 d。假手术组和模型组大鼠仅捆绑，但不进行电针干预。
1.4.3 组织取材及处理电针治疗结束后第2天，进行尿动力学检测，然后麻醉状态下取大鼠膀胱组织，部分采用40 g/L多聚甲醛固定2 d，分别用于苏木精-伊红染色和Masson染色；部分冰上取膀胱组织薄块(长和宽约为2 mm×2 mm)，放入2.5%戊二醛电镜液中室温静止固定2 h，透射电镜下观察逼尿肌超微结构；部分取膀胱逼尿肌进行Western blot检测。
一般情况观察：观察空白组和假手术组大鼠的日常活动、反应灵活性、爬行等；记录模型组和电针组大鼠的尿量、尿液颜色、排便数量及质地、进食、饮水、腹胀、自残等情况。
大鼠尿流动力学检测：手法排尿后将大鼠呈仰卧位四肢固定在鼠板上，剔除大鼠下腹部的毛发并消毒，麻醉后打开腹腔并小心暴露膀胱；将多通道生理记录仪、微量注射泵及F3导管通过三通管连接，用眼科剪小心剪开膀胱顶部的一小口，再将F3导管穿膀胱小开口导至大鼠膀胱内，并用手术缝合线捆绑膀胱开口与导管交接处，仪器调零校准后以0.1 mL/min速率注入室温生理盐水[26]，电脑软件记录并计算膀胱漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力各项指标。
大鼠膀胱苏木精-伊红染色：观察膀胱组织病理形态学改变。取膀胱组织制作石蜡切片，置于二甲苯中浸泡脱蜡，在梯度浓度无水乙醇中进行洗蜡。经苏木精染液染3-5 min，返蓝液返蓝，伊红染色5 min，然后依次放入梯度无水乙醇和二甲苯中脱水透明，最后使用中性树胶封固，置于光镜下观察。
大鼠膀胱Masson染色：膀胱组织经包埋、切片后，加以染色并脱水，最后中性树胶封固后在光镜下观察。采用Image Pro Plus 6.0软件分析大鼠膀胱组织中胶原纤维面积/(胶原纤维面积+逼尿肌的面积)比值。每张切片随机选取10个视野后取平均值，作为该组织胶原纤维面积的比值，即膀胱纤维化程度。
大鼠膀胱逼尿肌超微结构：将膀胱组织放入2.5%戊二醛电镜液中加以固定，依次经室温脱水、包埋、超薄切片、染色后，最后在透射电子显微镜下观察逼尿肌中线粒体、细胞间隙和胶原纤维等结构，采集图像分析。
Western blot检测：检测结缔组织生长因子的蛋白表达。根据RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂说明书提取逼尿肌组织总蛋白；配制BCA工作液打入96孔板，放入37 ℃干燥箱孵育30 min；随后放入酶标仪中测量蛋白浓度，-20 ℃保存以备上样。制胶后，用10%的SDS-PAGE分离电泳，电泳设置参数电压为80 V，待marker分开后增至120 V，当溴酚蓝至分离胶胶底时结束电泳；随后进行转膜，电流为200 mA，时间为90 min；采用脱脂奶粉常温封闭90 min；以TBST洗涤3次，每次5 min；加入结缔组织生长因子(1∶2 000稀释)一抗，4 ℃下孵育过夜；以TBST洗涤3次，每次10 min；加入Goat anti-Rabbit IgG 抗体(1∶10 000稀释)二抗，常温孵育2 h；以TBST洗涤3次，每次10 min；ECL曝光显影。用Image Lab软件分析GAPDH内参和结缔组织生长因子蛋白的灰度值，计算出结缔组织生长因子蛋白的相对表达量。
1.5 主要观察指标电针干预结束后，观察各组大鼠膀胱功能、膀胱组织病理形态学改变及逼尿肌纤维化情况、超微结构、结缔组织生长因子蛋白的表达。
1.6 统计学分析所有实验数据用x±s表示，采用SPSS 23.0软件分析数据。计量资料若符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析，方差齐时则采用LSD法进行两两比较；方差不齐时采用塔姆黑尼检验；不符合正态分布时采用秩和检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经湖南中医药大学张泓专家审核。

讨论

中医学认为骶上脊髓损伤致以尿潴留为主要症状的神经源性膀胱属于“癃闭”的范畴，气滞血淤、肾气亏损、督脉受损是该病的主要病因。“次髎”穴归属足太阳膀胱经，具有调节膀胱功能和水液代谢的作用[27]；“中极”为膀胱之募穴，是血气交会之处，具有补肾、调和气血功能、通调膀胱的作用[28]；“三阴交”为足三阴经交会穴，调控膀胱水液运行，具有温肾健脾、调节下焦的作用[29]。临床上治疗脊髓损伤后神经源性膀胱功能障碍多选用八髎穴、中极、三阴交、关元穴等穴[30-32]。此次实验所选取的“次髎”穴属于八髎穴之一，从神经解剖的角度来说，电针刺激该穴可直接刺激骶神经根传出的神经，诱发膀胱有节律地舒缩运动，有利于排尿反射的形成；此外，“次髎”穴的治疗效果优于“关元”穴，可明显改善膀胱顺应性[33-34]。“中极”穴为近部取穴，“三阴交”穴为远部取穴，近部取穴和远部取穴常配合使用，两者为一组电针选穴，相结合的疗效优于单纯的近部取穴或远部取穴[35]。临床上大多数完全性脊髓损伤实际是亚临床不完全性损伤，损伤水平的上、下节段保留着信号通信，1/3以上的完全性脊髓损伤患者存在大脑皮质至膀胱的神经通路，例如膀胱感觉可能通过胃下神经保留，电针可通过激活现有的神经诱导逼尿肌收缩以达到膀胱平衡[36-37]。电针在针刺的基础上予以电效应，通过电刺激膀胱及其支配的神经纤维和中枢诱发逼尿肌和括约肌二者之间产生节律性的舒张和收缩，发挥抑制、兴奋膀胱的双向调节作用，从而改善脊髓损伤后膀胱功能障碍[38-39]。故此次研究选择电针“次髎”“中极”“三阴交”三穴为干预位置，发现电针组大鼠膀胱的漏尿点压、膀胱最大容量及膀胱最大压力均降低，改善了大鼠尿潴留状态，提高了大鼠膀胱排尿效率。
正常的排尿过程依赖于膀胱逼尿肌和内外括约肌之间的相互协调作用，膀胱逼尿肌和膀胱内括约肌受交感神经和副交感神经的支配，当膀胱平滑肌某一部位发生动作电位时会将兴奋传至逼尿肌引起其收缩，此时膀胱内括约肌保持松弛，进而完成排尿；而膀胱外括约肌受阴部神经支配，由横纹肌构成，可受主观意识控制，因此相关基础实验有关膀胱外括约肌的研究并不多。T8椎体下(约对应T10脊髓节段)的骶上脊髓损伤导致高位大脑皮质排尿中枢对骶髓低位排尿中枢的抑制遭到破坏，逼尿肌发生无抑制性收缩，打破膀胱逼尿肌与括约肌之间的协调关系，进而出现以尿潴留症状为主的神经源性膀胱。有研究表明，膀胱的主要核心肌肉是逼尿肌，膀胱功能与逼尿肌的功能状态密切相关[40]。
尿流动力学是检测脊髓损伤后神经源性膀胱的金标准。此次实验尿流动力学检测结果发现，模型大鼠T8椎体下脊髓完全性横断会造成膀胱漏尿点压、膀胱最大容量、膀胱最大压力均增加，这与卓越等[19]的研究结果相一致。苏木精-伊红染色提示模型大鼠膀胱发生病理性改变，膀胱功能受损。结合此次实验最终结果，模型组大鼠膀胱逼尿肌发生纤维化，猜测模型大鼠膀胱逼尿肌由于过度收缩亢进、长期的尿潴留和膀胱内高压状态，造成了逼尿肌代偿性肥厚，膀胱内细菌增殖诱发感染，这可能是膀胱逼尿肌纤维化的重要原因之一。
此次实验Masson染色结果显示，与空白组和假手术组相比，模型组大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度明显，逼尿肌肌束肥大，肌纤维排列紊乱，导致膀胱形态结构发生改变。马源[41]研究发现从脊髓损伤后第3周开始，大鼠膀胱壁纤维结缔组织已出现紊乱，肌间胶原纤维逐渐增多。脊髓损伤后膀胱壁增厚、胶原沉积增加，发生组织纤维化是膀胱发生病理性反射的重要原因之一[42]，因此，及时有效控制纤维化发展进程、抑制胶原纤维沉积是保护脊髓损伤后膀胱功能的重要举措。在膀胱纤维化发展过程中，膀胱超微结构发生一系列改变，有研究表明，膀胱壁增厚和纤维化后电镜下可见平滑肌破坏、线粒体肿胀[43]，这与此次实验透射电镜观察结果一致。
此次实验Western blot法检测结果显示，与空白组和假手术组相比，模型组大鼠膀胱逼尿肌内结缔组织生长因子的蛋白表达上升，而电针干预抑制了结缔组织生长因子的蛋白表达。在膀胱纤维化过程的机制中，结缔组织生长因子起着重要作用，参与膀胱早期纤维化。结缔组织生长因子作为胶原蛋白代谢的主要调节因子介导和分泌胶原表达，膀胱内高压和膀胱失神经支配促使膀胱内结缔组织生长因子合成增加，促进细胞外胶原蛋白的生成和沉积，重塑膀胱结构，进而发生膀胱纤维化，进一步影响膀胱功能[44-46]。因此，改善脊髓损伤后神经源性膀胱的功能状态、延缓膀胱组织纤维化的进程，结缔组织生长因子是重要调节因子之一。宋晨等[47]
的研究表明，电针能够抑制脊髓损伤后大鼠膀胱逼尿肌纤维化程度，促进膀胱功能的恢复。此次研究也证明了电针治疗骶上脊髓损伤后神经源性膀胱与结缔组织生长因子密切相关，通过减轻膀胱逼尿肌纤维化程度来有效保护膀胱功能、改善膀胱逼尿肌的形态结构。
综上所述，此次实验采用尿流动力学和组织形态学方法观察了骶上脊髓损伤后大鼠膀胱功能及结构变化，初步证实了电针能够减轻骶上脊髓损伤大鼠膀胱逼尿肌的纤维化、有效改善膀胱功能，其作用机制可能与下调结缔组织生长因子的蛋白表达相关。同时，实验也为临床针灸治疗神经源性膀胱患者提供了理论参考，为进一步研究该方向的理论机制奠定基础，具体为：采用电针治疗骶上脊髓损伤后以尿潴留为主要症状的患者，有利于提高膀胱排尿效率、缩短导尿及排尿次数、有效缓解患者出现的尿潴留程度。目前结缔组织生长因子在肝、肺、肾、心肌等组织器官纤维化中作用的研究较为深入，但其在膀胱逼尿肌组织的研究有待进一步探索。实验仅阐述了电针对结缔组织生长因子表达的影响以及逼尿肌形态与膀胱功能的改善作用，其上下游的调控机制仍待进一步完善。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

电针改善脊髓损伤大鼠逼尿肌的形态结构和膀胱功能

Electroacupuncture improves morphological structure of the detrusor muscle and bladder function in rats with spinal cord injury

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